抗KLK5抗体的制作方法

抗klk5抗体
发明领域
1.本发明涉及结合和抑制klk5的抗体以及使用该抗体治疗由klk5失调引起的疾病的方法。具体而言，本发明涉及抗klk5抗体及其在治疗netherton病、鱼鳞病如先天性鱼鳞病、特应性皮炎和癌症中的用途。


背景技术：

2.激肽释放酶相关肽酶(称为klks)构成一个由15种高度保守的胰蛋白酶或糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶组成的家族，它们在人类基因组中由蛋白酶编码基因(染色体19q13.4)的最大的不间断簇编码(sotiropoulou g.et al.,2009；jbc 284:48,32989-94)。
3.klk蛋白被合成为无活性的前原形式，它们经过蛋白水解加工以分泌无活性的原型(pro-form)。随后通过其他klk或肽链内切酶或通过自身催化切割(例如klk5)特异性蛋白水解去除它们的n-末端前肽，这些原型被活化成成熟肽酶。klk5具有胰蛋白酶样活性。在其前原形式中，它含有29个氨基酸的信号肽，然后是37个氨基酸的激活肽。活性成熟形式由含有成熟酶的237个氨基酸组成，该成熟酶包括负责蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶结构域(michael i.p et al.,2005；jbc 280:15,14628-35)。
4.虽然klk5在许多组织中有发现，但它似乎在皮肤中表达最多。与klk7一起，klk5与klk7一起在皮肤的上棘层和颗粒层中表达，其中角质形成细胞经历终末分化并转化为构建角质层的角质细胞。角质层充当外部环境的屏障，并通过不断更换因脱屑过程脱落的角质细胞而得以维持。因为klk5能够激活klk7原型和其他激肽释放酶，所以它在脱屑中的作用是必不可少的。
5.激活后，成熟的klk5被spink5基因编码的内源性抑制剂
‑‑
淋巴上皮kazal型抑制剂(lekti)失活(chavans p et al.,2005；nat genet 37,56-65)。lekti含有15个结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，与klk5形成紧密复合物。ph值的变化控制这种紧密相互作用，其中酸性ph值从复合物中释放活性klk5(deraison c等人2007；mol biol cell 18 3607-19)。
6.spink5基因的功能丧失突变导致netherton综合征，这是一种罕见的常染色体隐性遗传皮肤病，其特征是鱼鳞病，具有严重的炎症、皮肤脱屑、ige水平升高和持续的过敏表现(hovnanian a.2013；cell tissue res 351 289-300)。继发于表皮蛋白酶过度活跃，缺乏lekti会导致在桥粒芯蛋白和桥粒上的由klk5活性引起的角质层脱离，这反过来有利于对各种过敏原的高渗透性，从而导致特应性皮炎样病变。klk5对klk7的活性也导致有缺陷的皮肤屏障，引起过敏原和微生物渗透以及il-1β的产生。
7.spink5-/-小鼠再现了一种高度让人联想到netherton综合征的表型，复制了该疾病的皮肤和炎症方面(yant t等人；2004，genes dev 18 2354-58)。来自netherton综合征患者的spink5-/-表皮显示出无对抗的klk5和klk7蛋白酶活性，这似乎维持了促炎和促信号传导通路的激活，包括klk5-par2-tslp(胸腺基质淋巴细胞生成素)轴。在spink5-/-和klk5-/-小鼠中，klk5敲除足以纠正这种lekti敲除的皮肤表现，说明了klk5在皮肤稳态中的
关键作用。
8.近年来，一些研究报告了特应性皮炎(ad)和表达lekti的异常变体的lekti多态性之间的遗传关联(hovnanian a.2013；cell tissue res 351 289-300)。
9.迄今为止，尽管klk7抑制剂处于临床开发阶段，但还没有klk5特异性疗法。已经在研究旨在替代lekti的其他方法，包括通过spink5慢病毒或腺病毒载体的基因添加和遗传校正的患者角质形成细胞的自体移植物(di wl.等人；2011，mol ther 19 408-16)。
10.因此，仍然需要抗klk5疗法，例如旨在抑制klk5的被动免疫疗法，其可以在与klk5失调相关或由其引起的疾病中发挥治疗作用。


技术实现要素：

11.本发明通过提供根据以下实施方式的抑制性抗klk5抗体来解决上述需求。
12.实施方式1.一种结合激肽释放酶5(klk5)的单克隆抗体，其中所述抗体含有可变轻链和可变重链，并且其中：
13.a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
14.b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选seq id no:10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3。
15.实施方式2.根据实施方式1所述的抗体，其中
16.a.所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
17.b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:10或14或23的cdr-h3。
18.实施方式3.根据实施方式1或2所述的抗体，其中
19.a.所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
20.b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3。
21.实施方式4.根据前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
22.实施方式5.根据前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
23.实施方式6.根据实施方式5所述的抗体，其中所述全长抗体选自igg1、igg4或igg4p。
24.实施方式7.根据实施方式1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自fab、fab'、f(ab')2、scfv、dab或v
hh
。
25.实施方式8.根据实施方式1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
26.a.含有seq id no:30或34或38或42或46的可变轻链；和/或
27.b.含有seq id no：32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或
70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134的可变重链。
28.实施方式9.根据实施方式1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
29.a.含有seq id no:38的可变轻链；和/或
30.b.含有seq id no:110的可变重链。
31.实施方式10.根据实施方式1至6或8或9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
32.a.含有seq id no：36或40或44或48的轻链；和
33.b.含有seq id no:52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136、优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136的重链。
34.实施方式11.根据实施方式1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
35.a.含有seq id no:40的轻链；和
36.b.含有seq id no:112的重链。
37.实施方式12.根据前述实施方式中任一项所述的抗体，其中klk5是含有seq id no:142或143或144的人klk5或含有seq id no:151的食蟹猴klk5。
38.实施方式13.根据前述实施方式中任一项所述的抗体，其结合激肽释放酶5(klk5)，其中所述抗体结合人klk5的表位，所述表位含有至少一个、优选至少两个或更多个选自下组的氨基酸残基：leu212、ser213、gln214、lys215、arg216、glu218、asp219、ala220、pro222、gly233、pro269、asn270和pro272，参考seq id no:142。
39.实施方式14.根据实施方式13所述的抗体，其中所述表位由x射线晶体学表征。
40.实施方式15.根据实施方式1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体
41.a.抑制或降低klk5的蛋白酶活性；和/或
42.b.当klk5与lekti或lekti片段结合时，与klk5结合；和/或
43.c.不与lekti或lekti的片段竞争结合klk5；和/或
44.d.与和lekti或lekti的片段结合的klk5形成复合物。
45.实施方式16.根据实施方式15所述的抗体，其中所述lekti的片段是含有seq id no:145的氨基酸1至64的人lekti结构域5或含有seq id no:152的氨基酸1至71的lekti结构域8。
46.实施方式17.根据前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合人klk5，优选含有seq id no:144的人klk5和食蟹猴(cyno)klk5，优选含有seq id no:151的食蟹猴klk5。
47.实施方式18.根据前述实施方式中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合人或食蟹猴激肽释放酶2(klk2)；或者人或食蟹猴激肽释放酶4(klk4)；或者人或食蟹猴激肽释放酶7(klk7)。
48.实施方式19.一种与根据实施方式1至18中任一项所述的抗体竞争结合klk5的抗体；其
49.a.交叉阻断实施方式1至18中任一项所述的抗体对klk5的结合或者被实施方式1至18中任一项所述的抗体交叉阻断对klk5的结合；或者
50.b.与实施方式1至18中任一项所述的抗体在相同的表位结合klk5；和
51.其中所述抗体含有与根据seq id no:38的序列具有至少90％同一性或相似性的
重链可变区；和/或含有与根据seq id no:110的序列具有至少90％同一性或相似性的轻链可变区。
52.实施方式20.一种分离的多核苷酸，其编码根据实施方式1至18中任一项所述的抗体。
53.实施方式21.根据实施方式20所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：
54.a.轻链可变区，其中所述多核苷酸：
55.i.与seq id no:31或35或39或43或47至少90％相同；或者
56.ii.含有seq id no：31或35或39或43或47；或者
57.iii.基本上由seq id no:31或35或39或43或47组成；或者
58.b.重链可变区，其中所述多核苷酸：
59.i.与seq id no：33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135至少90％相同；或者
60.ii.含有seq id no：33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135；或者
61.iii.基本上由seq id no：33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135组成；或者
62.c.轻链，其中所述多核苷酸：
63.i.与seq id no:37或41或45或49至少90％相同；或者
64.ii.含有seq id no:37或41或45或49；或者
65.iii.基本上由seq id no:37或41或45或49组成；或者
66.d.重链，其中所述多核苷酸：
67.i.与seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137至少90％相同；或者
68.ii.含有seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137；或者
69.iii.基本上由seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137组成。
70.实施方式22.一种克隆或表达载体，其含有根据实施方式20或21中任一项所述的一种或多种多核苷酸。
71.实施方式23.一种宿主细胞，其包含：
72.a.根据实施方式20或21中任一项所述的一种或多种多核苷酸，或者
73.b.根据实施方式22所述的一种或多种表达载体。
74.实施方式24.产生根据实施方式1至18中任一项所述的抗体的方法，包括在产生所述抗体的合适条件下培养根据实施方式23所述的宿主细胞并分离由所述宿主细胞产生的抗体。
75.实施方式25.一种药物组合物，其中包含根据实施方式1至18中任一项所述的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
76.实施方式26.根据实施方式1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方式25所述的药物组合物用于治疗。
77.实施方式27.根据实施方式1至18中任一项所述的抗体或根据实施方式25所述的药物组合物，用于治疗以klk5失调或klk5抑制失调为特征的疾病。
78.实施方式28.根据实施方式27所述使用的抗体，其中所述疾病选自netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌或其组合。
79.实施方式29.根据实施方式28所述使用的抗体，其中所述疾病是netherton综合征。
80.实施方式30.根据实施方式28所述使用的抗体，其中所述疾病是特应性皮炎。
81.实施方式31.一种在患者中治疗以klk5失调或klk5抑制失调为特征的疾病的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的根据实施方式1至18中任一项所述的抗体或根据实施方式25所述的药物组合物。
82.实施方式32.根据实施方式31所述的方法，其中所述疾病选自netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌。
83.实施方式33.根据实施方式32所述使用的抗体，其中所述疾病是netherton综合征。
84.实施方式34.根据实施方式32所述使用的抗体，其中所述疾病是特应性皮炎。
85.附图的简要说明
86.图1.用抗体10273抑制由klk5刺激的角质形成细胞释放ip-1。测定了在存在或不存在兔抗体10273的情况下用klk5刺激角质形成细胞后释放到培养基中的ip-1的量。抗体10273抑制ip-1的释放，而同种型对照ab没有显示抑制作用。
87.图2.将k
obs
值与抗体10273和lekti-d5 fc蛋白的底物浓度作图。显示的数据是2nm ab 10273和2nm lekti d5 fc。斜率显示抗体10273是非竞争性抑制剂，而lekti蛋白是竞争性抑制剂。
88.图3.尺寸排阻色谱图a和b显示单独的人klk5(实线)、单独的兔fab抗体10273(虚线)、人klk5 lekti-d5 fc(长虚线；图a)或人klk5 lekti d8 fc(长虚线；图b)和人klk5 lekti d5 fc 兔fab抗体10273(短虚线，图a)或人klk5 lekti d8 fc 兔fab抗体10273(短虚线，图b)的洗脱曲线。
89.图4.a：来自图3a所示的sec的峰级分的sds-page。泳道1，mw标记；泳道2和3，二元klk5 lekti d5复合物的级分；泳道4和5，三元klk5 lekti d5 兔fab抗体10273复合物的峰级分。b:来自图3b所示sec的峰值级分的sds-page。泳道1，mw标记；泳道2和3，二元klk5 lekti d8复合物的峰级分；泳道4和5，三元klk5 lekti d8 兔fab抗体10273复合物的峰级分。
90.图5.用于x射线晶体学研究的klk5的sds-page。泳道m，mw标记。泳道1，从存在kifunensine(kif)的培养物中纯化的人klk5。泳道2，从kifunensine培养物中纯化并用内切糖苷酶h(endo h)处理的人klk5。
91.图6.人klk5表位与兔fab抗体10273复合的示意图。fab重链和轻链显示在卡通以及深色和浅色表面，分别是透明表面。黑色棒描述了形成由抗体10273结合的人klk5上的表位的残基leu212(163)、ser213(164)、gln214(165)、lys215(166)、arg216(167)、glu218(169)、asp219(170)、ala220(171)、pro222(173)、gly233(184)pro269(223)、asn270(224)和pro272(226)。
92.图7.与兔fab抗体10236和10273复合的人klk5的晶体结构的两个方向。人klk5显示为带状，兔fab抗体10236和10273显示为固体表面。
93.图8.抗体10273的兔可变轻链序列的人源化。移植物10273gl2、10273gl2 q1r、10273gl2 q1k和10273gl2 q1h是抗体10273的兔可变轻链的人源化移植物，其中使用igkv1d-13人种系作为受者框架的。cdr以粗体/下划线显示。cdrl1中导致整体pi增加的突变以粗体/下划线显示并突出标示：q1r、q1k或q1h。
94.图9.抗体10273的兔可变重链序列的人源化。移植物10273gh1、gh4、gh5、gh8、gh10和gh11是抗体10273的兔可变重链的人源化移植物，其中使用ighv3-66人种系作为受者框架。cdr以粗体/下划线显示。供体残基以粗体/斜体显示并带有灰色阴影：v24、i48、g49、k71、s73和v78。cdr-h3中用于去除潜在dp水解位点(d116e)或增加pi(d116n)的突变以粗体/下划线显示并突出标示。
95.图10.抗体10273的人源化移植物对人klk5的抑制作用。测定ab10273的人源化移植物变体以确定它们抑制klk5活性的程度。如实施例8中所述计算百分比抑制值并绘制数据。no inh＝无抑制剂；无no sub＝无底物；no enz＝无酶。
96.图11.涡旋对抗体10273的人源化移植物在两种不同组成和ph的缓冲液中的聚集稳定性的影响。
97.发明详述
98.现在将针对具体的非限制性方面及其实施方式并参考某些附图和实施例来描述本公开。
99.除非另有说明，否则技术术语均按其常规含义使用。如果某些术语具有特定含义，则将在使用这些术语的上下文中给出它们的定义。
100.在本说明书和权利要求书中使用术语“包含/含有”时，它不排除其他要素。出于本公开的目的，术语“由
……
组成”被认为是术语“包含
……”
的一个优选实施方式。
101.在提及单数名词时若使用不定冠词或定冠词，例如“一个/种”(“a”或“an”)或“这个/些/所述/该”(“the”)，将包括该名词的复数形式，除非另有明确说明。
102.如本文所用，术语“治疗”、“处理”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就疾病和/或归因于该疾病的副作用的部分或完全治愈而言，可以是治疗性的。因此，治疗涵盖对哺乳动物、特别是人中疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止该所述疾病在可能易患该疾病、但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制所述疾病，即阻止其发展；和(c)缓解该疾病，即导致该疾病的消退。
[0103]“治疗有效量”是指抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段的如下量：当将其施用给哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时，其足以产生对所述疾病的这种治疗。治疗有效量将根据抗α突触核蛋白抗体或其抗原结合片段、所述疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
[0104]
在整个说明书中，术语“分离的”是指抗体、抗原结合片段或多核苷酸，视情况而定，存在于与其可能在自然界中出现的物理环境不同的物理环境中。
[0105]
在本发明的第一方面，提供了与激肽释放酶5(klk5)结合的抗体，其中所述单克隆抗体含有可变轻链和可变重链，并且其中：
[0106]
a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0107]
b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3。
[0108]
激肽释放酶5(klk5、klk-l2、scte或任何其他已知同义词)具有胰蛋白酶样活性。它以前原形式表达，根据生物信息学工具signalp 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/index.php)，含有29个氨基酸的信号肽，然后是37氨基酸的原肽序列。原肽的切割产生由237个氨基酸组成的活性成熟酶，该酶具有一个活性位点，该活性位点具有丝氨酸蛋白酶所典型的催化三联体残基(michael i.p等人，2005；jbc 280:15,14628-35)。
