来源于人I型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系及其构建方法

来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系及其构建方法
技术领域
1.本技术涉及肿瘤细胞系构建技术领域，具体涉及一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系及其构建方法。


背景技术：

2.i型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type i,nf1)由von recklinghausen于1882年首次报道，故又称为von recklinghausen病。i型神经纤维瘤病一般为常染色体显性遗传，由nf1基因发生突变引起。nf1在新生儿中的患病率约为1/3500～1/3000(美国流行病学杂志,2000,151(1):33-40；神经科学史杂志,2010,19(4):333-348)。神经纤维瘤是nf1中最为常见和具有特征性的症状之一，神经纤维瘤中有着大量增生的施旺细胞和其他神经纤维支持成分，如神经束膜细胞、成纤维细胞、血管和浸润其中的肥大细胞。神经纤维瘤主要分为皮肤型神经纤维瘤和丛状型神经纤维瘤，皮肤型神经纤维瘤不具备恶变潜能，而丛状型神经纤维瘤多呈现浸润性生长，破坏肿瘤周围正常组织和器官，同时具有恶变倾向，且手术疗效欠佳，因此，成为当前多组学及靶向治疗研究热点。
3.然而，神经纤维瘤为良性肿瘤，在体外研究中，与多数恶性肿瘤不同，其肿瘤细胞不具备永生性，在体外很难长久存活，难以开展研究。目前国际上公认的神经纤维瘤来源的细胞系均来自国外，可在atcc(https://www.atcc.org)上获得相关信息，但缺乏针对中国人遗传背景的神经纤维瘤细胞系。


技术实现要素：

4.本发明提供一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系及其构建方法，所述肿瘤细胞系具有中国人遗传背景，并且具备永生性。
5.本技术提供一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系，所述来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系命名为pnf1-9hosp-02，保藏中心保藏编号为cctcc no：c2020184。保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏单位代码为cctcc-中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉，保藏时间为2020年12月16日。
6.本技术所述细胞系标本来源为成年女性的背部丛状神经纤维瘤。nf1是一种以全身多发神经纤维瘤为主的疾病，根据神经纤维瘤生长部位的不同，其临床特点、手术方式、预后各不相同。选取成年女性的背部丛状神经纤维瘤作为标本来源来进行细胞系构建，可以为基础研究和临床试验提供不同部位的细胞系模型。
7.相应的，本技术还提供一种所述的来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系的构建方法，所述构建方法是向原代分离的神经纤维瘤细胞转染端粒酶逆转录酶基因和cdk4/m抗原，经单克隆筛选并用dmem培养基传代培养以获得永生化的神经纤维瘤细胞系。
8.可选地，在本技术的一些实施例中，所述构建方法包括:
9.步骤s1：提供原代神经纤维瘤细胞，对所述原代神经纤维瘤细胞进行培养以得到待转染细胞培养物；
10.步骤s2：以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对待转染细胞培养物进行病毒感染；
11.步骤s3：对经病毒感染后的细胞培养物进行单克隆筛选；
12.步骤s4：对经单克隆筛选后的细胞培养物进行传代培养，以得到永生化的神经纤维瘤细胞系。
13.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s1包括：
14.步骤s11：取临床切除的神经纤维瘤组织，制备得到肿瘤细胞悬液；
15.步骤s12：对培养容器进行包被，将所述肿瘤细胞培养在包被后的所述培养容器中；
16.步骤s13：对所述原代肿瘤细胞进行消化传代，以获得待转染细胞培养物。
17.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s11包括：将剪切后的神经纤维瘤组织置入含10％(v/v)胎牛血清、1.25u/ml分散酶、300u/ml胶原酶、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，37℃过夜后经30μm细胞滤网过滤以收集细胞。
18.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s12包括：以层黏连蛋白对培养容器进行包被，将所述肿瘤细胞培养在层黏连蛋白包被后置于含15％胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，以获得原代神经纤维瘤细胞。
19.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s13包括：以胰酶消化s12中获得的原代神经纤维瘤细胞，将消化好的细胞均匀铺于经包被的培养容器中，37℃、5％co2环境中密封培养，以获得待转染细胞培养物。
