水稻抽穗期QTLqHd1功能标记及其应用

水稻抽穗期qtl qhd1功能标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及水稻种质资源鉴定及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及水稻抽穗期qtl qhd1/osmads51共显性功能标记及其应用。


背景技术：

2.水稻从播种至抽穗可以划分为两个连续的阶段：即营养生长期(播种至穗起始分化)和生殖生长期(穗起始分化至抽穗)。其中，穗分化阶段基本稳定在35天左右，而营养生长阶段的长短主要决定于品种的“三性”(感光性、感温性与基本营养生长性)，在不同水稻品种间存在广泛变异。对于任何一个具体品种而言，“三性”是一个相互联系的整体，是在特定的育种及栽培条件的影响下形成的，当生长环境的光温条件发生变化时，品种会通过抽穗期的改变以适应环境。因此，对水稻抽穗期相关基因具有重要的研究价值。
3.前期研究中，我们根据珍汕97(zs97)和密阳46(my46)构建的遗传群体鉴定到一个感温性抽穗期qtl qhd1。通过精细定位发现osmads51是qhd1的功能基因，在qhd1/osmads51(loc_os01g69850，http://rice.plantbiology.msu.edu/)的第一内含子上zs97相对于my46多了1个9.5kb的大片段插入，使得zs97型等位基因的表达量显著下降，抽穗延迟。为了实现9.5kb大片段插入的准确鉴定，设计了10个呈连续交叠排列且覆盖整个9.5kb片段的分子标记，如果这10个标记均能扩增出目标长度的产物，则表明被检测材料携带zs97型等位基因，反之亦然。但利用这10个标记进行品种鉴定时，存在以下三点缺陷：由于缺失型和部分扩增失败样品均无条带，会存在较多的假阳性结果；若该品种与zs97和my46的等位基因均不一样，无法进行鉴定；无法将杂合型和zs97型区分开；每个样品都要进行10次pcr扩增和电泳检测，费时费力成本高。
4.因此，如何准确、高效地对qhd1/osmads51进行不同基因型鉴定成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了水稻抽穗期qtl qhd1功能标记及其应用，可准确、高效地实现不同水稻基因型鉴定。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.水稻抽穗期qtl qhd1功能标记，该共显性功能标记包括如下引物：
8.1f：5'-ggttttcccatgggtgtgat-3'，seq id no.1；
9.2f：5'-acatgcttaacctcatcacct-3'，seq id no.2；
10.1r：5'-acaccggtcatgatatgtgc-3'，seq id no.3；
11.3f：5'-tacatggggtggccatcata-3'，seq id no.4；
12.3r：5'-acttccatgataatgatgaggt-3'，seq id no.5。
13.其中，1f、1r对应的扩增产物为228bp，2f、1r对应的扩增产物为314bp，3f、3r对应的扩增产物为417bp。
14.一种试剂盒，包括上述引物。
15.上述水稻抽穗期qtl qhd1功能标记或上述试剂盒在水稻种质资源鉴定中的应用。
16.上述水稻抽穗期qtl qhd1功能标记或上述试剂盒在不同抽穗期水稻选育中的应用。
17.一种水稻品种基因型鉴定方法：提取水稻dna，利用上述水稻抽穗期qtl qhd1功能标记或上述试剂盒对dna进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测，通过带型分析水稻品种基因型。
18.优选地，结合水稻籼/粳类型鉴定水稻品种。
19.优选地，pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcr mix预混液10μl，模板d na 2μl，h2o 6.8μl，引物1f、2f、3f、3r各0.2μl，引物1r0.4μl。
20.优选地，pcr扩增的反应程序为：94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。
21.进一步地，所述水稻抽穗期qtl qhd1功能标记用于区分loc_os01g69850所示基因第一内含子序列自然变异的类型：
22.(1)缺失型：扩增获得的条带为228bp；
23.(2)插入型：扩增获得的条带为314bp；
24.(3)晶4155s型：扩增获得的条带为314bp 417bp；
25.(4)杂合型：扩增获得的条带为228bp 314bp或228bp 314bp 417bp。
26.优选地，插入型中，根据籼/粳类型区分籼稻和粳稻。