[0109]
除非另有说明，否则术语klk5是指任何天然前体和原型形式(即含有所述信号序列和激活肽的未加工klk5)、变通的剪接或天然变体、突变体和来自其他物种(小鼠、食蟹猴等)的klk5以及活性klk5(由自动切割或其他方式导致)。当指定人klk5时，人klk5含有在seq id no：144中给出的序列(活性人klk5)。本文提及的其他klk5序列包括seq id no:143(缺少信号序列的人klk5原型)或seq id no:142(具有信号和前肽序列的全长人klk5)，对应于uniprot q9y337的序列或在第55和153位(参考seq id no：142)含有突变的天然变体。这些突变的实例包括包含根据seq id no：142的残基23至293、在残基55处gly至arg的变化(g55r)和/或在残基153处asp至asn的变化(d153n)的突变的人klk5。
[0110]
本发明的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，例如杂交瘤技术(kohler&milstein,1975,nature,256:495-497)、三瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor et al.,1983,immunology today,4:72)和ebv-杂交瘤技术(cole et al.,monoclonal antibodies and cancer therapy,pp77-96,alan r liss,inc.,1985)。
[0111]
用于本发明的抗体也可以使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cdna来产生，所述免疫球蛋白可变区cdna由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生，例如通过babcook,j.et al.,1996,proc.natl.acad.sci.usa 93(15):7843-7848l；wo92/02551；wo2004/051268and wo2004/106377中描述的方法。
[0112]
在一个实施方案中，结合激肽释放酶5(klk5)的抗体含有可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:10或14或23的cdr-h3。
[0113]
在一个优选的实施方案中，结合激肽释放酶5(klk5)的抗体含有可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含含有seq id no：7的cdr-l1、含有seq id no：2的cdr-l2和含有seq id no：3的cdr-l3；所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3。
[0114]
根据本发明的抗体含有互补决定区(cdr)，三个来自重链，三个来自轻链。通常，所述cdr处于框架中，并且一起形成可变区。按照惯例，抗体或其抗原结合片段的重链可变区中的cdr称为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，轻链可变区中的cdr称为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。它们根据每条链的n端到c端的方向依次编号。
[0115]
cdr通常根据kabat等人设计的系统编号。该系统阐述于kabat et al.,1991,in sequences of proteins of immunological interest,us department of health and human services,nih,usa(下文称为“kabat等人(同上)”)。该编号系统在本说明书中使用，除非另有说明。
[0116]
kabat残基命名并不总是与氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可以比严格的kabat编号含有更少或更多的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的结构组分的缩短或插入其中，无论是框架还是互补决定区(cdr)。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”kabat编号序列进行比对，可以对给定抗体确定残基的正确kabat编号。
[0117]
根据kabat编号系统，重链可变结构域的cdr位于残基31-35(cdr-h1)、残基50-65(cdr-h2)和残基95-102(cdr-h3)。然而，根据chothia(chothia,c.and lesk,a.m.j.mol.biol.,196,901-917(1987))，相当于cdr-h1的环从残基26延伸到残基32。因此，除非另有说明，如本文所用的“cdr-h1”旨在指残基26至35，如kabat编号系统和chothia拓扑环定义的组合所描述的。
[0118]
根据kabat编号系统，轻链可变结构域的cdr位于残基24-34(cdr-l1)、残基50-56(cdr-l2)和残基89-97(cdr-l3)。
[0119]
除了cdr环之外，在cdr-2(cdr-l2或cdr-h2)和cdr-3(cdr-l3或cdr-h3)之间存在第四个环，其由框架3(fr3)形成。kabat编号系统将框架3确定为重链中的66-94位和轻链中的57-88位。
[0120]
如在本公开的上下文中使用的术语“抗体”包括完整的抗体及其功能活性片段，即含有特异性结合抗原的抗原结合结构域的分子，也称为抗原结合片段。除非上下文另有说明，本文针对抗体描述的特征也适用于抗原结合片段。抗体可以是(或来源于)单克隆的、多价的、多特异性的、双特异性的、完全人的、人源化的或嵌合的。
[0121]
完整抗体，也称为“免疫球蛋白(ig)”，通常涉及完整或全长抗体，即含有两条重链和两条轻链的元件，通过二硫键相互连接，组装成特征性的y形三维结构。经典的天然完整抗体是单特异性的，因为它们结合一种抗原类型，它们又是二价的，因为它们具有两个独立的抗原结合结构域。术语“完整抗体”、“全长抗体”和“全抗体”可互换使用，指具有与天然抗体结构相似的结构的单特异性二价抗体，包括如本文定义的fc区。
[0122]
每条轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区(cl)组成。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区(ch)组成，该重链恒定区(ch)由三个恒定结构域ch1、ch2和ch3或四个恒定结构域ch1、ch2、ch3和ch4组成，取决于ig类别。ig或抗体的“类别”是指恒定区的类型，包括iga、igd、ige、igg和igm，其中一些可以进一步分为亚类，例如igg1、igg2、igg3、igg4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。
[0123]
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”可互换使用，指的是处于可变区之外的抗体结构域。恒定结构域在相同同种型的所有抗体中是相同的，但在一种同种型与另一种同种型中是不同的。通常，重链的恒定区从n到c末端由ch1-铰链-ch2-ch3-任选地ch4形成，含有三个或四个恒定结构域。
[0124]
如果存在的话，本发明的抗体分子的恒定区结构域可以根据抗体的推荐功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人iga、igd、ige、igg或igm
结构域。特别地，当抗体旨在用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人igg恒定区结构域，尤其是igg1和igg3同种型。或者，当抗体旨在用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可以使用igg2和igg4同种型。应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，如angal等人(angal et al.,1993)所述在241位的丝氨酸(根据kabat编号系统编号)已改变成脯氨酸的igg4。可以使用单个氨基酸取代消除嵌合小鼠/人(igg4)抗体的异质性，如在sds-page分析(mol immunol 30,105-108)期间观察到的。这在本文中被称为igg4p。这种单氨基酸取代防止了igg4分子的重链发生交换产生嵌合分子的天然倾向。
[0125]“fc区”、“fc片段”或简称“fc”可互换使用，指抗体的c端区，其中含有抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域。因此，fc指iga、igd和igg的最后两个恒定结构域ch2和ch3，或ige和igm的最后三个恒定结构域，以及这些结构域n端的柔性铰链。人igg1重链fc区在本文中定义为在其羧基末端含有残基c226，其中编号是根据kabat中的eu索引。在人igg1的情况下，根据如kabat中的eu索引，下铰链是指位置226-236，ch2结构域是指位置237-340，ch3结构域是指位置341-447。其他免疫球蛋白的相应fc区可以通过序列比对来鉴定。
[0126]
在本公开的上下文中，当存在时，恒定区或fc区可以是天然的，如上文所定义，或者可以以各种方式被修饰，条件是它含有功能性fcr结合结构域，并且优选地含有功能性fcrn结合结构域。优选地，修饰的恒定区或fc区导致功能和/或药代动力学的改善。修饰可以包括缺失fc片段的某些部分。修饰可以进一步包括能够影响抗体的生物学特性的各种氨基酸取代。也可能存在增加fcrn结合并因此增加体内半衰期的突变。修饰还可以包括抗体糖基化谱的修饰。天然fc片段在ch2结构域中被糖基化，两条重链中的每一条上都存在与第297位天冬酰胺残基(asn297)结合的n-聚糖。在本公开的上下文中，抗体可以是糖基修饰的，即被工程化以具有特定的糖基化谱，这例如导致改进的性质，例如改善的效应子功能或改善的血清半衰期。
[0127]
抗体的抗原结合片段包括单链抗体(例如scfv和dsscfv)、fab、fab'、f(ab')2、fv、单结构域抗体或纳米抗体(例如vh或vl，或vhh或vnar)。用于本发明的其他抗体片段包括在国际专利申请wo2011/117648、wo2005/003169、wo2005/003170和wo2005/003171(均通过引用并入本文)中描述的fab和fab'片段。
[0128]
产生和制造这些抗体片段的方法是本领域众所周知的(参见例如verma等人，1998，journal of immunological methods，216、165-181)。
[0129]
如本文所用，典型的“fab'片段”或“fab'”含有重链和轻链对，其中重链含有可变区vh、恒定结构域ch1和天然或修饰的铰链区，并且轻链含有可变区vl和恒定区cl。根据本公开的fab'的二聚体产生f(ab')2，其中例如二聚化可以通过铰链进行。
[0130]
如本文所用，术语“单结构域抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的例子包括vh或vl或vhh或v-nar。
[0131]“fv”是指两个可变结构域，例如协同的可变结构域，例如关联对或亲和力成熟的可变结构域，即vh和vl对。
[0132]
如本文所用的“单链可变片段”或“scfv”是指通过vh和vl可变结构域之间的肽接头稳定化的单链可变片段。
[0133]
如本文所用的“二硫键稳定化的单链可变片段”或“dsscfv”是指由vh和vl可变结
构域之间的肽接头稳定化并且还包括vh和vl之间的结构域间二硫键的单链可变片段(参见例如weatherill等人，protein engineering,design&selection,25(321-329),2012,wo2007109254)。
[0134]
可变结构域vh和vl之间的二硫键位于下面列出的两个残基之间(除非上下文另有说明，在下面的列表中使用kabat编号)(protein science 6,781-788zhu et al(1997)；weatherill等人，protein engineering,design&selection,25(321-329),2012；j biochem.118,825-831luo等人(1995)；febs letters 377 135-139young等人(1995)；proc.natl.acad.sci.usa vol.90 pp.7538-7542brinkmann et al(1993)；proteins 19,35-47jung et al(1994)biochemistry 29 1362-1367；glockshuber et al(1990))。当提及kabat编号时，相关参考文献是kabat等人，1991(第5版，bethesda,md.)，in sequences of proteins of immunological interest,us department of health and human services,nih,usa。
[0135]
· vh37 vl95c；
[0136]
· vh44 vl100；
[0137]
· vh44 vl105；
[0138]
· vh45 vl87；
[0139]
· vh55 vl101；
[0140]
· vh100 vl50；
[0141]
· vh100b vl4
[0142]
· vh98 vl 46；
[0143]
· vh101 vl46；
[0144]
· vh105 vl43；
[0145]
· vh106 vl57；
[0146]
以及位于所述分子中的可变区对中与其对应的一个或多个位置。
[0147]
如本文所用，术语“抗体”还涵盖单价的，即仅含有一个抗原结合结构域的抗体(例如，含有互连的全长重链和全长轻链的单臂抗体，也称为“半抗体”).
[0148]
术语“抗体”还涵盖含有多种特异性的多价抗体，例如双特异性或三特异性或多特异性抗体。
[0149]
如本文所用的“多特异性”或“多特异性抗体”是指如本文所述的具有至少两个结合结构域的抗体，即具有两个或更多个结合结构域，例如两个或三个结合结构域，其中所述至少两个结合结构域独立地结合两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同表位(也称为多互补位)。多特异性抗体对于每种特异性(抗原)通常是单价的。本文所述的多特异性抗体涵盖单价和多价，例如二价、三价、四价多特异性抗体。
[0150]
如本文所用的“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，其含有与靶抗原特异性相互作用的一个或多个可变结构域的一部分或全部，例如一对可变结构域vh和vl的一部分或全部。结合结构域可以含有单结构域抗体。在一个实施方案中，每个结合结构域是单价的。优选地，每个结合结构域含有不超过一个vh和一个vl。
[0151]
本领域已知多种多特异性抗体形式。已经提出了不同的分类，但多特异性igg抗体形式通常包括双特异性igg、附接igg、多特异性(例如双特异性)抗体片段、多特异性(例如
双特异性)融合蛋白和多特异性(例如双特异性)抗体缀合物，例如spiess et al.,mol immunol.67(2015):95-106中所述。
[0152]
制备双特异性抗体的技术包括但不限于crossmab技术(klein等人，methods 154(2019)21-31)、匙入孔工程化(knobs-in-holes engineering)(例如wo1996027011、wo1998050431)、duobody技术(例如wo2011131746)、azymetric技术(例如wo2012058768)。用于制造双特异性抗体的其他技术已经描述于例如godar等人，2018,expert opinion on therapeutic patents,28:3,251-276中。双特异性抗体特别地包括crossmab抗体、daf(二合一)、daf(四合一)、dutamab、dt-igg、匙入孔常规lc(knobs-in-holes common lc)、匙入孔装配(knobs-in-holes assembly)、charge pair，fab臂交换、seedbody、triomab、luz-y、fcab、κλ-body和正交fab。
[0153]
附接的igg通常包括通过将额外的抗原结合结构域或抗原结合片段附接到igg的重链和/或轻链的n-和/或c-末端而加工的全长igg。这种额外的抗原结合片段的实例包括sdab抗体(例如vh或vl)、fv、scfv、dsscfv、fab、scfav。附接的igg抗体形式特别包括dvd-igg、igg(h)-scfv、scfv-(h)lgg、lgg(l)-scfv、scfv-(l)lgg、lgg(l,h)-fv、lgg(h)-v、v(h)-igg、lgc(l)-v、v(l)-igg、kih igg-scfab、2scfv-igg、lgg-2scfv、scfv4-lg、zybody和dvi-igg(四合一)，例如如spiess et al.,alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.mol immunol.67(2015):95-106中所述。
[0154]
多特异性抗体片段包括纳米抗体、纳米抗体-has、bites、双抗体、dart、tandab、scdiabody、sc-diabody-ch3、diabody-ch3、triple body、miniantibody；微型抗体、tri bi微型抗体、scfv-ch3 kih、fab-scfv、scfv-ch-cl-scfv、f(ab')2、f(ab')2-scfv2、scfv-kih、fab-scfv-fc、四价hcab、scdiabody-fc、diabody-fc、串联scfv-fc；和内抗体(intrabody)，如例如spiess et al.,for bispecific antibodies.mol immunol.67(2015):95-106中所述。
[0155]
多特异性融合蛋白包括dock and lock、immtac、hsabody、scdiabody-has和串联scfv-toxin。多特异性抗体偶联物包括igg-igg；cov-x-抗体；和scfv1-peg-scfv2。
[0156]
其他多特异性抗体形式已描述于例如brinkmann和kontermann,mabs,9:2,182-212(2017)，特别是图2，例如串联scfv、三联体、fab-vhh、tafv-fc、scfv4-ig、scfv2-fcab、scfv4-igg。例如在wo99/37791中公开了双抗体(bibodies)、三抗体(tribodies)及其制备方法。
[0157]
附接的igg和附接的fab分别含有完整的igg或fab片段，它们通过在所述igg或fab的重链和/或轻链的n-和/或c-末端附接至少一个额外的抗原结合结构域(例如两个、三个或四个额外的抗原结合结构域)，例如单结构域抗体(例如vh或vl，或vhh)、scfv、dsscfv、dsfv而工程化的，例如如wo2009/040562、wo2010035012、wo2011/030107、wo2011/061492、wo2011/061246和wo2011/086091中描述的，它们均通过引用并入本文。具体而言，fab-fv形式首次公开于wo2009/040562，其二硫化物稳定化的形式fab-dsfv首次公开于wo2010/035012。wo2014/096390首先公开了单一接头fab-dsfv，其中dsfv通过fv的vl或vh结构域与fab的lc或hc的c端之间的单一接头连接到fab，该文献通过引用并入本文。wo2015/197789首次公开了一种附接的igg，其含有通过将dsfv附接到igg的重链或轻链的c端而改造的全
长igg1，该文献通过引用并入本文。
[0158]
或者，另一种多特异性形式含有与两个scfv或dsscfv连接的fab，每个scfv或dsscfv结合相同或不同的靶标(例如，一个scfv或dsscfv结合治疗靶标，一个scfv或dsscfv通过结合例如白蛋白而增加半衰期)。此类抗体片段描述于wo2015/197772中，其通过引用整体并入本文。另一种形式包括仅与一个scfv或dsscfv连接的fab，如例如wo2013/068571和dave等人，mabs，8(7)1319-1335(2016)中描述的，这些文献通过引用并入本文。
[0159]
其他众所周知的多特异性抗体形式包括：
[0160]
双抗体，如本文所用是指具有两个fv间接头的两个fv对，第一vh/vl对和另外的vh/vl对，使得第一fv的vh连接到第二fv的vl并且第一fv的vl连接到第二fv的vh。
[0161]
三抗体，如本文所用是指类似于双抗体的形式，其含有三个fv和三个fv间接头。
[0162]
四抗体，如本文所用是指类似于双抗体的形式，其含有四个fv和四个fv间接头。
[0163]
串联scfv，如本文所用是指通过单个接头连接、从而存在单个fv间接头的至少两个scfv。
[0164]
串联scfv-fc，如本文所用是指至少两个串联scfv，其中每一个通过例如铰链附接到恒定区片段-ch2ch3的ch2结构域的n端。
[0165]
fab-fv，如本文所用是指具有附接到以下每一个的c端的可变区的fv片段：重链的ch1和轻链的cl。该格式可以作为其peg化形式提供。
[0166]