20.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s1中，l15培养基中不含有heps缓冲液，并且需要进行密封培养。
21.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s2包括：
22.步骤s21：以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录基因，moi值为20～40；
23.步骤s22：再以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原，moi值为20～40；
24.步骤s23：对经转染cdk4/m抗原的细胞培养物进行培养并传代。
25.优选地，在本技术的一些实施例中，以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录基因时，所述moi值为30。
26.优选地，在本技术的一些实施例中，以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原时，所述moi值为30。
27.可选地，在本技术的一些实施例中，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺溶液。
28.可选地，在本技术的一些实施例中，所述病毒感染增强悬液工作浓度为5～8μg/ml。
29.可选地，在本技术的一些实施例中，所述待转染细胞培养物中肿瘤细胞浓度为8μg/ml。
30.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s21中，每6小时进行一次培养基置换。
31.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s21中，转染时间为72小时。
32.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s23中，对经转染端粒酶逆转录酶
基因及转染cdk4/m抗原的细胞培养物传代至少9代以上。
33.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s2中使用的培养基为含有15％(v/v)胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1(human neuregulin-1，人神经调节因子-1)、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的leibovitz's l-15培养基。
34.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s3包括：
35.步骤s31：将步骤23获得的经培养并传代的细胞培养物以二倍稀释法接种至孔板中，培养后观察孔板中细胞克隆形成的情况，挑选单克隆的细胞孔。
36.可选地，将步骤23获得的经培养并传代的细胞培养物以二倍稀释法接种至孔板中，培养一周后观察孔板中细胞克隆形成的情况，挑选单克隆的细胞孔。
37.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s3中使用的培养基为含有15％(v/v)胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1(human neuregulin-1，人神经调节因子-1)、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的leibovitz's l-15培养基。
38.可选地，在本技术的一些实施例中，所述步骤s4包括：
39.步骤s41：每48～72小时更换培养基，细胞长满皿底的70％～80％时进行消化传代。
40.可选地，在本技术的一些实施例中，进行传代时的分种率为1：2。
41.可选地，在本技术的一些实施例中，在所述步骤s4中使用的培养基为含有10％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的dmem培养基。dmem培养基中含有酸碱度缓冲体系，不需要进行密封培养，可以使用普通的透气培养瓶、培养皿、培养板和培养箱来进行培养。
42.本发明构建一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系，具有如下有益效果：
43.1、本发明所述pnf1-9hosp-02细胞系具有中国人的遗传背景，与国外已有细胞系相比，在研究中国人i型神经纤维瘤病中具有无法比拟的优势。且细胞系标本来源为成年女性的背部丛状神经纤维瘤，为i型神经纤维瘤不同部位的研究提供了基础。
44.2、一般情况下，无论是良性还是恶性肿瘤，其从体内转移到体外培养后，由于微环境的改变而不易存活，因此在一般体外培养条件下要使肿瘤细胞传代是十分困难的，使得针对原代细胞进行的研究推进较难。而本发明所述的pnf1-9hosp-02细胞为永生化的良性细胞，根据本发明给出的培养条件，可在体外稳定存活及传代，为神经纤维瘤相关的研究提供了良好的材料。
45.3、本发明所述pnf1-9hosp-02细胞的构建方法，具有良好的可借鉴性和推广性，可以有效、经济地建立i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系。