27.综上所述，本发明利用5条引物在同一pcr反应体系中通过常规pcr和1.5％琼脂糖凝胶电泳，可准确鉴定出插入型、缺失型、晶4155s型和杂合型基因型，结合品种籼/粳类型亦可鉴定出zs97型和粳稻型两种单倍型；整个检测过程的操作简单，对不同来源的种质资源的鉴定结果准确性高。
附图说明
28.图1所示为基于35个水稻品种qhd1/osmads51编码区序列的进化树分析；
29.图2所示为qhd1/osmads51的共显性功能标记设计；
30.图3所示为实施例3电泳检测结果；
31.图4所示为实施例4电泳检测结果。
具体实施方式
32.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.对qhd1/osmads51的编码区序列进行分析：
35.利用目前公开的高质量基因组数据，提取到35个水稻品种qhd1/osmads51的编码区完整序列。通过序列分析，在该基因的编码区共鉴定到249个变异位点。利用这些变异进
行进化树分析发现该基因可分为五种单倍型(图1)，其中粳稻可分为两类：nip和lemont，籼稻包含三类：晶4155s(jing4155s)、zs97和mh63(minghui63)；除mh63类型之外，其它四种单倍型在9.5kb变异同一位置均存在大片段插入，片段长度分别为10.7kb(nip)、9.3kb(lemont)、10.0kb(晶4155s)、9.5kb(zs97)。
36.利用普通pcr试剂和反应程序难以扩增大片段的原理，在该插入片段一端和两侧设计了三条引物：
37.1f：5'-ggttttcccatgggtgtgat-3'，seq id no.1；
38.2f：5'-acatgcttaacctcatcacct-3'，seq id no.2；
39.1r：5'-acaccggtcatgatatgtgc-3'，seq id no.3；
40.利用上述三条引物可将插入型(314bp)、缺失型(228bp)和杂合型(314bp 228bp)区分开。
41.进一步地，利用引物3’端存在1-2个错配即可导致pcr扩增失败的原理，在插入片段上发现一处晶4155s型特异的25bp序列缺失，
42.设计引物：
43.3f：5'-tacatggggtggccatcata-3'，seq id no.4；
44.3r：5'-acttccatgataatgatgaggt-3'，seq id no.5；
45.引物3r的3’端跨25bp序列缺失，与其它类型相比3’端存在6个碱基错配，因此3f 3r只能扩增晶4155s型片段(图2)。
46.上述引物1f、2f、1r、3f和3r在同一pcr反应体系中通过常规pcr和1.5％琼脂糖凝胶电泳，即可准确鉴定出插入型、缺失型、晶4155s型和杂合型基因型，此外，由于籼稻中只有10.0kb(晶4155s)、9.5kb(zs97)和0kb三种单倍型，因此结合品种的籼/粳类型亦可鉴定出zs97型和粳稻型两种单倍型。
47.实施例2
48.为了验证实施例1引物的鉴定效果，挑选不同类型的水稻品种11个，提取水稻dna，利用1f、2f、1r、3f和3r对dna进行pcr扩增。
49.pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcr mix预混液10μl，模板dna 2μl，h2o 6.8μl，引物1f、2f、3f、3r各0.2μl，引物1r 0.4μl。
50.pcr扩增的反应程序为：94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。
51.扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，晶4155s为jing4155s纯合型(2条带314bp 417bp)，晶两优534为jing4155s杂合型(3条带228bp 314bp 417bp)；华占/南粳9108f1为杂合型(2条带228bp 314bp)；稻花香2号、lemont、中早39、ii-32b和广陆矮4号均为插入型(314bp)，根据籼/粳类型，可进一步分为粳稻型(稻花香2号和lemont)、zs97型(中早39、ii-32b和广陆矮4号)；黄华占、美香占2号和五山丝苗均为缺失型(228bp)。上述鉴定结果与系谱信息和进化树分析结果完全一致，且带型亮、清晰，完全满足鉴定要求。
52.实施例3
53.为了鉴定不同种质资源的qhd1/osmads51的基因型，按照实施例2中pcr反应体系、pcr反应参数对96个具有代表性的样品的dna进行pcr，经电泳检测后，结果如表1及图4所
示，能够简单、清晰、准确地鉴定出96个样品的基因型。
54.表1 96个代表性样品的基因型检测结果
[0055][0056]
注：mh63表示mh63单倍型；zs97表示zs97单倍型；晶4155s表示晶4155s单倍型；粳表示粳稻型(nip或lemont单倍型)；0表示无条带，可能是由dna质量低造成。
[0057]
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。