fab'-fv，如本文所用，类似于fabfv，其中fab部分被fab'替代。该格式可以作为其peg化形式提供。
[0167]
fab-dsfv，如本文所用是指其中fv内二硫键稳定附接的c-末端可变区的fabfv。该格式可以作为其peg化形式提供。
[0168]
fab-scfv，如本文所用是具有scfv附接在轻链或重链的c端的fab分子。
[0169]
fab'-scfv，如本文所用是在轻链或重链的c端附接scfv的fab'分子。
[0170]
difab，如本文所用是指通过重链c末端连接的两个fab分子。
[0171]
difab'，如本文所用是指通过其铰链区中的一个或多个二硫键连接的两个fab'分子。
[0172]
如本文所用，scdiabody是含有fv内接头的双抗体，使得该分子含有三个接头并形成正常scfv，其vh和vl末端各自连接至另一fv对的可变区之一。
[0173]
如本文所用的scdiabody-fc是两个scdiabody，其中每个都附接到恒定区片段-ch2ch3的ch2结构域的n末端，例如通过铰链。
[0174]
如本文所用的scfv-fc-scfv是指四个scfv，其中每一个都附接到-ch2ch3片段的重链和轻链二者的n端和c端。
[0175]
如本文所用的scdiabody-ch3是指各自通过例如铰链连接到ch3结构域的两个scdiabody分子。
[0176]
如本文所用的igg-scfv是在每条重链或每条轻链的c端具有scfv的全长抗体。
[0177]
如本文所用的scfv-igg是在每条重链或每条轻链的n端具有scfv的全长抗体。
[0178]
如本文所用的v-igg是在每条重链或每条轻链的n端具有可变结构域的全长抗体。
[0179]
如本文所用的igg-v是在每条重链或每条轻链的c端具有可变结构域的全长抗体。
[0180]
dvd-ig(也称为双重v结构域igg)是具有4个额外的可变结构域的全长抗体，其中
每条重链和每条轻链的n末端各有一个可变结构域。
[0181]
本发明的单克隆抗体优选为全长抗体。更优选地，所述全长抗体选自igg1、igg4或igg4p。
[0182]
在另一个实施方案中，单克隆抗体选自fab、fab'、f(ab')2、scfv、dab或vhh。
[0183]
在一个实施方案中，根据本发明的抗体可以含有产生所述抗体的动物的框架区。例如，如果抗体在兔中产生，它将含有如上定义的cdr和兔抗体的框架区，例如含有根据seq id no：30的轻链可变区(其核苷酸序列显示于seq id no：31中)和根据seq id no：32的重链可变区(其核苷酸序列显示于seq id no：33中)的抗体。
[0184]
在一个实施方案中，所述抗体可以是嵌合的或人源化的。或者，所述抗体可以是人的。
[0185]
嵌合抗体通常使用重组dna方法生产。可以通过将人l和h链的编码序列替换为相应的非人(例如鼠或兔)h和l恒定区来修饰dna(morrison；pnas 81,6851(1984))。
[0186]
如果人抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则所述人抗体含有作为该特定种系序列的“产物”或“由其衍生”的重链或轻链可变区或者全长重链或轻链。这样的系统包括用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用感兴趣的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。作为人种系免疫球蛋白序列“产物”或“由其衍生”的人抗体或其片段可以通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并选择在序列上与所述人抗体的序列最接近(即最大同一性百分比)的人种系免疫球蛋白序列来鉴定。由于例如自然发生的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“由其衍生”的人抗体与所述种系序列相比可能含有氨基酸差异。然而，选择的人抗体通常在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性，并且当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，含有将所述人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可以在氨基酸序列上与所述种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％或至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，源自特定人种系序列的人抗体与所述人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的氨基酸差异不超过10个。在某些情况下，所述人抗体与由所述种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比显示不超过5个、或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
[0187]
人抗体可通过本领域技术人员已知的多种方法产生。人抗体可以使用人骨髓瘤或小鼠-人异质骨髓瘤细胞系通过杂交瘤方法制备(kozbor,j immunol；(1984)133:3001；brodeur,monoclonal isolated antibody production techniques and applications,pp51-63,marcel dekker inc,1987)。替代方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，两者都利用人类可变区库(winter g；(1994)annu rev immunol 12:433-455,green ll,(1999)j immunol methods 231:1 1-23)。
[0188]
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的抗体是人源化的。
[0189]
在一个优选的实施方案中，结合激肽释放酶5(klk5)的单克隆抗体含有可变轻链和可变重链，并且其中：
[0190]
a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0191]
b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；
[0192]
其中所述抗体是人源化的；更优选地，所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1，所述可变重链包含含有seq id no:23的cdr-h3。
[0193]
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的单克隆抗体优选地是与激肽释放酶5(klk5)结合并且含有可变轻链和可变重链的全长抗体，并且其中：
[0194]
a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0195]
b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；
[0196]
其中所述抗体是人源化的；更优选地，所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1并且所述可变重链包含含有seq id no:23的cdr-h3。甚至更优选地，所述全长抗体选自igg1、igg4或igg4p。
[0197]
如本文所用，术语“人源化”抗体是指其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如非人抗体如鼠或兔单克隆抗体)的一个或多个cdr(如果需要，包括一个或多个修饰的cdr)移植到受者抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中的抗体。对于综述，参见vaughan等人，nature biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移整个cdr，而是将来自上文描述的任何一个cdr的仅一个或多个特异性决定残基转移到人抗体框架中(参见例如，kashmiri et al.,2005,methods,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自上文描述的一个或多个cdr的特异性决定残基转移至所述人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自上文描述的每个cdr的特异性决定残基转移到所述人抗体框架中。
[0198]
当cdrs被移植时，考虑cdrs来源的供体抗体的类别/类型，可以使用任何合适的受者可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。
[0199]
优选地，根据本发明的人源化单克隆抗体具有含有人受者框架区以及本文具体提供的一个或多个cdr的可变结构域。因此，在一个实施方案中，提供了一种结合klk5的人源化单克隆抗体，其中所述可变结构域含有人受者框架区和非人供体cdr。
[0200]
可用于本发明的人框架的例子是kol、newm、rei、eu、tur、tei、lay和pom(kabat等人，同上)。例如，kol和newm可用于重链，rei可用于轻链，eu、lay和pom可用于重链和轻链。或者，可以使用人种系序列；这些可在以下网址获得：http://www.imgt.org/。
[0201]
在根据本发明的人源化抗体中，受者重链和轻链不一定需要源自相同的抗体，并且如果需要，可以含有具有源自不同链的框架区的复合链。
[0202]
根据本发明的人源化单克隆抗体的轻链的合适框架区来源于人种系igkv1d-13jk4，其含有seq id no:138，并且其核苷酸序列显示在seq id no:139中。
[0203]
根据本发明的人源化单克隆抗体的重链的合适框架区来源于人种系ighv3-66 jh6，其含有如seq id no:140所示的序列，其核苷酸序列如seq id no:141.
[0204]
因此，在一个实施方案中，提供了一种结合klk5的人源化单克隆抗体，其中该抗体含有可变轻链和可变重链，并且其中：
[0205]
a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0206]
b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；
[0207]
更优选地，所述可变轻链包含含有seq id no：7的cdr-l1并且所述可变重链包含含有seq id no：23的cdr-h3；并且其中轻链框架区来源于人种系igkv1d-13jk4，其含有seq id no:138；重链框架区来源于人种系ighv3-66 jh6，其含有seq id no:140。
[0208]
在根据本发明的人源化单克隆抗体中，框架区可以不具有与受者抗体完全相同的序列。例如，不常见的残基可以改变为对于该受者链类别或类型更频繁出现的残基。或者，可以改变受者框架区中的选定残基，以使它们对应于供体抗体中相同位置处的残基(参见reichmann等人，1998，nature，332，323-324)。此类变化应保持在恢复供体抗体亲和力所需的最低限度。用于选择受者框架区中可能需要改变的残基的方案示于wo91/09967(其通过引用并入本文)中。
[0209]
因此，在一个实施方案中，框架中的1、2、3、4、5、6、7或8个残基被替换为替代的氨基酸残基。
[0210]
因此，在一个实施方案中，提供了根据本发明的人源化单克隆抗体，其中可变重链至少在位置24、48、49、71、73和78(参考seq id no:140)中每一处的残基是供体残基。
[0211]
优选地，可变重链的24位残基是缬氨酸(而不是丙氨酸)，48位残基是异亮氨酸(而不是缬氨酸)，49位残基是甘氨酸(而不是丝氨酸)，71位残基是赖氨酸(而不是精氨酸)，第73位残基是丝氨酸(而不是天冬酰胺)，第78位残基是缬氨酸(而不是亮氨酸)。
[0212]
因此，提供了与klk5结合的人源化单克隆抗体，其中所述抗体含有：
[0213]
a.可变轻链，其包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0214]
b.可变重链，其包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；
[0215]
更优选地，所述可变轻链包含含有seq id no：7的cdr-l1并且所述可变重链包含含有seq id no：23的cdr-h3；并且其中所述轻链框架区来源于人种系igkv1d-13jk4，其含有seq id no:138；所述重链框架区衍生自人种系ighv3-66 jh6，其含有seq id no:140，并且其中可变重链的氨基酸残基位置24、48、49、71、73和78(参考seq id no:140)是供体残基。
[0216]
因此，在一个实施方案中，结合klk5的所述人源化单克隆抗体包含：
[0217]
a.可变轻链，其含有seq id no：34或38或42或46；和
[0218]
b.可变重链，其含有seq id no：50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134。
[0219]
优选地，结合klk5的所述人源化单克隆抗体包含：
[0220]
a.含有seq id no:38的可变轻链；和
[0221]
b.含有seq id no:110的可变重链。
[0222]
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，其包含与本文公开的序列在相关序列的部分或全部上，例如可变结构域序列、cdr序列或不包括cdr的可变结构域序列上80％、例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同的序列。在一个实施方案中，相关序列是seq id no:38。在一个实施方案中，相关序列是seq id no:110。
[0223]
在一个实施方案中，结合klk5的单克隆抗体含有轻链和重链，其中所述可变轻链包含与含有seq id no:38的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，和/或所述可变重链包含与seq id no:110中含有的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0224]
如本文使用的，“同一性”、“相同”或其语法变体表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文中使用的，“相似性”、“相似”或其语法变体表示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间是相似类型。例如，亮氨酸可以取代为异亮氨酸或缬氨酸。其他经常可以相互取代的氨基酸包括但不限于：
[0225]-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)；
[0226]-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
[0227]-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
[0228]-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
[0229]-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
[0230]
可以很容易地计算同一性和相似性的程度(computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university press,new york,1988；biocomputing.informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part 1,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987,sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york,1991,从ncbi可获得的blast
tm
软件(altschul,s.f.et al.,1990,j.mol.biol.215:403-410；gish,w.&states,d.j.1993,nature genet.3:266-272.madden,t.l.et al.,1996,meth.enzymol.266:131-141；altschul,s.f.et al.,1997,nucleic acids res.25:3389-3402；zhang,j.&madden,t.l.1997,genome res.7:649-656)。
[0231]
在一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，优选选自igg1和igg4或igg4p。
[0232]
因此，本发明提供了一种结合klk5的全长人源化单克隆抗体，其中包含：
[0233]
a.可变轻链，其包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0234]
b.可变重链，其包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；
[0235]
更优选地，所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1并且所述可变重链包含
含有seq id no:21的cdr-h3；并且其中所述抗体是igg4p同种型。
[0236]
本发明还提供了一种结合klk5的全长人源化单克隆抗体，其中包含：
[0237]
a.含有seq id no：36或40或44或48的轻链；和
[0238]
b.含有seq id no:52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134的重链。
[0239]
优选地，结合klk5的所述全长人源化单克隆抗体包括：
[0240]
a.含有seq id no:40的轻链；和
[0241]
b.含有seq id no:112的重链。
[0242]
在一个实施方案中，结合klk5的所述单克隆抗体含有与seq id no:40中给出的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同、但其中抗体具有包含seq id no:7(或seq id no:1或8或9)作为cdr-l1，seq id no:2作为cdr-l2和seq id no:3作为cdr-l3的序列的轻链，和与seq id no:112中给出的序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同、但其中抗体具有包含seq id no:4作为cdr-h1、seq id no:5作为cdr-h2和seq id no：6或seq id no：10至29中的任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29作为cdr-h3的序列的重链。
[0243]
在又一个实施方案中，结合klk5的所述单克隆抗体是fab'片段，其包含含有seq id no:38的轻链可变区和含有seq id no:110的重链可变区。
[0244]
在另一个实施方案中，结合klk5的所述单克隆抗体是全长igg4抗体，其包含含有seq id no:40的轻链和含有seq id no:112的重链。
[0245]
本领域技术人员还将理解，抗体可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。由于羧肽酶的作用，一种常见的修饰是羧基末端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如harris,rj.journal of chromatography 705:129-134,1995中所述)。因此，抗体重链的c端赖氨酸可能不存在。
[0246]
在一个实施方案中，来自抗体的c端氨基酸在翻译后修饰期间被切割。
[0247]
在一个实施方案中，来自抗体的n-末端氨基酸在翻译后修饰期间被切割。
[0248]
在另一个实施方案中，根据本发明的单克隆抗体结合人klk5，优选含有seq id no:144或143或142，并且还结合食蟹猴(cyno)klk5，优选含有seq id no:151的食蟹猴klk5。
[0249]
在一个实施方案中，所述单克隆抗体结合人和/或食蟹猴激肽释放酶5(klk5)，其中所述抗体含有可变轻链和可变重链，并且其中：
[0250]
a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0251]
b.所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82
no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0265]
b.所述可变轻链含有seq id no:38；并且所述可变重链含有seq id no:110；或者
[0266]