附图说明
46.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
47.图1是本技术实施例一提供的单层贴壁生长的pnf1-9hosp-02细胞(20x)，可见较多新生细胞，细胞为簇样生长，其形状不规则，排列紧密，界限清晰，接触性抑制丧失；
48.图2是本技术实施例一提供的pnf1-9hosp-02细胞透射电镜(2000x)，细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或突出，细胞质内代谢旺盛，细胞与细胞间密切接触，接触性抑制丧失；
49.图3是本技术实施例一提供的pnf1-9hosp-02细胞的生长曲线图，细胞倍增时间为14.4小时；
50.图4是本技术实施例一提供的pnf1-9hosp-02细胞接种后贴壁率随时间变化图，种植6小时后，大部分细胞(95％以上)均可贴壁生长；
51.图5是本技术实施例一提供的细胞类型鉴定流式图，该细胞系中99.38％为s100b( )肿瘤细胞；
52.图6是本技术实施例一提供的pnf1-9hosp-02细胞免疫荧光，图中绿色：s100b，蓝色：dapi，可见s100b主要表达在胞浆中。
具体实施方式
53.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
54.本技术实施例提供一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系及其构建方法。以下分别进行详细说明。本领域技术人员可以理解的是，如无特殊说明，本发明实施例中使用的试剂为市售商品。
55.实施例一、神经纤维瘤细胞系及其构建
56.在本实施例中，提供一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系，所述来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系命名为pnf1-9hosp-02，保藏中心保藏编号为cctcc no：c2020184。
57.所述神经纤维瘤细胞系的构建方法是向原代分离的神经纤维瘤细胞转染端粒酶逆转录酶基因(tert)和cdk4/m抗原，经单克隆筛选并用dmem培养基传代培养以获得永生化的神经纤维瘤细胞系。并且，所述构建方法包括以下步骤：
58.步骤s11：取临床切除的神经纤维瘤组织，制备得到肿瘤细胞悬液；
59.步骤s12：对培养容器进行包被，将所述肿瘤细胞培养在包被后的所述培养容器中；
60.步骤s13：对所述原代肿瘤细胞进行消化传代，以获得待转染细胞培养物；
61.步骤s21：以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录基因，moi值为20～40；
62.步骤s22：再以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原，moi值为20～40；
63.步骤s23：对经转染cdk4/m抗原的细胞培养物进行培养并传代；
64.步骤s31：将步骤23获得的经培养并传代的细胞培养物以二倍稀释法接种至孔板中，培养后观察孔板中细胞克隆形成的情况，挑选单克隆的细胞孔；
65.步骤s41：每48～72小时更换培养基，细胞长满皿底的70％～80％时进行消化传代。
66.在所述步骤s11中，将剪切后的神经纤维瘤组织置入含10％(v/v)胎牛血清、1.25u/ml分散酶、300u/ml胶原酶、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，37℃过夜后经30μm细胞滤网过滤以收集细胞；
67.在所述步骤s12中，以层黏连蛋白对培养容器进行包被，将所述肿瘤细胞培养在层黏连蛋白包被后置于含15％胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，以获得原代神经纤维瘤细胞。
68.在所述步骤s13中，以胰酶消化s12中获得的原代神经纤维瘤细胞，将消化好的细胞均匀铺于经包被的培养容器中，37℃、5％co2环境中密封培养，以获得待转染细胞培养物。
69.在所述步骤s21中，以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录基因时，所述moi值为30。
70.在所述步骤s21中，每6小时进行一次培养基置换。
71.在所述步骤s21中，转染时间为72小时。
72.在所述步骤s22中，以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原时，所述moi值为30。
73.在所述步骤s21和s22中，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺溶液。
74.在所述步骤s21和s22中，所述病毒感染增强悬液工作浓度为5～8μg/ml。
75.在所述步骤s21和s22中，所述待转染细胞培养物中肿瘤细胞浓度为8μg/ml。
76.在所述步骤s23中，对经转染端粒酶逆转录酶基因及转染cdk4/m抗原的细胞培养物传代至少9代以上。
77.在所述步骤s31中，将步骤23获得的经培养并传代的细胞培养物以二倍稀释法接种至孔板中，培养一周后观察孔板中细胞克隆形成的情况，挑选单克隆的细胞孔。
78.在所述步骤s41中，进行传代时的分种率为1：2。
79.所述步骤s21、s22、s23、s31使用的培养基为含有15％(v/v)胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1(human neuregulin-1，人神经调节因子-1)、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的leibovitz's l-15培养基。
80.所述步骤s41中使用的培养基为含有10％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的dmem培养基。
81.在一具体实施例中，标本来源为上海交通大学附属第九人民医院整复外科患者，女，56岁，术前患者征得患者本人同意，签署知情同意书，术中切除的背部丛状型神经纤维瘤标本。术后病理诊断为：神经纤维瘤。
82.具体使用试剂包括：leibovitz's l-15培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，hnrg-1(human neuregulin-1，人神经调节因子-1)(美国cst公司)，青霉素(美国gibco公司)，链霉素(美国gibco公司)，dulbecco's modified eagle medium-高糖型培养基(美国gibco公司)。
83.其余细胞培养材料包括：30μm细胞滤网(美国falcon公司)；xi型胶原酶(美国sigma公司)；分散酶(美国sigma公司)；laminin层黏连蛋白(美国sigma公司)；0.25％trypsin-edta(美国gibco公司)；密闭型与非密闭型t25细胞培养瓶(美国corning公司)，无血清细胞冻存液(美国sciencell公司)，polybrene(美国sigma公司)，6孔板(美国corning
公司)，96孔板(美国corning公司)，倒置显微镜(日本olympus公司)。
84.在上述具体实施例中，所述来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系的构建方法具体包括：
85.1.肿瘤细胞的获取及原代培养
86.取临床切除的神经纤维瘤组织(约1cm3)，含1％双抗(青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml)的l15培养基冲洗切除的组织，将切除的组织置于含10％胎牛血清的l-15培养基中，冰盒运输。在超净台中用灭菌的交叉外科解剖刀对组织进行剪切，将剪切后的组织置于10ml含10％胎牛血清，1.25u/ml分散酶,300u/ml胶原酶和1％双抗的l15培养基中于37℃培养箱中过夜。30μm细胞滤网过滤至50ml离心管中，500g离心5min。收集细胞沉淀，将细胞培养在laminin(10μg/ml)包被后含15％胎牛血清、hnrg-1(25ng/ml)和1％双抗的l15完全培养液的密闭型t25培养瓶中。
87.原代培养前准备：用1ml包被液对培养瓶进行包被(10ug/ml laminin稀释于pbs(稀释比为1:100)，例如10ul 1mg/ml储液稀释于1ml pbs，终浓度为10ug/ml)，培养箱放置2h，吸弃多余上清，pbs轻洗一遍。
88.原代细胞传代：小心吸去培养液，用1xpbs清洗；弃掉1xpbs后，加入适量胰酶；在显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。弃去胰酶，加入适量预热的新鲜培养液，将细胞吹打分散均匀，将细胞悬液吸入15ml离心管中，室温，800rpm，离心5min，弃去培养液，加入新鲜培养液，将细胞吹打均匀。将消化好的细胞均匀的铺于提前包被好的细胞瓶中，37℃，5％co2，使用密封培养瓶培养。
89.其中，l15培养基中不含有heps缓冲液，需要密封培养。
90.2.肿瘤细胞tert mcdk4稳转细胞株构建
91.细胞准备:稳转细胞建系前，确保目的细胞状态良好。小心吸去培养液，用1xpbs清洗；弃掉1xpbs后，加入适量胰酶；在显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。弃去胰酶，加入适量预热的新鲜培养液，将细胞吹打分散均匀，将细胞悬液吸入15ml离心管中，室温，800rpm，离心5min，弃去培养液，加入新鲜培养液，将细胞吹打均匀，血球计数板计数。以6
×
105/2ml的密度加入到6孔板中；细胞培养箱，37℃，5％co2，孵育24h；取出6孔板，换新鲜培养液2ml/孔；
92.转染端粒酶逆转录酶基因：依次加入8μg/ml的polybrene和25μl/孔的慢病毒悬液(tert病毒)，moi值为30，神经纤维瘤细胞的浓度为8μg/ml，每6小时更换新鲜培养基，转染72小时；
93.转染cdk4/m抗原：依次加入8μg/ml的polybrene和25μl/孔的慢病毒悬液(cdk4/m病毒)，moi值为30，神经纤维瘤细胞的浓度为8μg/ml，每6小时更换新鲜培养基，转染72小时；
94.传代：对经转染端粒酶逆转录酶基因及转染cdk4/m抗原的细胞培养物进行传代，至少9代以上。收集存活的细胞，此时的细胞为永生化细胞。
95.3.肿瘤细胞的单克隆筛选
96.准备细胞悬液，稀释至500cell/ml的密度，移液枪向96孔板中的a1孔移取200ul稀释后的液体。移液器向96孔板中除a1孔的其它孔添加100ul培养基。从a1孔中吸取100ul培养基至b1孔，轻轻混匀，避免产生气泡。从b1孔中吸取100ul混匀后的液体至c1孔。以此类推