c.所述单克隆抗体是含有轻链和重链的全长抗体，其中所述轻链含有seq id no：40；并且所述重链含有seq id no:112。
[0267]
在一个实施方案中，根据本发明，抗体与klk5的结合的特征在于解离常数(kd)为约7nm或更小，优选500pm或更小，优选约400pm或更小。
[0268]
如本文所用，术语“k
d”是指解离常数，其由kd与ka的比率(即kd/ka)获得，表示为摩尔浓度(m)。kd和ka分别指特定抗原-抗体(或其抗原结合片段)相互作用的解离速率和缔合速率。抗体的kd值可以使用本领域充分确立的方法来确定。确定抗体kd的一种方法是通过使用表面等离子体共振，例如如本文实施例中所述的系统，其中使用重组klk5或其合适的融合蛋白/多肽。在一个实施例中，使用如本文实施例中所述的重组klk5测量亲和力。对于表面等离子体共振，靶分子被固定在固相上并暴露于流动相中的配体，流动相沿着流动池流动。如果配体与固定的靶发生结合，则局部折射率会发生变化，从而导致spr角发生变化，可以通过检测反射光强度的变化来实时监测。可以分析spr信号的变化率以产生结合反应的缔合和解离相的表观速率常数。这些值的比率给出了表观平衡常数(亲和力)(参见例如wolff等人，cancer res.53:2560-65(1993))。
[0269]
在一个实施方案中，根据本发明的抗体对人klk5的结合亲和力高于对食蟹猴或小鼠klk5的结合亲和力(即更小的kd)。术语“亲和力”是指抗体和klk5之间相互作用的强度。
[0270]
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体阻断klk5蛋白酶活性的ic
50
小于800pm，优选地，在如本文所述的体外测定中，本发明的单克隆抗体阻断klk5蛋白酶活性的ic50小于18pm。
[0271]
如本文所用，术语ic
50
是指半数最大抑制浓度，其是物质如抗体在抑制特定生物或生化功能中的有效性的量度，在本发明中其为klk5的蛋白酶活性。ic
50
是一种定量测量，其表明需要多少特定物质才能将给定的生物过程或功能或活性抑制一半。
[0272]
在本发明的另一个实施方案中，结合klk5的单克隆抗体，其中该抗体含有可变轻链和可变重链，并且其中：
[0273]
a.所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；和
[0274]
b.所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；
[0275]
其中所述抗体抑制或降低klk5的蛋白酶活性。
[0276]
在本发明中，术语“抑制”(及其语法变体)表示根据本发明的抗体对klk5生物活性的影响效果。优选地，klk5的生物活性是蛋白酶活性，优选丝氨酸蛋白酶活性。该效果导致klk5的丝氨酸蛋白酶活性完全或部分受阻。
[0277]
不希望受理论束缚，据信根据本发明的单克隆抗体结合klk5并抑制(例如完全或部分)或降低klk5的蛋白酶活性(优选丝氨酸蛋白酶活性)；和/或
[0278]
i)当klk5与lekti或lekti的片段结合时与klk5结合，和/或
[0279]
ii)不与lekti或lekti的片段竞争对klk5的结合，和/或
[0280]
iii)与结合到lekti或lekti片段的klk5形成复合物(即形成含有本发明的抗体、klk5和lekti或lekti片段的复合物)。
[0281]
术语“形成复合物”(及其任何语法变体)是指当klk5已经与另一种蛋白质如lekti、或lekti的片段、或另一种抗体或抗体片段例如fab结合时，本发明的抗体能够结合klk5。
[0282]
优选地，当klk5与lekti或lekti的片段结合时，本文要求保护的抗体抑制或降低klk5的蛋白酶活性和/或与klk5结合；和/或不与lekti或lekti片段竞争对klk5的结合和/或与结合到lekti或lekti片段的klk5形成复合物。
[0283]
在本发明中，术语“lekti”是指由15个结构域组成的淋巴上皮kazal型相关抑制剂，其被前蛋白转化酶如弗林蛋白酶切割成更小的功能性片段，产生由一个或多个结构域组成的lekti片段。这些片段被分泌到细胞外空间，在那里它们可以与蛋白酶如klk5形成抑制性复合物。lekti也称为丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal-type 5(spink5)，它是一种在人类中由spink5基因编码的蛋白质。在人类中，产生了三种lekti mrna剪接变体，导致该蛋白质的全长、长和短同种型，仅在其cooh末端区域有所不同。
[0284]
spink5是位于染色体5q32上的基因家族簇的成员，其编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。这包括其他表皮蛋白spink6和lekti-2(spink9)，在本发明中它们也包括在术语“lekti”内。
[0285]
与能够结合klk5并抑制klk5生物学(即蛋白酶)活性、但不与lekti或lekti片段竞争结合klk5的抗体相关的优势可以在lekti从klk5：lekti复合物解离下来的条件下抑制klk5活性，例如在从基底层到表皮角质层逐渐呈酸性的环境。
[0286]
在这些实施方案中，lekti的片段优选是含有seq id no:145的氨基酸1至64的人lekti结构域5或含有seq id no:152的氨基酸1至71的lekti结构域8。
[0287]
在一个实施方案中，根据本发明的单克隆抗体结合人klk5的表位，该表位含有至少一个、优选至少两个或更多个选自下述的氨基酸残基：leu212、ser213、gln214、lys215、arg216、glu218、asp219、ala220、pro222、gly233、pro269、asn270和pro272，参考seq id no：142。优选地，所述表位由x射线晶体学表征。括号中的数字对应于蛋白酶命名法。
[0288]
在本发明中，术语“表位”可互换地用于构象表位和线性表位。构象表位由抗原的氨基酸一级序列的不连续部分组成，线性表位由连续氨基酸形成的序列形成。
[0289]
可以通过本领域已知的任何合适的表位作图方法并结合本发明提供的任何一种抗体来鉴定表位。此类方法的实例包括筛选衍生自全长klk5的不同长度的肽对本发明的抗体或其片段的结合，并鉴定可特异性结合含有由所述抗体识别的表位序列的抗体的最小片段。klk5肽可以合成产生或通过klk5的蛋白水解消化产生。结合所述抗体的肽可以通过例如质谱分析来鉴定。诸如nmr光谱学或x射线晶体学等方法可用于鉴定抗体结合的表位。通常，当通过x射线晶体学进行表位测定时，距离cdr以内的抗原氨基酸残基被认为是表位的氨基酸残基部分。一旦鉴定，该表位可用于制备结合本发明抗体的片段，并且如果需要，用作免疫原以获得结合相同表位的额外抗体。
[0290]
在描述本发明的方面和实施方案中指示的表位优选地是由x射线晶体学表征的表位。
[0291]
此外，本发明还提供了一种抗体，该抗体通过交叉阻断结合包含下述氨基酸残基
的人klk5表位的抗体或被所述抗体交叉阻断而竞争对klk5、优选人klk5的结合：氨基酸残基leu212、ser213、gln214、lys215、arg216、glu218、asp219、ala220、pro222、gly233、pro269、asn270和pro272，参考seq id no:142，并且所述抗体包含：
[0292]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0293]
2.含有seq id no:38的可变轻链；以及含有seq id no:110的可变重链。
[0294]
在一个实施方案中，此类竞争性抗体具有与含有seq id no:110的序列具有至少80％同一性或相似性的重链可变区；和/或具有与含有seq id no:38的序列具有至少80％同一性或相似性的轻链可变区。
[0295]
与本发明的抗体“竞争”、“交叉阻断”、“被交叉阻断”或“与人klk5上的相同表位结合”(及其任何语法变化)的抗体是指不能与结合本发明的抗体的klk5形成复合物。
[0296]
竞争性抗体可以使用本领域任何合适的方法来鉴定，例如通过使用竞争性elisa或biacore测定，其中竞争性抗体通过交叉阻断或通过被交叉阻断而与klk5结合阻止本发明抗体的结合或相反亦然。此类竞争测定可以使用分离的天然或重组klk5或其合适的融合蛋白/多肽。在一个示例中，使用重组人活性klk5(例如含有seq id no：144)测量竞争。
[0297]
本发明还提供了如本文所述和要求保护的抗体以与klk5形成复合物，其中klk，优选人klk5，与另一种抗体结合(或可以结合)，其中所述另一种抗体包含：
[0298]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:175的cdr-l1、含有seq id no:176的cdr-l2和含有seq id no:177的cdr-l3；所述可变重链包含含有seq id no:178的cdr-h1、含有seq id no:179的cdr-h2和含有seq id no:160的cdr-h3的可变重链；和/或
[0299]
2.含有seq id no:161的可变轻链和含有seq id no:163的可变重链；和/或
[0300]
3.由含有seq id no：162的核苷酸编码的可变轻链和由含有seq id no：164的核苷酸编码的可变重链。
[0301]
在一个实施方案中，根据本发明的抗体结合klk5并且含有：
[0302]
1.可变轻链和可变重链，并且其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16,18,20,22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0303]
2.含有seq id no:30或34或38或42或46的可变轻链；以及含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134、优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134的可变重链；
[0304]
其中该抗体与结合另一种抗体的klk5(优选人klk5)形成复合物，所述另一种抗体包含：
[0305]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:175的cdr-l1、含有seq id no:176的cdr-l2和含有seq id no:177的cdr-l3；所述可变重链包含含有seq id no:178的cdr-h1、含有seq id no:179的cdr-h2和含有seq id no:160的cdr-h3；和/或
[0306]
2.含有seq id no:161的可变轻链和含有seq id no:163的可变重链；和/或
[0307]
3.由含有seq id no：162的核苷酸编码的可变轻链和由含有seq id no：164的核苷酸编码的可变重链。
[0308]
此外，本发明还包括klk5-抗体复合物，其含有：
[0309]
a.klk5，优选人klk5；和
[0310]
b.结合klk5的抗体，其中包含：
[0311]
1.可变轻链和可变重链，并且其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0312]
2.含有seq id no:30或34或38或42或46的可变轻链；以及含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134的可变重链；和
[0313]
c.另一种结合klk5的抗体，其中包含：
[0314]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:175的cdr-l1、含有seq id no:176的cdr-l2和含有seq id no:177的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:178的cdr-h1、含有seq id no:179的cdr-h2和含有seq id no:160的cdr-h3；其中所述抗体任选地是人源化的；和/或
[0315]
2.含有seq id no:161的可变轻链和含有seq id no:163的可变重链；和/或
[0316]
3.由含有seq id no：162的核苷酸编码的可变轻链和由含有seq id no：164的核苷酸编码的可变重链。
[0317]
应当理解，所谓的“另一种抗体”结合klk5，优选人klk5是的表位不同于本文描述的表位并且与其不重叠，如下面的实施例所示。在这方面，此类抗体不相互竞争。
[0318]
根据本发明的抗体可以使用本领域已知的任何合适的方法获得。klk5(包括其融合蛋白，表达klk5的细胞(重组或天然))可用于产生特异性识别klk5的抗体。可以使用如本文所述的各种形式的klk5。
[0319]
在一个实施方案中，所使用的抗原是活性klk5，优选如以下实施例中所述产生。
[0320]
用于免疫宿主的klk5或其片段可以通过本领域熟知的方法从含有表达系统的基因工程化宿主细胞中制备，或者它们可以从天然生物来源中回收。klk5或其片段在一些情况下可以是较大蛋白质的一部分，例如融合蛋白，例如融合至亲和标签或类似物。
[0321]
根据本发明产生的针对klk5的抗体可以在需要对动物进行免疫的情况下通过使用众所周知的常规方案将klk5施用于动物，优选非人类动物来获得，参见例如handbook of experimental immunology,d.m.weir(编),vol 4,blackwell scientific publishers,oxford,england,1986)。许多温血动物，例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪都可以进行免疫接种。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
[0322]
可以使用测量与klk5的结合的测定和/或测量klk5生物活性，优选klk5蛋白酶活性的抑制的测定来进行抗体的筛选。
[0323]
包括单克隆抗体在内的抗体含有酸性和/或碱性官能团，从而使分子带上净正电
荷或负电荷。总“观察到的”电荷量将取决于该实体的绝对氨基酸序列、3d结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pi)是特定分子或其溶剂可接触表面不携带净电荷时的ph值。在一个实例中，根据本发明的结合klk5的单克隆抗体可以被工程化以具有合适的等电点。这可能导致抗体具有更稳健的特性，特别是合适的溶解度和/或稳定性谱和/或改进的纯化特性。
[0324]
因此，在一个实施方案中，结合klk5的单克隆抗体包含：
[0325]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no:30或34或38或42或46；所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0326]
b.含有seq id no：36或40或44或48的轻链；以及含有seq id no:52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136的重链；
[0327]
其中所述单克隆抗体被改造为具有与最初鉴定的抗体不同的等电点。
[0328]
可以例如通过替换氨基酸残基例如用一个或多个碱性氨基酸残基替换酸性氨基酸残基来工程化抗体。或者，可以引入碱性氨基酸残基或去除酸性氨基酸残基。或者，如果分子具有不可接受的高pi值，则可以根据需要引入酸性残基以降低pi。重要的是，在操作pi时，必须注意保持抗体或片段的所需活性。因此，在一个实施方案中，工程化抗体具有与“未修饰”抗体或片段相同或基本相同的活性。
[0329]
诸如**expasy http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html等程序，可用于预测抗体的等电点。
[0330]
应当理解，本发明提供的抗体的亲和力可以使用本领域已知的任何合适的方法来改变。因此，本发明还涉及对klk5，特别是人klk5具有改善的亲和力的抗体变体。此类变体可通过许多亲和力成熟方案获得，包括突变cdr(yang et al.,j.mol.biol.,254,392-403,1995)、链改组(marks et al.,bio/technology,10,779-783,1992)，使用大肠杆菌突变株(low et al.,j.mol.biol.,250,359-368,1996)，dna改组(patten et al.,curr.opin.biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(thompson et al.,j.mol.biol.,256,77-88,1996)和有性pcr(crameri et al.,nature,391,288-291,1998)。
[0331]
如果需要，本发明的抗体可以与一种或多种效应分子缀合。应当理解，效应分子可以含有单个效应分子或者两个或更多个这样的分子，它们的连接方式可以形成单个部分，其可以连接至本发明抗体。在希望获得与效应分子连接的抗体片段的情况下，这可以通过标准化学或重组dna程序制备，其中抗体片段直接或通过偶联剂与效应分子连接。用于将此类效应分子与抗体缀合的技术在本领域中是众所周知的(参见hellstrom等人，controlled drug delivery，第2版，robinson等人编辑，1987，第623-53页；thorpe等人,1982,immunol.rev.,62:119-58和dubowchik等人,1999,pharmacology and therapeutics,83,67-123)。具体的化学程序包括例如在wo 93/06231、wo 92/22583、wo 89/00195、wo 89/01476和wo 03/031581中描述的那些。或者，当效应分子是蛋白质或多肽时，可以使用重组dna程序实现连接，例如如wo 86/01533和ep0392745中所述。
[0332]
如本文所用的术语效应分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白，例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段，例如dna、rna及其片段、放射性核素，特别是放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，例如荧光化合物或可通过nmr或esr光谱检测的化合物。
[0333]
效应分子的例子可以包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。其实例包括康布他汀、多拉司他汀、埃坡霉素、星形孢菌素、美登素、海绵抑菌素、根瘤菌素、软骨素、罗瑞丁、半松素、紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
[0334]
效应分子还包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶地卡巴肼)、烷化剂(例如甲氯乙胺、苯丁酸噻吩嗪、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c和顺式二氯二胺铂(ii)((ddp)顺铂)、蒽环类药物(如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、蒽霉素(amc)、加利车霉素或多卡霉素)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
[0335]
其他效应分子可以包括螯合的放射性核素，例如111in和90y、lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶i抑制剂、紫杉类和苏拉明。
[0336]
其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂合酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆蛋白、蓖麻毒素a、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素，神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活剂、血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管抑制素或内皮抑制素，或生物反应调节剂，例如淋巴因子、白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-2(il-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、神经生长因子(ngf)或其他生长因子和免疫球蛋白。
[0337]
其他效应分子可以包括可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层扫描)和非放射性顺磁性金属离子。关于可与抗体缀合用作诊断的金属离子，一般参见美国专利第4,741,900号。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、亲和素和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括125i、131i、111in和99tc.
[0338]
在另一个实例中，效应分子可以增加抗体在体内的半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体通过上皮屏障向免疫系统的递送。这种类型的合适效应分子的例子包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如wo05/117984中描述的那些。
[0339]
在效应分子是聚合物的情况下，它通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或者支链或非支链多糖，
例如同多糖或杂多糖。
[0340]
可存在于上述合成聚合物上的具体任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
[0341]
合成聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选地取代的聚(乙二醇)如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
[0342]
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0343]
在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。
[0344]
如本文所用，“衍生物”旨在包括反应性衍生物，例如硫醇选择性反应性基团，例如马来酰亚胺等。反应性基团可以直接或通过接头链段与聚合物连接。应当理解，这种基团的残基在某些情况下将形成产物的一部分，作为抗体片段和聚合物之间的连接基团。
[0345]
聚合物的尺寸可以根据需要改变，但通常平均分子量范围为500da至50000da，例如5000至40000da，例如20000至40000da。聚合物尺寸可特别根据产品的预期用途进行选择，例如定位于某些组织如肿瘤或延长循环半衰期的能力(综述参见chapman，2002，advanced drug delivery reviews，54，531-545)。因此，例如，在产品旨在离开循环并穿透组织的情况下，例如用于治疗肿瘤，使用小分子量聚合物可能是有利的，例如具有约5000da的分子量。对于产品保留在循环中的应用，使用较高分子量的聚合物可能是有利的，例如具有20000da至40000da范围内的分子量。
[0346]
合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚(乙二醇)或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且尤其具有约15000da至约40000da范围内的分子量。
[0347]
在一个实例中，根据本发明的抗体连接到聚(乙二醇)(peg)部分。在一个具体实施方案中，根据本发明的抗体和peg分子可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接，例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基。此类氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组dna方法工程化到抗体中(参见例如us5,219,996；us 5,667,425；wo98/25971、wo2008/038024)。在一个实施例中，本发明的抗体是修饰的fab片段，其中修饰是在其重链的c末端添加一个或多个氨基酸以允许效应分子的附着。适当地，所述额外的氨基酸形成修饰的铰链区，该铰链区含有一个或多个半胱氨酸残基，效应分子可以连接到所述半胱氨酸残基上。多个位点可用于连接两个或多个peg分子。
[0348]
合适地，peg分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基基团共价连接。连接至被修饰的抗体片段的每个聚合物分子可共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键通常是二硫键，或特别是硫-碳键。当硫醇基被用作适当活化的效应分子的连接点时，例如可以使用硫醇选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。如上所述，活化的聚合物可用作制备聚合物修饰的抗体片段的起始材料。活化聚合物可以是任何含有硫醇反应基团的聚合物，例如α-卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺，一种酰亚胺，例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物。此类起始材料可商购获得(例如从nektar获得，其前身为shearwater polymers inc.，huntsville，al，usa)或可使用常规化学操作从可商购的起始材料制备。特定的peg分子包括20k甲氧基-peg-胺(可从nektar获得，前身为shearwater；rapp polymere；和sunbio)和m-peg-spa(可从nektar获得，前身为shearwater)。
[0349]
在一个实施方案中，所述抗体是修饰的fab片段、fab'片段或difab，其是peg化的，即具有与其共价连接的peg(聚(乙二醇))，例如根据在ep0948544或ep1090037中公开的方
法(也参见“poly(ethyleneglycol)chemistry,biotechnical and biomedical applications”,1992,j.milton harris(ed),plenum press,new york,“poly(ethyleneglycol)chemistry and biological applications”，1997年，j.milton harris和s.zalipsky(编辑)，美国化学学会，华盛顿特区和“bioconjugation protein coupling techniques for the biomedical sciences”，1998年，m.aslam和a.dent，grove出版社，纽约；chapman,a.2002,advanced drug delivery reviews 2002,54:531-545)。在一个实例中，peg连接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，peg修饰的fab片段具有与经修饰的铰链区中的单个硫醇基团共价连接的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可以与马来酰亚胺基团共价连接，并且赖氨酸残基上的每个胺基团可以连接分子量约为20,000da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，连接到fab片段的peg的总分子量可能约为40,000da。
[0350]
具体的peg分子包括n,n'-双(甲氧基聚(乙二醇)mw20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(n-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙基酰胺，也称为peg2mal40k(可从nektar获得，前身为shearwater)。
[0351]
peg接头的替代来源包括nof，其供应gl2-400ma3(其中以下结构中的m为5)和gl2-400ma(其中m为2)，n约为450：
[0352][0353]
因此，在一个实施方案中，peg是2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-马来酰亚胺-1-氧代己基)氨基]丙氧基}己烷(2臂支链peg，-ch2)3nhco(ch2)5-mal，mw 40,000，称为sunbright gl2-400ma3。
[0354]
可从dr.reddy、nof和jenkem处获得以下类型的其他替代peg效应分子：
[0355][0356]
在一个实施方案中，根据本发明的fab或fab'与peg分子缀合。
[0357]
在一个实施方案中，本公开提供了一种fab'peg分子，其含有一个或多个peg聚合物，例如1或2个聚合物，例如40kda的一个或多个聚合物。
[0358]
根据本公开的fab'-peg分子可能是特别有利的，因为它们具有独立于fc片段的半衰期。在一个实施方案中，提供了与聚合物例如peg分子、淀粉分子或白蛋白分子缀合的fab'。在一个实施方案中，提供了与聚合物例如peg分子、淀粉分子或白蛋白分子缀合的
scfv。在一个实施方案中，根据本公开的fab或fab'与人血清白蛋白缀合。在一个实施方案中，所述抗体或片段与淀粉分子缀合，例如以增加半衰期。us 8,017,739中描述了将淀粉与蛋白质缀合的方法，该专利以引用的方式并入本文。
[0359]
本发明还提供了编码根据本发明的抗体的分离的多核苷酸。根据本发明的分离的多核苷酸可以含有合成的dna(例如通过化学加工产生的)、cdna、基因组dna或其任何组合。
[0360]
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明抗体的dna序列。可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成所需的dna序列。可酌情使用定点诱变和聚合酶链式反应(pcr)技术。
[0361]
在一个实施方案中，根据本发明的分离的多核苷酸编码：
[0362]
a.轻链可变区，其中所述多核苷酸：
[0363]
i.与seq id no:31或35或39或43或47至少90％相同；或者
[0364]
ii.含有seq id no：31或35或39或43或47；或者
[0365]
iii.基本上由seq id no:31或35或39或43或47组成；
[0366]
b.重链可变区，其中所述多核苷酸：
[0367]
i.与seq id no：33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135至少90％相同；或者
[0368]
ii.含有seq id no：33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135；或者
[0369]
iii.基本上由seq id no：33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135组成；
[0370]
c.轻链，其中所述多核苷酸：
[0371]
i.与seq id no:37或41或45或49至少90％相同；或者
[0372]
ii.含有seq id no:37或41或45或49；或者
[0373]
iii.基本上由seq id no:37或41或45或49组成；
[0374]
d.重链，其中所述多核苷酸：
[0375]
i.与seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137至少90％相同；或者
[0376]
ii.含有seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137；或者
[0377]
iii.基本上由seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137组成。
[0378]
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体fab'片段或igg1或igg4抗体的可变重链，其含有在seq id no:33或51或55或59或63或67或71或75或79或83或87或91或95或99或103或107或111或115或119或123或127或131或135中给出的序列。还提供了编码本发明的抗体fab'片段或igg1或igg4抗体的可变轻链的分离的多核苷酸，其含有在seq id no:31或35或39或43或47中给出的序列。
[0379]
在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的igg4(p)抗体的重链和轻链的分离的多核苷酸，其中编码重链的多核苷酸含有在seq id no：53或57或61或65或69或73或77或81或85或89或93或97或101或105或109或113或117或121或125或129或133或137中给
出的序列，并且编码轻链的多核苷酸含有在seq id no:37或41或45或49中给出的序列。
[0380]
本发明还提供了含有本文所述的一种或多种多核苷酸的克隆或表达载体。在一个实施例中，根据本发明的克隆或表达载体含有一种或多种分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有选自seq id no：31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135或137的序列。
[0381]
可以用于构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员熟知的。在这方面，参考“current protocols in molecular biology”,1999,f.m.ausubel编,wiley interscience,new york和cold spring harbor publishing出版的the maniatis manual。
[0382]
还提供了含有根据本发明的一种或多种分离的多核苷酸序列的宿主细胞，或者含有编码本发明抗体的一种或多种分离的多核苷酸序列的一种或多种克隆或表达载体。任何合适的宿主细胞/载体系统都可以用于表达编码本发明抗体的多核苷酸序列。可以使用细菌(例如大肠杆菌)和其他微生物系统，或者也可以使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括cho、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
[0383]
用于本发明的合适类型的中国仓鼠卵巢(cho细胞)可以包括cho和cho-k1细胞，包括dhfr-cho细胞，例如cho-dg44细胞和cho-dxb11细胞，其可以与dhfr可选择标记一起使用，或chok1-sv细胞，其可与谷氨酰胺合成酶选择标记一起使用。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞系，例如nso骨髓瘤细胞和sp2细胞、cos细胞。可以用根据本发明的分离的多核苷酸序列或表达载体稳定地转化或转染宿主细胞。
[0384]
在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞是用含有本发明的分离的多核苷酸序列、优选地包含含有seq id no：31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135或137的分离的多核苷酸序列的表达载体稳定转染的cho-dg44细胞。
[0385]
本发明还提供了用于产生结合klk5的本发明抗体的方法，包括在适合产生单克隆抗体的条件下培养根据本发明的宿主细胞并分离如此产生的单克隆抗体。
[0386]
抗体可以仅含有重链或轻链，在这种情况下仅需要使用重链或轻链多核苷酸序列来转染宿主细胞。为了产生含有重链和轻链的抗体，可以用两种载体转染细胞系，第一种载体编码轻链，第二种载体编码重链。或者，可以使用单一载体，该载体含有编码轻链和重链的多核苷酸序列。
[0387]
因此，提供了一种用于培养宿主细胞并表达抗体、分离后者并任选地对其进行纯化以提供分离的抗体的方法。因此，在一个实施方案中，提供了一种分离的结合klk5、优选人klk5的单克隆抗体，例如人源化单克隆抗体，特别是根据本发明的抗体，其基本上纯化自、特别是不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白或dna，其中所述单克隆抗体结合klk，优选人klk5，并且含有：
[0388]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至
29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0389]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链1含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0390]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0391]
基本上不含内毒素通常是指内毒素含量为每毫克抗体产品1eu或更少，例如每毫克产品0.5或0.1eu。
[0392]
基本上不含宿主细胞蛋白质或dna通常意指宿主细胞蛋白质和/或dna含量为400μg/mg抗体产物或更少，例如100μg/mg或更少，特别是20μg/mg，视情况而定。
[0393]
由于本发明的抗体可用于治疗、诊断和/或预防病理状况，本发明还提供了药物或诊断组合物，其含有根据本发明的抗体与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合。
[0394]
优选地，所述药物或诊断组合物含有结合klk5、优选人klk5的抗体，并且其含有：
[0395]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0396]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0397]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0398]
在一个实施方案中，根据本发明的抗体是唯一的活性成分。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体与一种或多种额外的活性成分组合。或者，所述药物组合物含有根据本发明的抗体作为唯一活性成分，并且它可以与其他治疗剂、诊断剂或姑息剂组合(例如同时、顺序或分开)单独施用于患者。
[0399]
在另一个实施方案中，所述药物组合物含有结合klk5、优选人klk5的抗体，其中含有：
[0400]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3，并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0401]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0402]
c.所述单克隆抗体是含有轻链和重链的全长抗体，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136；
[0403]
以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0404]
优选地，所述药物组合物含有结合klk5的抗体，其中所述抗体结合klk5，优选人klk5，并且该抗体含有seq id no:38的轻链可变区和seq id no:110的重链可变区。
[0405]
根据本发明的药物组合物可以适当地施用于患者以确定所需的治疗有效量。如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防被靶向的疾病或病症或者表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可以在细胞培养试验或动物模型中(通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)估计治疗有效量。动物模型也可用于确定合适的浓度范围和给药途径。然后可以使用此类信息来确定用于人类给药的有用剂量和途径。
[0406]
人类受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/响应。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，例如100mg/kg。药物组合物可以方便地以单位剂量形式提供，每剂量含有预定量的本发明的活性剂。
[0407]
治疗组合物中的药学上可接受的载体可以另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂或ph缓冲物质，可存在于此类组合物中。这样的载体能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以供患者摄取。
[0408]
适合给药的形式包括适合肠胃外给药的形式，例如通过注射或输注，例如通过推注或连续输注，以静脉内、可吸入或皮下形式。当产品用于注射或输注时，它可以采用油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且它可以含有配方剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，根据本发明的抗体可以是干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。也可以制备适合在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。
[0409]
一旦配制，本发明的组合物可以直接施用于受试者。因此，本文提供了根据本发明的抗体用于制备药物的用途。
[0410]
优选地，根据本发明的药物组合物适合施用于人类受试者。
[0411]
因此，在另一个方面，本发明提供了结合klk5、优选人klk5的单克隆抗体，其中包含：
[0412]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:
10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0413]
b.可变轻链和可变重链，所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0414]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0415]
在一个优选的实施方案中，结合klk5、优选人klk5的所述单克隆抗体包含：
[0416]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0417]
2.含有seq id no:38的可变轻链；以及含有seq id no:110的可变重链；或者
[0418]
3.含有seq id no:40的轻链和含有seq id no:112的重链。
[0419]
特别地，在治疗中的用途包括在治疗一种或多种以klk5失调或klk5的抑制失调为特征的疾病中的用途。
[0420]
在另一个方面，本发明提供了治疗患者中特征在于klk5失调或klk5抑制的失调的一种或多种疾病的方法，其中包括向所述患者施用治疗有效量的结合klk5的单克隆抗体，其中所述抗体结合klk5，优选人klk5，并且含有：
[0421]
a.可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0422]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0423]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0424]
在另一方面，结合klk5、优选人klk5的所述单克隆抗体，或含有所述单克隆抗体的药物组合物，其中所述单克隆抗体或所述组合物用于治疗以klk5失调或klk5的抑制失调为特征的一种或多种疾病，其中所述抗体包含：
[0425]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0426]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变了含有seq id no：30或34或38或42或46；并且随时可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0427]
c.轻链和重链，其中随时轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且随时重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0428]
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种在患者中治疗以klk5失调或klk5抑制的失调为特征的一种或多种疾病的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的结合klk5、优选地人类klk5的抗体，其中所述抗体包含：
[0429]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0430]
2.含有seq id no:38的可变轻链；以及含有seq id no:110的可变重链；或者
[0431]
3.含有seq id no:40的轻链和含有seq id no:112的重链。
[0432]
在另一个优选的实施方案中，结合klk5、优选人klk5的所述单克隆抗体，或含有该单克隆抗体的药物组合物，其中该抗体或药物组合物用于治疗特征为klk5失调或klk5抑制的失调的一种或多种疾病，其中所述抗体包含：
[0433]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0434]
2.含有seq id no:38的可变轻链；以及含有seq id no:110的可变重链；或者
[0435]
3.含有seq id no:40的轻链和含有seq id no:112的重链。
[0436]
优选地，以klk5失调或klk5抑制的失调为特征的所述一种或多种疾病选自netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌或其组合。
[0437]
因此，本发明提供了在患者中治疗netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌或其组合的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的结合klk5、优选人klk5的单克隆抗体，或含有所述单克隆抗体的药物组合物，其中所述抗体或药物组合物包含：
[0438]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0439]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；并且所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0440]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0441]
更优选地，该方法用于治疗netherton综合征和/或特应性皮炎。
[0442]
在另一方面，提供结合klk5、优选人klk5的单克隆抗体，或含有所述单克隆抗体的药物组合物，其中所述抗体或药物组合物用于治疗netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌，或其组合，并且其中所述单克隆抗体或药物组合物含有：
[0443]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0444]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；并且所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0445]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0446]
更优选地，该抗体用于治疗netherton综合征和/或特应性皮炎。
[0447]
在另一个优选实施方案中，本发明提供了一种在患者中治疗netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症(例如卵巢癌或膀胱癌)或其组合的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的结合klk5、优选人klk5的抗体，或含有所述单克隆抗体的药物组合物，其中所述抗体或药物组合物包含：
[0448]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0449]
2.含有seq id no:38的可变轻链；以及含有seq id no:110的可变重链；或者
[0450]
3.含有seq id no:40的轻链和含有seq id no:112的重链。
[0451]
更优选地，该方法用于治疗netherton综合征和/或特应性皮炎。
[0452]
在另一个优选的实施方案中，结合klk5、优选人klk5的抗体，或含有所述单克隆抗体的药物组合物，其中所述抗体或药物组合物用于治疗netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌，或其组合，其中所述抗体或药物组合物包含：
[0453]
1.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:7的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:23的cdr-h3；或者
[0454]
2.含有seq id no:38的可变轻链；以及含有seq id no:110的可变重链；或者
[0455]
3.含有seq id no:40的轻链和含有seq id no:112的重链。
[0456]
更优选地，该抗体用于治疗netherton综合征和/或特应性皮炎。
[0457]
或者，本发明还提供了结合klk5、优选人klk5的抗体或含有所述单克隆抗体的药物组合物的用途，其中所述抗体或药物组合物用于制备用于治疗特征在于klk5的失调或klk5抑制的失调的一种或多种疾病的药物，其中这种失调优选为netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌，或其组合，更优选netherton综合征和/或特应性皮炎，其中所述抗体包含：
[0458]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0459]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0460]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0461]
本发明还提供了结合klk5的抗体的用途，其中所述抗体结合klk5，优选人klk5，其作为诊断活性剂或用于诊断测定中，例如用于诊断netherton综合征、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌。
[0462]
更优选地，所述单克隆抗体包含：
[0463]
a.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0464]
b.可变轻链和可变重链，其中所述可变轻链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0465]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0466]
诊断可以优选地在生物样品上进行。“生物样本”包括从个体获得的多种样本类型，可用于诊断或监测分析。该定义包括血液，例如血浆和血清，以及生物来源的其他液体样品，例如尿液和唾液、脑脊液、实体组织样品，例如活检标本，例如皮肤活检或组织培养物
或源自其的细胞及其后代。该定义还包括在采购后以任何方式处理过的样本，例如通过试剂处理、溶解或对某些成分(如多核苷酸)进行富集。
[0467]
诊断测试可以优选地在不与人体或动物体接触的生物样品上进行。这种诊断测试也称为体外测试。体外诊断测试可依赖于检测已经获自个体的生物样品中的klk5的体外方法，包括以下步骤：i)将生物样品与本文所述的抗体接触；ii)检测抗体与klk5的结合。通过将检测到的klk5水平或klk5的特定翻译后修饰形式(包括任何前体)的存在与合适的对照进行比较，可以鉴定以klk5失调或klk5抑制的失调为特征的一种或多种疾病。因此，这种检测方法可用于确定受试者(包括胚胎或胎儿)是否患有或有患上以klk5失调或klk5抑制的失调为特征的疾病。
[0468]
因此，本发明提供了结合klk5的抗体，其中该抗体结合klk5，优选人klk5，其中该抗体用于诊断以klk5失调或klk5抑制的失调为特征的一种或多种疾病，优选用于诊断netherton综合症、特应性皮炎、鱼鳞病、酒渣鼻、哮喘或癌症，例如卵巢癌或膀胱癌，其中所述抗体包含：
[0469]
a.可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含含有seq id no:1或7或8或9的cdr-l1、含有seq id no:2的cdr-l2和含有seq id no:3的cdr-l3；并且所述可变重链包含含有seq id no:4的cdr-h1、含有seq id no:5的cdr-h2和含有seq id no:6或seq id no:10至29中任一个、优选10、11、13至16、18、20、22至25、27或29的cdr-h3；或者
[0470]
b.可变轻链和可变重链，所述可变重链含有seq id no：30或34或38或42或46；以及所述可变重链含有seq id no:32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或102或106或110或114或118或122或126或130或134，优选32或50或54或58或62或66或70或74或78或82或86或90或94或98或106或110或114或118或126或134；或者
[0471]
c.轻链和重链，其中所述轻链含有seq id no:36或40或44或48；并且所述重链含有seq id no：52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或104或108或112或116或120或124或128或132或136，优选52或56或60或64或68或72或76或80或84或88或92或96或100或108或112或116或120或128或136。
[0472]
本发明包括的序列如表1所示：
[0473]
表1
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483]
[0484]
[0485]
[0486]
[0487]
[0488]
[0489]
[0490]
[0491]
[0492]
[0493]
[0494]
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500]
[0501]
[0502]
[0503]
[0504]
[0505]
[0506][0507]
现在将参照附图中所示的实施例通过示例进一步描述本发明。
实施例
[0508]
实施例1：激肽释放酶蛋白和lekti结构域的克隆、表达和纯化
[0509]
使用hindiii/ecori位点将编码根据seq id no：142的蛋白质的优化的核苷酸序列克隆到内部哺乳动物表达载体中，产生编码没有标签的人klk5蛋白质的载体。
[0510]
类似地克隆小鼠和食蟹猴(cyno)klk5序列以能够产生这些分别含有seq id no：150和151的蛋白质的活性形式。
[0511]
克隆和表达分别含有残基292-353和490-558(根据uniprot中的编号)的人lekti(uniprot q9nq38)的结构域5(d5)和结构域8(d8)，以用作体外试验中的参考蛋白.
[0512]
均针对哺乳动物细胞中的表达进行了优化的人类lekti结构域5和结构域8核苷酸序列使用hindiii/xhoi位点分别克隆到编码兔fc标签的内部哺乳动物表达载体中，生成编码具有c端兔fc标签的lekti结构域5序列(seq id no:145)或具有c端兔fc标签的lekti结构域8序列(seq id no:152)的载体序列。编码的蛋白质将分别称为lekti d5兔fc和lekti d8兔fc。
[0513]
klk5、lekti结构域5和lekti结构域8兔fc融合蛋白按照制造商的方案使用expi293
tm
表达系统(life technologies
tm
)通过瞬时转染表达。在表达期间，klk5自动激活以在上清液中产生活性klk5(含有seq id no:144或seq id no:142的残基i67-s293)。转染后5天收获细胞，上清液立即用于纯化。用缓冲液a(50mm tris ph 7.0,50mm nacl)将含有人(或小鼠或食蟹猴)活性klk5的上清液稀释4倍并加载到hitrap sp hp阳离子交换柱上。使用利用缓冲液a(50mm tris ph 7.0,50mm nacl)和缓冲液b(50mm tris ph 7.0,1m nacl)在总共10个柱体积上产生的盐梯度洗脱结合的蛋白质。将含有纯化的人(或小鼠或食蟹猴)活性klk5的级分合并、浓缩，并在s200 26/60柱上通过尺寸排阻色谱法进一步纯化，该柱已用ph 7.2的20mm tris、150mm nacl、5％甘油平衡。sds-page分析表明蛋白质在表达过程中经历了糖基化。通过质谱分析得到预期的分子量。
[0514]
首先对含有人lekti d5兔fc融合蛋白(根据seq id no：145)的上清液进行蛋白a亲和层析。将上清液上样到5ml hitrap
tm
蛋白a柱上。结合的蛋白质用1m柠檬酸缓冲液，ph 2.0洗脱，级分用2mtris-hcl ph 8.5中和。将含有lekti d5兔fc融合蛋白的级分合并、浓缩并使用已用pbs平衡的s200 26/60柱通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。然后合并并浓缩含有人lekti d5兔fc融合蛋白的级分。lekti d8兔fc融合蛋白(根据seq id no：152)类似地从转染的细胞培养上清液中纯化。
[0515]
表达并通过阳离子交换色谱法纯化lekti d5 fab融合分子(根据seq id no：169和170)。将在5'和3'末端侧接编码gly4ser接头的序列的lekti结构域5核苷酸序列整合到白蛋白特异性fab的重链序列的框架3中(如wo2020011868中所述，通过引用并入本文)；编码10xhis序列的标签也放置在fab h链的3'端。lekti d5 fab融合重链针对在哺乳动物细胞中的表达进行了优化，克隆到内部表达载体中，并与适当的轻链共转染(后者也针对哺乳动物中的表达进行了优化)在cho sxe细胞中。转染的细胞在通风烧瓶中于32℃培养13天。收获上清液、浓缩和缓冲液交换到20mm tris、50mm nacl、ph7.0中，然后上样到sp sepharose hp柱。使用缓冲液a(20mm tris ph 7.0,50mm nacl)和缓冲液b(20mm tris ph 7.0,1m nacl)用在总共10个柱体积上产生的盐梯度洗脱结合的蛋白质。合并含有lekti d5 fab融合物的级分，并使用用pbs ph 7.4平衡的s200柱通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。合
并相关级分。
[0516]
编码全长klk7的人和食蟹猴核苷酸序列以与人klk5相似的方式表达，产生pro-klk7(分别含有seq id no：146和148)。与klk5不同，klk7在表达期间不会自动激活，因此人、小鼠和食蟹猴klk7的活性形式(分别含有seq id no:147、186和149)是通过使用嗜热菌蛋白酶从纯化的蛋白质切割原肽序列而产生的。在活化缓冲液(50mm tris ph 7.5、10mm cacl2、150mm nacl、0.05％brij 35)中将人、小鼠或食蟹猴pro-klk7(分别含有seq id no:146、185和148)稀释至1mg/ml。将来自sigma
tm
的嗜热菌蛋白酶(25mg)重悬于25ml消化缓冲液(50mm tris ph 8.0,0.5mm cacl2)中，以1:10的比例加入到各自的klk7蛋白中，在37℃下放置45分钟，然后与阴离子交换deae树脂(ge life sciences
tm
)混合以结合并去除嗜热菌蛋白酶。收集流出液作为活性(人、小鼠或食蟹猴)klk7。
[0517]
将人、小鼠和食蟹猴klk7的活性形式缓冲液交换到50mm tris ph7.5、150mm nacl、5％甘油、1mm edta中并浓缩至约3.2mg/ml。
[0518]
人klk2作为活性蛋白来自r&d systems
tm
(目录号4104-se-010)。
[0519]
人klk4作为前体形式来源于r&d systems
tm
(catalog#1719-se)，并如下激活。人pro-klk4在50mm tris、10mm cacl2、150mm nacl、ph 7.5中稀释至200μg/ml，来自r&d systems
tm
(目录号3097-zn)的细菌嗜热菌蛋白酶在相同缓冲液中稀释至2μg/ml。将等体积的前人klk4和嗜热菌蛋白酶组合并在室温下孵育10分钟以允许活化。用edta至终浓度为10mm以终止反应。
[0520]
实施例2：通过klk5免疫产生抗体
[0521]
雌性新西兰白兔(》2kg)用100μg的0.4mg/ml人活性klk5和人活性klk7(根据实施例1表达)与等体积的完全弗氏佐剂(sigma
tm
)混合进行皮下免疫。动物每隔21天接受一次加强注射，包括100μg相同的免疫原混合在等体积的不完全弗氏佐剂(sigma
tm
)中。在最后一次加强免疫后14天终止，此时制备脾、骨髓和外周血单核细胞(pbmc)的单细胞悬液并在胎牛血清(fcs)中的10％二甲亚砜(dmso)中于-80℃冷冻。
[0522]
使用类似于tickle等人，2015j biomol screen:20(4),492-497所述的方法制备b细胞培养物。简而言之，将来自免疫动物的淋巴结细胞、脾细胞或外周血单核细胞(pbmc)以每孔2000个细胞的密度在带有200μl/孔rpmi 1640培养基(gibco
tm
)的条形码96孔组织培养板中培养，所述培养基中补充了10％fcs(sigma aldrich
tm
)、2％hepes溶液(sigma aldrich
tm
)、2％l-谷氨酰胺溶液(gibco
tm
)、1％青霉素/链霉素溶液(gibco
tm
)、0.2％normocin(invivogen
tm
)、0.1％β-巯基乙醇(gibco
tm
)，并在存在或不存在b细胞刺激上清液(bss)的情况下使用表达cd40l和il-2的饲养细胞。bss是通过在有丝分裂剂phorbol-12-myristate-13-acetate(pma)和植物血凝素-l(pha-l)存在下培养pbmc 6天，然后收获上清液而产生的。将板在37℃和5％co2下孵育六天。使用来自所有免疫动物的b细胞建立培养物，总共筛选了大约1x109个b细胞。
[0523]
六天后，使用涂布有生物素化的人klk5作为靶抗原来源的sol-r2链霉亲和素珠(ttp labtech
tm
)，通过多重均相基于荧光的结合测定筛选上清液对人klk5(如实施例1中产生的)的结合，并且涂布有相关klk7的sol-r4链霉亲和素珠(ttp labtech
tm
)用于负筛选。与供应商的方案相比使用5倍摩尔浓度过量的蛋白质，利用lightning-link rapid biotin type b(expedeon
tm
)对蛋白质进行生物素化，以避免对所有赖氨酸残基进行完全修饰。使用
pcr获得单细胞的cdna，随后使用免疫球蛋白基因特异性引物对重链和轻链的可变免疫球蛋白序列进行pcr，然后进行嵌套式pcr，引入重叠载体位点，以便将可变区直接克隆到兔igg(vh)或兔kappa(vl)哺乳动物表达载体中。使用expifectamine
tm
(life technologies
tm
)将重链和轻链构建体共转染到expihek-293细胞中，在125ml erlenmeyer
tm
烧瓶中在30ml体积内表达重组抗体。培养5-7天后，收集上清液，并使用akta纯层析系统通过蛋白a亲和捕获纯化抗体。将1ml protein a hitrap mabselect sure柱(ge healthcare)连接到系统上，并在pbs ph 7.4中平衡柱子，然后以0.25ml/min的流速将细胞培养上清液施加到柱子。然后用ph7.4的pbs洗涤柱子，用柠檬酸钠ph3.4洗脱结合的物质并用适当体积的的2mtris-hcl ph 8.5中和。将洗脱的级分经缓冲液交换到pbs(sigma)ph7.4中，并通过0.22μm过滤器。最终纯化的材料通过a280扫描、se-uplc(beh200方法)以及使用pts endosafe系统针对内毒素进行分析。
[0533]
从该分析中，兔抗体10236和10273显示出强效的抑制作用，选择它们用于进一步表征。
[0534]
实施例4：klk5特异性抑制性抗体的鉴定
[0535]
然后筛选纯化的兔抗体10236和10273以确认它们对klk5的抑制活性，并通过使用一组人序列激肽释放酶家族成员(包括klk2、klk4和klk7)以及鼠和食蟹猴klk5和klk7来确定对klk5的特异性。使用beckman coulter fx
tm
和multidrop system，对每种抗体制备600nm至20pm范围的10点半对数稀释系列，并将5ul转移至黑色384孔测定板(corning
tm
，目录号3575)。将15μl活性重组激肽释放酶蛋白添加到相关孔中，以获得分析缓冲液a(50mm tris、150mm nacl、200μm edta、0.05％(v/v)tween-20、ph 7.6)中的以下最终测定浓度：60pm hu klk5、250pm hu klk7、500pm hu klk2、30pm hu klk4、30pm cyno klk5、500pm cyno klk7、30pm小鼠klk5或10nm小鼠klk7。作为对照，将20μl检测缓冲液a添加到孔中作为0％活性，这是抑制的阳性对照，并且使用相同抗体浓度范围的lekti d5兔fc，并使用5μl检测缓冲a中的15μl人klk5作为100％活性。将板在室温下孵育过夜，然后使用多滴加装置添加以下肽底物：boc-vpr-amc(cambridge research biochemicals
tm
)用于人klk5(300μm)、人klk2(30μm)、鼠klk5(300μm)和食蟹猴klk5(450μm)；khlf-amc(cambridge research biochemicals
tm
)用于人和cyno klk7(分别为90μm和150μm)，pfr-amc(r&d systems
tm
)用于人klk4(200μm)，并且mca-rpkpve-nval-wrk(dnp)-nh2(r&d systems
tm
)用于鼠klk7(150μm)。将样品孵育4小时并在pherastar fsx读板机(bmg labtech
tm
)上在λ
ex
380nm和λ
em
430nm处读取boc-vpr-amc、pfr-amc和khlf-amc的读数；在λ
ex
320 nm和λ
em
400 nm处读取mca-rpkpve-nval-wrk(dnp)-nh2的读数。如实施例3所述分析数据以确定抑制百分比。将数据与测试抗体的浓度作图，拟合4参数s形曲线以确定ic50(genedata screener
tm
)。
[0536]
除了兔抗体10236之外，对于该测量，将抗体10236和10273的兔可变区的多核苷酸序列克隆到包含s171c突变的小鼠c kappa载体的修饰版本上，以重建兔vk轻链中发现的、在小鼠恒定区中不存在的额外二硫键(兔抗体10273migg为seq id no:155和156，兔抗体10236migg为seq id no:159和160)。这导致包含seq id no:157和158的抗体(对于兔抗体10236migg)以及包含seq id no:153和154的抗体(对于兔抗体10273migg)。
[0537]
兔抗体10236和10273migg显示对人klk5的有效抑制，但对测试的其他人家族成员(人klk2、4和7)没有活性(即低于实施例2中的选择标准的40％阈值)。还证明了对食蟹猴
proteinase-activated receptors(pars).biol chem,387(2006),第817-824页)。这导致nfkb驱动的炎症级联反应和相关细胞因子如tslp的释放。
[0551]
由于par2是gq偶联的g蛋白偶联受体(gpcr)，因此激活会导致磷脂酶信号传导和肌醇单磷酸(ip-1)的产生。通过使用来自cisbio的检测试剂盒检测ip1来监测通过暴露于重组klk5而对hacat角质形成细胞上表达的内源性par2的激活。
[0552]
收获汇合的hacat细胞并以10,000个细胞/孔接种在384fluoblock板(corning
tm
)中，并在dmem培养基 10％fbs 2mm l-谷氨酰胺 pen/strep(life technologies
tm
)中于37℃、5％co2下培养过夜，然后根据ip-one gq assay方案(cisbio
tm
)对它们进行处理。待测抗体在1x stimulation buffer b(ip-one gq assay kit，cisbio
tm
)中从最高浓度2μm连续稀释，并在200nm人重组klk5存在下在37℃下孵育1小时。将抗体/klk5混合物添加到hacat细胞中，并按照ip-one gq测定方案检测肌醇1磷酸(ip1)，在synergy neo读板器上读取665nm和620nm的荧光读数。
[0553]
抗体10273能够几乎完全抑制经klk5处理的hacat细胞的ip1释放(图1)，显示出类似的最大ip1释放抑制作用，但与lekti蛋白相比表现出更强的效力。
[0554]
抗体10273的作用机制
[0555]
非竞争性酶抑制剂降低酶的活性，但在存在或不存在底物的情况下能够同样良好地结合酶。抑制剂和底物都能够同时结合酶，但不能形成裂解产物，导致酶-底物-抑制剂复合物只能分解成酶-底物或酶-抑制剂复合物。使用非竞争性抑制剂时，抑制率不受底物浓度增加的影响。
[0556]
制备抗体10273或lekti-d5 fc蛋白在测定缓冲液(150mm nacl、50mm tris、200μm edta、0.05％(v/v)tween-20、ph 7.6)中的溶液，浓度是针对klk5的ic50值(见上文)的300、30或3倍。将10μl抗体添加到corning低结合黑色低法兰384孔测定板中。将30mm
–
300μm boc-vpr-amc(cambridge research biochemicals
tm
)的5点系列稀释液10μl添加到平板中。通过注射10μl 1.8nm klk5(boc-vpr-amc《1mm)或180pm klk5(boc-vpr-amc》1mm)，使用pherastar fsx读板器(bmg labtech
tm
)同时启动反应，每30秒监测一次荧光(λex380nmλem430nm)。最终反应条件包含其浓度为测定的针对klk5的ic50值(如上所述)的100、10或1倍的抗体10273或lekti-d5 fc蛋白，在10mm和100μm之间的boc-vpr-amc的连续稀释液，以及60或600pm的klk5。通过用测定缓冲液替换抗体或klk5来制备阴性对照。
[0557]
通过减去每个时间点的背景荧光并将荧光对时间作图来分析数据。将数据拟合以下公式(graphpadgraphpad software)：
[0558][0559]
这使得能够确定k
obs
，观察到的时间依赖性抑制率，其中vi是初始反应速率，vs是最终速率。将k
obs
的值对速底物浓度作图以确定抑制机制(图2)。
[0560]
抗体10273对klk5的抑制率随着底物浓度的增加没有变化，这表明抗体10273是klk5的非竞争性抑制剂(图2a)。lekti-d5 fc蛋白显示出抑制率随着底物浓度的增加而降低，表明了竞争性作用机制(图2b)。
[0561]
在抗体10273存在下lekti与klk5的结合
[0562]
进行表面等离子体共振(spr)实验以确定抗体10273是否与lekti d5蛋白竞争结合人klk5。这些测定能够比较lekti d5 fab融合物对单独的klk5蛋白的亲和力与对和抗体10273复合的人klk5的亲和力。
[0563]
使用biacore t200(ge life sciences
tm
)获得lekti d5fab融合蛋白与人klk5结合的动力学测量。为了准备表面，cm5芯片(ge life sciences
tm
)首先通过5分钟注入edc/nhs(ge life sciences
tm
)混合物(30μl min-1
)，然后注入100μg ml-1
lekti d5 fab融合蛋白(ucb)在醋酸盐缓冲液ph 5.0中(ge life sciencestm)中的溶液进行激活，以在芯片表面实现80ru固定化lekti d5 fab融合蛋白。最后，使用1m乙醇胺盐酸盐-naoh ph 8.5的注射来使表面失活。然后以单循环动力学模式注射hbs-ep缓冲液(ge life sciences
tm
)中浓度从0.32到32nm的人klk5。从klk5注射获得的值中减去仅缓冲液注射产生的值，并通过在biacore评估软件(ge life sciences
tm
)中拟合1:1结合模型确定动力学。
[0564]
为了确定当人klk5与兔抗体10273结合时人lekti是否能够结合人klk5，使用山羊抗兔fc多克隆和如实施例4中所述捕获的ab 10273制备抗体捕获表面。然后将20nm人klk5注入直到表面达到饱和。然后以30pm和100nm之间的浓度注射lekti d5 fab融合蛋白(如实施例1中所述产生)。在biacore
tm
评估软件(ge life sciences
tm
)中拟合1:1结合动力学模型之前，首先从使用分析物获得的值中减去仅缓冲液注射的值。
[0565]
作为参考，在监测与人类klk5的相互作用之前，将lekti d5fab融合蛋白固定在芯片表面。当人klk5已经与兔抗体10273复合时，人lekti d5 fab融合蛋白能够以19.7nm的亲和力结合人klk5(表4)。虽然在没有兔抗体10273的情况下人lekti对人klk5的亲和力更高(40pm)，但该分析表明，通过在人lekti存在或不存在的情况下结合人klk5，兔抗体10273可以对人klk5提供额外的抑制活性。
[0566]
表4
[0567] ka(ms^-1)kd(s^-1)kd(m)仅人klk55.70e 052.30e-054.00e-1110273 人klk52.87e 045.65e-041.34e-08*
[0568]
*平均值n＝2
[0569]
lekti-klk5-抗体10273复合物形成
[0570]
在hek293细胞中作为具有n端tev可切割的8xhis标签的分泌蛋白产生klk5。首先通过ni
2
亲和层析从条件培养基中纯化所述蛋白质。将含有klk5的来自ni
2
柱的级分汇集并用tev蛋白酶消化以去除his标签，然后进行第二个ni亲和步骤以去除tev蛋白酶，使切割的klk5流过柱子。将来自第二个ni
2
柱的流过级分浓缩并在50mm tris ph 7、50mm nacl、1mm edta、5％甘油中在尺寸排阻柱上运行。汇集来自sec的klk5级分并浓缩至约10mg/ml，储存在-80℃。
[0571]
在hek293细胞中以具有c端tev可切割fc标签的分泌蛋白形式产生根据seq id no:173的lekti结构域5(lekti d5 fc tev)和根据seq id no:174的lekti结构域8(lekti d8 fc tev)。将条件培养基通过蛋白a珠子来纯化这些蛋白质。用0.1m柠檬酸，ph2.0洗脱结合的蛋白质，并通过添加2m tris-hcl，ph 8.5中和级分。合并来自蛋白a柱的含有lekti结构域5或结构域8的级分，并用tev蛋白酶去除fc标签，得到lekti d5或lekti d8。将切割的蛋白质浓缩至～15mg/ml，用于尺寸排阻色谱。在pbs，ph 7.2中进行sec。将含有lekti的级
分合并并浓缩至～10mg/ml，并在-80℃下冷冻保存。
[0572]
兔fab抗体10273作为分泌蛋白在hek293细胞中表达。以1:1的摩尔比共转染包含seq id no:166和168的表达构建体。使条件培养基通过蛋白g珠来纯化分泌的fab(包含seq id no：165和167)并用0.1m甘氨酸，ph 2.7洗脱。通过添加2m tris-hcl，ph8.5中和级分。将蛋白质透析到pbs ph 7.2中，然后浓缩至约10mg/ml，并在-80℃下冷冻保存。
[0573]
如下形成klk5、lekti d5或lekti d8和兔fab抗体10273的复合物：首先将25μm klk5与25μm lekti d5或lekti d8在冰上孵育60分钟，然后加入25μm兔fab抗体10273并继续在冰上孵育另外60分钟。将混合物注入到用pbs，ph 7.2平衡的superdex 200尺寸排阻柱上，将其与hplc串联。收集峰级分用于通过sds-page分析。图3a和3b显示了单独的人klk5(实线，最右侧)、单独的兔fab抗体10273(虚线)、人klk lekti d5或d8的二元复合物(分别为图3a或3b，长破折号)，以及klk5 lekti d5或d8 兔fab抗体10273的三元复合物(分别为图3a或3b，短破折号，最左侧)的sec色谱图。
[0574]
如图4a和4b所示，每个峰的组分的分子量(mw)通过sds page确认。
[0575]
通过将人klk5与每个lekti片段单独混合，然后将二元复合物与兔fab抗体10273一起孵育，klk5、lekti d5或lekti d8与兔fab抗体10273之间的复合物在以1:1:1的比例混合时很容易形成。在sec和峰级分的sds-page上观察到二元和三元复合物，表明它们是稳定的，适合从其他种类中分离/纯化出来。
[0576]
实施例7：klk5/fab抗体10273/fab抗体10236复合物的结晶
[0577]
对于晶体学研究，按照制造商的方案，并添加kifunensine至最终浓度为5mm，使用expi293
tm
表达系统(life technologies
tm
)通过瞬时转染表达人klk5。kifunensine是一种有效的甘露糖苷酶i抑制剂，主要用于细胞培养以制造高甘露糖糖蛋白。
[0578]
在klk5的表达过程中，该蛋白质自激活而在上清液中产生活性klk5蛋白质(seq id no：142或seq id no：144的残基i67-s293(uniprot q9y337编号))。转染后5天收获细胞，上清液立即用于纯化。用缓冲液a(50mm tris ph 7.0,50mm nacl)将包含人klk5的上清液稀释4倍并加载到hitrap sp hp阳离子交换柱上。结合蛋白用缓冲液b(50mm tris ph 7.0,1m nacl)梯度经10个柱体积洗脱。将含有纯化的人klk5的级分合并并浓缩，并通过s200 26/60上的尺寸排阻色谱法进一步纯化，该s200 26/60已用20mm tris、150mm nacl(ph 7.2)平衡。通过sds-page表征klk5，其迁移到凝胶上与高甘露糖糖基化蛋白的预期分子量(mw)(大约35-38kda)一致的位置。
[0579]
然后用内切糖苷酶h(endo h)蛋白以1:100的比例处理人klk5蛋白，并在4℃下孵育过夜以形成均质的去糖基化klk5蛋白用于结构研究。糖苷内切酶h(endo h)是一种从streptomyces plicatus中克隆并在大肠杆菌中过表达的重组糖苷酶。endo h切割高甘露糖的壳二糖核心和来自n连接糖蛋白的有限数量的杂合寡糖。它不会切割复杂的聚糖。酶促切割发生在寡糖的二乙酰壳二糖核心中的两个n-乙酰葡糖胺残基之间，在天冬酰胺上留下一个n-乙酰葡糖胺残基。执行此步骤是为了确保有均质的人klk5可用于晶体学研究。klk5通过sds-page(图5)进行表征，其迁移到凝胶上与去糖基化蛋白质的预期分子量(mw)(～25kda)一致的位置。
[0580]
如实施例6中所述表达兔fab抗体10273。如针对兔fab抗体10273所述表达兔fab抗
体10236(包含seq id no：181和183)。简而言之，包含seq id no：182和184的表达构建体是以1:1的摩尔浓度比进行共转染。将条件培养基通过蛋白g珠子并用0.1m甘氨酸，ph 2.7洗脱来纯化每种分泌的fab蛋白。通过添加2m tris-hcl，ph8.5来中和级分。将各自的单个蛋白质透析到pbs ph 7.2中，浓缩至～10mg/ml并在-80℃下冷冻保存。
[0581]
制备1:1.5:1.5人klk5/兔fab抗体10273/兔fab抗体10236复合物，在4℃下孵育过夜并通过尺寸排阻色谱法(20mm tris，150mm nacl，ph 7.2洗脱缓冲液)纯化。在结晶前将含有复合物的单峰浓缩至～10.8mg/ml。
[0582]
人klk5/兔fab抗体10273/兔fab抗体10236复合物的结晶条件使用几种可商购的结晶屏进行鉴定。这些操作以静滴形式进行，使用swissci 96孔2滴mrc结晶板(来自molecular dimensions，目录号md11-00-100)。首先，使用microlab star液体处理系统(hamilton)在屏中填充75μl的每种结晶溶液。然后，使用mosquito液体处理器(ttp labtech)将300nl人klk5/兔fab抗体10273/兔fab抗体10236复合物和300nl储存溶液分配到结晶板的孔中。在midas ht-96屏(molecular dimensions,cat no.md1-107)的条件16(b4孔)下获得单晶。该条件包含45％v/v季戊四醇丙氧基化物(5/4)、0.2m nacl和0.1m mes一水合物ph 6.0。将晶体在液氮中快速冷冻，并在光束线i03(diamond light source，uk)处收集衍射数据。使用xds(kabsch,w.xds.acta cryst.d66,125-132(2010))对数据进行索引和集成，然后使用aimless(2.evans pr,murshudov gn.how good are my data and what is the resolution？acta crystallogr dbiol crystallogr.2013；69(pt 7):1204
–
1214)进行缩放。使用phaser(mccoy,a.j.,grosse-kunstleve,r.w.,adams,p.d.,winn,m.d.,storoni,l.c.,&read,r.j.phaser crystallographic software.j.appl.cryst.(2007).40,658-674)在phenix软件套件(adams pd,afonine pv,bunk
ó
czi g,et al.the phenix software for automated determination of macromolecular structures.methods.2011；55(1):94
–
106)通过分子置换拆分人klk5/兔fab抗体10273/兔fab抗体10236复合物结构。在这个过程中，klk5结构2psx(debela m,goettig p,magdolen v,huber r,schechter nm,bode w.structural basis of the zinc inhibition of human tissue kallikrein 5.jmol biol.2007nov 2；373(4):1017-31))和专有的fab模型用作分子替代模板。coot(p.emsley；b.lohkamp；w.g.scott；cowtan(2010)."features and development of coot".acta crystallographica.d66:486
–
501)和phenix.refine(towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.p.v.afonine,r.w.grosse-kunstleve,n.echols,j.j.headd,n.w.moriarty,m.mustyakimov,t.c.terwilliger,a.urzhumtsev,p.h.zwart,and p.d.adams.acta crystallogr d biol crystallogr 68,352-67(2012))在以下手动模型完成和细化周期中使用，直到获得可接受的rwork、rfree和ramachandran统计数据(如molprobity(williams et al.(2018)molprobity:more and better reference data for improved all-atom structure validation.protein science 27:293-315)所分析的)。
[0583]
在晶体不对称单元中观察到人klk5/兔fab抗体10273/兔fab抗体10236复合物。ccp4软件套件中的ncont用于确定klk5上被fab10273和fab10236分子识别的表位。klk5氨基酸编号基于unitprotkb条目q9y337，标准蛋白酶编号基于括号中的糜蛋白酶原。表5显示了首次描述本发明时的细化统计。
[0584]
表5
[0585][0586][0587]
由兔fab抗体10273在接触距离处结合的人klk5表位由残基leu212(163)、ser213(164)、gln214(165)、lys215(166)、arg216(167)、glu218(169)、asp219(170)、ala220(171)、pro222(173)、gly233(184)、pro269(223)、asn270(224)和pro272(226)组成，参考seq id no:142，括号中的数字对应于蛋白酶命名法。图6中更详细地显示了结合站点。
[0588]
位于表位附近、但在人klk5和兔fab抗体10273之间接触距离为的其他氨基酸残基包括ala181(132)、val211(162)、tyr221(172)、asp234(185)和arg271(225)，参考seq id no：142，括号中的数字对应于蛋白酶命名法。如图7所示，抗体10236和10273具有非常不同的、不重叠的结合位点，它们结合人klk5上的不同表位。
[0589]
实施例8：抗体10273人源化和表征
[0590]
ab 10273的人源化
[0591]
通过将来自兔v区的cdr移植到人种系抗体v区框架上，使兔抗体10273人源化。为了恢复抗体的活性，来自兔v区的一些框架残基也保留在人源化序列中。这些残基是使用adair et al.(1991)(humanized antibodies.wo91/09967)概述的方案选择的。图8和9显示了兔抗体(供体)v区序列与人种系(受者)v区序列以及设计的人源化序列的比对。从供体移植到受者序列的cdr由kabat定义(kabat等人，1987)，cdr-h1除外，其中使用了chothia/kabat组合定义(参见adair等人,1991humanized antibodies.wo91/09967)。
[0592]
对于抗体10273，选择人v区igkv1d-13加jk4 j区(imgt，http://www.imgt.org/)作为轻链cdr的受者。人源化轻链移植物gl2中的框架残基均来自人种系基因(图8)。
[0593]
人v区ighv3-66加jh6 j区(imgt，http://www.imgt.org/)被选为抗体10273重链cdr的受者。与许多兔抗体一样，抗体10273的vh基因长度上比选定的人受者短。当与人受者序列比对时，抗体10273的vh区的框架1缺少n端残基，该残基保留在人源化抗体中(图9)。10273兔vh区的框架3在β片链d和e之间的环中也缺少两个残基(75和76)：在人源化移植物中，间隙被来自选定的人受体序列的相应残基(赖氨酸75，k75；天冬酰胺76，n76)填充(图9)。10273重链的人源化移植物中的框架残基都来自人种系基因，除了来自残基24、48、49、71、73和78中的一个或多个残基，其中分别保留了供体残基缬氨酸(v24)、异亮氨酸(i48)、甘氨酸(g49)、赖氨酸(k71)、丝氨酸(s73)或缬氨酸(v78)。残基g49的保留对于人源化抗体的全部效力是必不可少的。通过用谷氨酸替换位置116的天冬氨酸残基(d116e)，cdrh3中的潜在水解位点在移植物gh3中被修饰了。
[0594]
人源化10273抗体的pi约为6.2。为了便于在下游加工过程中通过离子交换色谱法去除杂质，通过将参考移植物gl2的seq id no：1而言cdrl1中的残基1从谷氨酰胺(q)突变为精氨酸(r)、赖氨酸(k)或组氨酸(h)残基来提高pi。此外，cdrh3(参考seq id no:6)中的残基19从天冬氨酸(d)突变为天冬酰胺(n)残基以进一步提高pi：出乎意料的是，cdrh3中的该突变(d19n)也导致了对klk5的亲和力增加。
[0595]
在移植抗体10273gl2-q24rgh1-d116n中，cdr-h3含有6个酪氨酸残基。制备此移植物的突变体，用苯丙氨酸残基取代单个酪氨酸残基以产生移植物10273gl2-q1rgh1-d19n-y4f、10273gl2-q1rgh1-d19n-y6f、10273gl2-q1rgh1-d19n-y9f、10273gl2-q1rgh1-d19n-y12f、10273gl2-q1rgh1-d19n-y15f、10273gl2-q1rgh1-d19n-y16f。通过对相对于seq id no:6而言位置15和16的双酪氨酸之前出现的苏氨酸进行突变，制备额外的突变体，得到移植物10273gl2-q1rgh1-d19n-t14v和10273gl2-q1rgh1-d19n-t14s。
[0596]
这些移植物与人klk5结合的动力学通过表面等离子体共振(biacore t200)在25℃下进行评估。
[0597]
通过胺偶联化学将山羊抗人igg fc特异性抗体(jackson immunoresearch)固定在cm5传感器芯片上，达到约7000ru的水平。每个分析循环包括将抗klk5 igg分子捕获到抗
fc表面，以30μl/min的速度注入klk5分析物(内部制备)180秒，然后解离600秒。在每个循环结束时，使用60秒注射50mm hcl，然后30秒注射5mm naoh和最后60秒注射50mm hcl，以10μl/min的流速再生表面。在补充有nacl的hbs-ep 运行缓冲液(ge healthcare)中将人klk5从20nm滴定到0.74nm(3x3倍连续稀释)，最终浓度为300mm。包括缓冲液空白注射以减去仪器噪音和漂移。
[0598]
使用biacore t200评估软件用1:1结合模型确定动力学参数。
[0599]
表6显示，并非所有突变都导致抗体仍然能够以与亲本抗体或它们来源的移植抗体相似或接近的亲和力结合klk5。
[0600]
表6
[0601]
描述ka(1/ms)kd(1/s)kd(pm)
ꢀꢀꢀꢀ
10273gl2gh15.14e 058.45e-05164.310273gl2-q1rgh1-d19n4.27e 051.75e-04410.2*10273gl2-q1rgh1-d19n2.57e 051.33e-04309.1*10273gl2-q1rgh1-d19n-y6f2.98e 051.86e-04625.410273gl2-q1rgh1-d19n-y9f3.62e 052.00e-04553.910273gl2-q1rgh1-d19n-y12f4.32e 051.38e-04318.510273gl2-q1rgh1-d19n-y15f5.58e 051.39e-04249.110273gl2-q1rgh1-d19n-t14s2.57e 051.65e-04643.8
ꢀꢀꢀꢀ
10273gl2-q1rgh1-d19n-y4f4.51e 055.19e-041151.610273gl2-q1rgh1-d19n-y16f2.77e 051.60e-035768.610273gl2-q1rgh1-d19n-t14v3.64e 052.51e-036898.4
[0602]
*一式两份样品，相同的测定条件，在实验开始和结束时运行。不同的值在预期的实验变化范围内。
[0603]
人源化抗体图谱分析
[0604]
klk5选择性
[0605]
进行了一系列研究以确保兔抗体10273的人源化不会改变klk5对于其他激肽释放酶的选择性，不会降低亲和力或抑制活性。
[0606]
然后根据实施例4中描述的方法筛选纯化的抗体以确认它们对klk5的抑制活性。在600nm至20pm范围的10点半对数稀释系列上测试抗体。使用beckman coulter fx
tm
和multidrop系统，将5μl每种抗体转移到黑色384孔测定板(corning
tm
，目录号3575)，添加在测定缓冲液a(150mm nacl，50mm tris,200μm edta,0.05％(v/v)tween-20,ph7.6)中的选择的活性重组激肽释放酶15μl以达到以下最终测定浓度：60pm人klk5(ucb)、250pm klk7(ucb)、500pm klk2(r&d)、30pm klk4(ucb)以及30pm食蟹猴重组klk5(ucb)、500pm食蟹猴klk7、30pm小鼠klk5(ucb)和5nm小鼠klk7(ucb)。在括号中标明了在ucb制备的酶，并如上文实施例1中所述制备。可商购的酶的来源在括号中指示。
[0607]
将20μl测定缓冲液a单独添加到孔中，作为0％活性。lekti d5兔fc(如上所述在ucb制备)用作抑制活性的参考；因此，将与10236abs抗体所用浓度范围相同的lekti d5兔
fc 5μl添加到15μl激肽释放酶中。将15μl人klk5添加到5μl测定缓冲液a中用作100％活性参考。
[0608]
抗体和激肽释放酶在室温下孵育过夜。使用多滴器添加以下肽底物：boc-vpr-amc(cambridge research biochemicals
tm
)用于人klk5(300μm)、人klk2(30μm)、鼠klk5(300μm)和食蟹猴klk5(450μm)；khlf-amc(cambridge research biochemicals
tm
)用于人和食蟹猴klk7(分别为90μm和150μm)，pfr-amc(r&dsystems
tm
)用于人klk4(200μm)和mca-rpkpve-nval-wrk(dnp)-nh2(r&d systemstm)用于鼠klk7(150μm)。将样品孵育4小时，并在pherastar fsx读板器(bmg labtech
tm
)上在λ
ex
380nm和λ
em
430nm处读取boc-vpr-amc、pfr-amc和khlf-amc的读数；在λ
ex
320nm和λ
em
400nm处读取mca-rpkpve-nval-wrk(dnp)-nh2的读数。如实施例3所述分析数据以确定抑制百分比。将数据针对测试抗体的浓度作图，拟合4参数s形曲线以确定ic50(genedata screener
tm
)。
[0609]
ab 10273的人源化移植物保留了对klk5的特异性，并且对测试的其他klk家族成员表现出很少或没有抑制作用(数据未显示)。
[0610]
人源化移植物对klk5的抑制水平
[0611]
开发了一种捕获测定来确定由人源化ab 273移植物变体介导的klk5活性抑制水平。
[0612]
用在碳酸盐包被缓冲液中的10μg/ml f(ab')2片段山羊抗人igg fcγ片段特异性(jackson immunoresearch
tm
)包被nunc maxisorp黑色384孔板(sigma aldrich
tm
)，并在4℃下放置过夜。在biotek
tm
洗板机上用pbs和0.005％tween-20洗涤板3次，然后用20μl/孔的pbs和1％bsa在室温下封闭板1小时。如上所述洗涤板并将10μl 5nm抗体(使用测定缓冲液：150mm nacl、50mm tris、200μm edta、0.005％(v/v)tween-20、ph 7.6从原液中稀释)添加到适当的孔中。将板密封并在室温下孵育过夜，然后洗涤。然后将10μl的250pm klk5(在测定缓冲液中从原液中稀释)添加到相关的孔中，在室温下孵育4小时，然后添加10μl的600mm bvpr-amc底物。对于“最大活性”对照孔，省略了抗体并用测定缓冲液代替，而“最小活性”对照孔中没有添加底物或没有酶(用测定缓冲液代替)。使用pherastar fsx读板器每小时读取一次荧光(λ
ex
380nmλ
em
430 nm)，持续4小时。
[0613]
分析数据以得到klk5的百分比抑制值。从其等效的时间4小时值中减去每个时间0值，以提供标准化的基线校正数据集。以下公式用于将归一化的荧光值转换为抑制百分比：
[0614][0615]
min＝最小活性值；max＝最大活性值
[0616]
绘制数据以生成图10所示的条形图。抑制百分比值范围为95％至97％，表明抗体10273移植物能够几乎完全抑制klk5酶活性。
[0617]
实施例9：人源化抗体的生物物理表征
[0618]
通过质谱法表征抗体
[0619]
使用带有xevo g2 q-tof质谱仪的waters acquity uplc系统通过lc-ms对重链和轻链进行完整质量测量来确认每种抗体的身份。在37℃下，用5mm三(2-羧乙基)膦(tcep)的150mm乙酸铵溶液将样品(～5μg)还原40分钟。lc柱是waters bioresolvet rp mab polyphenyl，2.7μm，保持在80℃，用95％溶剂a(水/0.02％三氟乙酸(tfa)/0.08％
甲酸)和5％溶剂b(95％乙腈/5％水/0.02％tfa/0.08％甲酸)平衡，流速为0.6ml/分钟。用经8.8分钟从5％至50％溶剂b的梯度洗脱蛋白质，然后用95％的溶剂b洗涤并重新平衡。在280nm处获得uv数据。ms条件如下：离子模式：esi正离子，分辨率模式，质量范围：400-5000m/z，nai外标。使用waters masslynx和maxent软件分析数据。
[0620]
完整质量(还原的链)表明观察到的轻链质量与预期质量一致。然而，除10273gl2-q1rgh1-d19n-y9f之外，对于其他所有10273分子观察到的和预期的重链质量之间存在 80道尔顿的差异(表7)。
[0621]
这被鉴定为重链中tyr 9的翻译后修饰，并通过使用抗磺基酪氨酸抗体的蛋白质印迹证实为硫酸化。此外，10273gl2-q1rgh1-d19n与鲍鱼硫酸酯酶在37℃下孵育1小时将 80da修饰的比例降低了约17％，如通过完整质谱法评估的。
[0622]
表7
[0623]
[0624][0625]
exp.＝预期的；obs＝观察到的；δ＝delta
[0626]
热稳定性(tm)测量
[0627]
使用thermofluor测定法测定解链温度(tm)或去折叠中点处的温度。
[0628]
对于thermofluor测定，荧光染料orange用于通过与随着温度升高而暴露的疏水区域结合来监测蛋白质去折叠过程。反应混合物含有5μl 30xorange protein gel stain(thermofisher scientific，s6651)，用测试缓冲液从5000x浓缩液稀释。将pbs ph 7.4中的45μl 10273ab样品(浓度为0.2mg/ml)添加到染料中并混合。将10μl该溶液一式四份分配到384pcr光学孔板中，并在quantstudio 7实时pcr系统(thermofisher
tm
)上运行。pcr系统加热装置设置在20℃并以1.1℃/min的速率升高到99℃。电荷耦合装置监测孔中的荧光变化。绘制荧光强度增加图，斜率的拐点用于生成表观中点温度(tm)。
[0629]
对于所有抗体，观察到两个去折叠转变。第一个可归因于ch2结构域，第二个可归因于fab去折叠结构域和ch3结构域的tm的平均值。
[0630]
10273igg4p抗体之间的热稳定性没有差异(表8)。正如预期的那样，与相应的igg4p形式相比，抗体10273gl2gh1的igg1形式的热稳定性增加。(heads et al“relative stabilities of igg1 and igg4 fab domains:influence of the light-heavy interchain disulfide bond architecture”.protein sci 2012；21:1315-22)。
[0631]
表8
[0632][0633]
对三种人源化igg4p抗体：抗体10273gl2h1、gl2q1r-gh1d19n和gl2q1r-gh4d19n以及一种igg1形式的抗体：抗体10273gl2gh1进行了进一步的生物物理表征。
[0634]
实验等电点(pi)测量
[0635]
ice3
tm
全毛细管成像毛细管等电聚焦(cief)系统(proteinsimple)用于实验性确定pi。通过混合以下物质制备10273ab样品：30μl样品(来自hplc级水中的1mg/ml储备液)、35μl 1％甲基纤维素溶液(proteinsimple，101876)、4μl ph 3-10的药物(proteinsimple,042-848)、0.5μl 4.65、0.5μl 9.77合成pi标记(proteinsimple、102223和102219)和12.5μl 8m尿素溶液(sigma)。使用hplc级水将最终体积补足至100μl。样品在1.5kv下聚焦1分钟，然后在3kv下聚焦5分钟，使用protein simple软件拍摄毛细管的280nm图像。使用ice3软件分析所得电泳图并分配pi值(pi标记之间的线性关系)。
[0636]
由于轻链q1r和重链d19n的突变，观察到更高的pi。同种型的差异，即igg1而不是igg4p也导致实验性pi增加。在制造过程中可以利用突变和同种型的变化来在第一个离子交换步骤(aex)中去除宿主细胞蛋白。提高的pi还允许在更常见的缓冲液(ph5到6左右)中进行配制。
[0637]
表9
[0638][0639]
疏水相互作用色谱(hic)
[0640]
疏水相互作用色谱(hic)以增加疏水性的顺序分离分子。在存在高浓度极性盐的情况下，分子与疏水固定相结合，并随着盐浓度的降低而解吸附到流动相中。更长的保留时间等同于更大的表观疏水性。
[0641]
将2mg/ml的10273ab样品用1.6m硫酸铵和pbs(ph 7.4)进行1:2稀释。将10μg(10μl)样品注入与带有荧光检测器的agilent 1200二元hplc串联连接的dionex propac
tm hic-10色谱柱(100mmx4.6mm)上。通过固有荧光(激发和发射波长，分别为280nm和340nm)监测分离。使用缓冲液a(0.8m硫酸铵100mm磷酸盐ph7.4)和缓冲液b(100mm磷酸盐ph7.4)，采用下述梯度洗脱分析样品：(i)在0％b下保持2分钟，(ii)在30分钟内从0到100％b的线性梯度(0.8ml/分钟)(iii)用100％b洗涤柱子2分钟，然后在下次进样前在0％b中重新平衡10分钟。柱温保持在20℃。保留时间(以分钟为单位)如表10所示。
[0642]
表10
[0643][0644]
在不同的10273抗体之间仅观察到保留时间即表观疏水性的微小差异，并且所有抗体都被认为表现出高于平均的测量值，因此可能表现出聚集的倾向(jain et al“biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape”proc natl acad sci u s a.2017jan31；114(5):944-949.doi:10.1073/pnas.1616408114.epub 2017jan 17)。因此，所有分子都显示出更大的结合hic基质的趋势。hic基质已被用作制造中离子交换的替代步骤。
[0645]
使用聚乙二醇(peg)测量的溶解度测量
[0646]
可以通过检查聚乙二醇(peg)沉淀的影响来了解胶体稳定性(溶解度)。通过增加peg的浓度(w/v)并测量溶液中剩余的蛋白质量，利用peg以可定量定义的方式降低蛋白质
溶解度。该测定用于在不使用常规浓缩方法的情况下模拟高浓度溶解度的影响。
[0647]
制备在pbs ph 7.4；50mm醋酸钠、125mm氯化钠ph 5.0(常用储存缓冲液)和50mm组氨酸、250mm脯氨酸ph 5.5(常用预配制缓冲液)中的40％peg 3350(merck,202444)储备溶液(w/v)。由辅助加液体处理机器人(integra,4505)进行连续滴定，得到40％至15.4％的peg 3350。为了尽量减少非平衡沉淀，样品制备包括以体积比1:1混合10273ab样品和peg溶液。通过液体处理机器人将35μl peg3350储备溶液添加到96孔v底pcr板(a1至h1)中。将35μl的2mg/ml 10273ab溶液添加到peg储备溶液中，得到1mg/ml的测试浓度。该溶液通过自动缓慢重复移液进行混合，并在37℃下孵育0.5小时以重新溶解任何非平衡聚集体。然后将样品在20℃下孵育24小时。随后将样品板在20℃下以4000xg离心1小时。将50μl上清液分配到半面积、96孔、微孔板(greiner,675801)中。使用omega多检测微板读数仪(bmg labtech)在280nm处通过紫外分光光度法测定蛋白质浓度。使用graphpad prism版本7.04将所得值作图，从s形剂量响应(可变斜率)拟合的中点得到peg中点(peg)评分。
[0648]
数据显示在表11中，其中较高的peg中点(％)等同于较高浓度稳定性/溶解度的可能性较大。
[0649]
在ph 7.4时，10273gl2gh1(igg4p)显示出最高的peg中点(最大的预测溶解度)，但在ph 5的醋酸盐中显示出最低的溶解度。这种趋势与相应的igg1分子不同，其中预测的溶解度在pbs ph 7.4和醋酸盐ph5之间没有差异。10273gl2-q1rgh1-d19n和10273gl2-q1rgh4-d19n在pbs ph 7.4和组氨酸ph 5.5缓冲液中显示出相似的peg中点，但是在醋酸盐ph 5中下降.
[0650]
表11
[0651][0652]
气液界面应力的影响(聚集测定)
[0653]
蛋白质在暴露于气液界面时往往会去折叠，其中疏水表面呈现给疏水环境(空气)，亲水表面呈现给亲水环境(水)。蛋白质溶液的搅拌实现了大的气液界面，可以驱动聚集。该测定用于模拟分子在制造过程中将受到的压力(例如超滤)，并提供严格的条件以尝试区分不同的抗体分子。
[0654]
pbs ph 7.4或50mm乙酸钠和125mm氯化钠ph5中的样品通过使用eppendorf thermomixer comforttm进行涡旋处理。在涡旋之前，使用适当的消光系数(1.46abs 280nm、1mg/ml、1cm路径长度)将浓度调整为1mg/ml，使用varian cary 50-bio
获得280nm、340nm和595nm处的吸光度，以建立零点时间的读数。将每个样品分装到1.5ml锥形式带盖试管(3x 250μl)中，并在25℃下以1400rpm涡旋震荡4小时。通过使用varian50-bio分光光度计在595nm处测量样品来监测聚集(浊度)
[0655]
不同抗体在两种缓冲液中4小时的聚集倾向显示在表12和图11中。
[0656]
表12
[0657][0658]
igg1 10273gl2gh1在两种缓冲液中都显示出最大的聚集稳定性，并且总体上所有10273抗体在pbs ph 7.4中的聚集稳定性更高。
[0659]
通过圆二色性(cd)分析经盐酸胍去折叠的化学变性(去折叠)
[0660]
使用化学变性剂(盐酸胍)对抗体进行去折叠，作为稳健性测试。
[0661]
使用(ttp labtech，cambridge，uk)在96孔板的48孔中从0-4m滴定盐酸胍，以80μl总体积添加7.5μm(最终)的样品，然后在室温下平衡过夜。将70μl转移到深孔板中，通过自动圆二色谱法(chiroscantm：acd，applied photophysics，leatherhead，uk)进行分析。在远紫外区域260-190nm获得圆二色性测量，使用0.5nm步长，1s/时间点，1nm带宽和0.2mm光程的流通池比色皿。将210nm处的cd信号拟合到origin 9b中的s形双剂量响应曲线。
[0662]
根据化学变性中点(cm)(表13)，测试的10273抗体似乎具有相似的变性曲线，具有两个明显的转变，因此证实了对化学变性剂的相似稳健性。
[0663]
表13
[0664]
描述cm1cm210273gl2gh11.382.6910273gl2-q1r gh1-d19n1.362.710273gl2-q1r)gh4-d19n1.482.76
[0665]
使用ac-sins(亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱)评估自相互作用。
[0666]
在ac-sins测定(liu y.mabs.2014mar-apr；6(2):483-92)中测试了10273抗体组，以评估自相互作用倾向，从而了解聚集稳定性。
[0667]
将山羊抗人fcγ特异性捕获抗体(jackson immunoresearch)缓冲液交换到20mm乙酸钠ph 4.3中，稀释至0.4mg/ml，并将50μl添加到450μl柠檬酸盐稳定的20nm金纳米颗粒(tedpella，美国)中，并在室温下放置过夜。缀合的纳米颗粒用55μl peg-硫醇封闭1小时，以21,000x g离心6分钟，去除上清液并重悬于20mm乙酸钠ph4.3中至最终体积150μl。
[0668]
将10273抗体在pbs、ph7.4(200μl)中稀释至22μg/ml，并添加到等体积的非特异性全igg(jackson immunoresearch)中，短暂涡旋，然后将72μl添加到96孔板中。将8μl纳米颗粒添加到每个孔中(n＝4)。在bmg读板器上从500-600nm处读取吸光度，拟合lorenzian曲线(rshiny)，并从样品中减去仅pbs的数值，以得到δλmax，如表14中详述。δλmax越大，则自相互作用的倾向越大。测试的10273抗体显示出较低的λmax和δλmax(来自pbs背景)，表明自相互作用的倾向较低。
[0669]
表14
[0670]
描述λmaxδλmax10273gl2gh1530.91.4110273gl2-q1r gh1-d19n531.151.6610273gl2-q1r gh4-d19n531.592.1