至h1孔。向a1-g1孔添加100ul培养基。从a1孔吸取100ul混匀后的培养基至a2孔，轻轻混匀，避免产生气泡。混匀后从a2孔吸取100ul培养基至a3从，以此类推至a12孔。(b1-b12重复此步骤)96孔板中终体积不足200ul的孔添加细胞培养基补足。将96孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养，一周后观察孔板中细胞克隆形成的情况。挑选单克隆的细胞孔并记录。
97.4.肿瘤细胞的传代培养
98.根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔2～3天更换dmem完全培养基，细胞长满皿底的70％～80％即应及时消化传代，分种率1：2，其中1瓶继续培养，1瓶冻存留种。
99.实施例二、验证方法
100.在本实施例中，提供本发明所述神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-02的验证方法。包括以下几部分。
101.1.1形态学
102.1.1.1大体形态
103.细胞接种2天后，观察群体细胞的生长状态。
104.1.1.2光镜
105.在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞形态结构及其生长特点。
106.1.1.3电镜
107.取21代细胞，透射电镜观察细胞的超微结构。
108.1.2细胞动力学
109.1.2.1细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间
110.取生长良好的对数生长期细胞(第20代)，胰酶消化细胞，轻轻吹匀，倍比稀释，以每孔100ul(2
×
103个细胞)接种于96孔板，使每孔中的细胞终浓度为2
×
103个/ml，每组6个复孔。共需准备7组。24小时后，将一组的6孔细胞中的培养液换成100ul含10％cck8的无血清培养液，同时在96孔板上取6个空白孔中加入100ul不含cck8的无血清培养液用作空白对照，37℃孵育2小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。连续7天，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。用半高度法计算细胞倍增时间。计算公式：dt＝t
×
lg2/lg(nt/no)。其中dt为细胞倍增时间，t为培养时间，no为首次记下的od值，nt为t时间后的od值。
111.1.2.2细胞贴壁率
112.取对数生长期细胞，观察细胞生长良好，胰酶消化细胞，轻轻吹匀，稀释悬液，计数，以每孔1
×
104接种于24孔板中，共8孔，于0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h时分别使用pbs轻轻洗去未贴壁的细胞，使用4％多聚甲醛固定贴壁细胞，0.1％结晶紫染色后倒置显微镜下拍照，计数贴壁细胞数量，每孔取5个随机视野。以10h时的细胞贴壁数量为最终贴壁数，计算0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h时的细胞贴壁率，并绘制贴壁率随时间变化图。
113.1.3流式鉴定细胞类型
114.利用施旺细胞表面标记抗原s100b(abnova，mab14982，0.5ug/106个细胞)对pnf1-9hosp-02细胞进行流式细胞仪分析。取100ul细胞悬液(细胞计数后用流式染色缓冲液调整浓度为1
×
107/ml)，加入0.5ug一抗，室温避光孵育15-30min，加入1～2ml流式染色缓冲液洗一次，用100ul流式染色缓冲液重悬，加入0.1ul小鼠来源荧光二抗避光孵育15-30min，加入1～2ml流式染色缓冲液洗一次，300g离心5min，弃上清，用500ul流式染色缓冲液重悬，立
即上机检测。
115.1.4细胞免疫荧光
116.制备细胞爬片，4％多聚甲醛固定后进行细胞免疫荧光s100b(sigma，s2532，1：500)染色。用含0.1％triton x-100的pbs室温孵育10分钟进行通透。用pbs洗涤爬片3次，每次5分钟。用3％bsa pbst(pbs 0.1％tween20)室温孵育30分钟进行封闭。用新鲜配置的封闭液稀释抗体(1：500)在湿盒中孵育1小时，37℃。用pbs洗涤3次，每次5分钟。用封闭液稀释二抗室温下避光孵育1小时。用pbs避光洗涤细胞3次，每次5分钟。滴加dapi进行核复染。倒置荧光显微镜下拍照，-20℃保存爬片。
117.根据本实施例，得到所述神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-02依据上述验证方法获得的验证结果如下：
118.2..1形态学
119.2.1.1大体形态
120.如图1所示，可见较多新生细胞，细胞为簇样生长，其形状不规则，排列紧密，界限清晰，接触性抑制丧失。
121.2.1.2光镜
122.如图1所示，在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞，大多呈梭型，胞浆丰富，核大而圆，核仁多个而明显，可见核分裂象。
123.2.1.3电镜
124.如图2所示，透射电镜显示细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或突出，细胞质内代谢旺盛，细胞与细胞间密切接触，接触性抑制丧失。
125.2.2细胞动力学
126.2.2.1细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间
127.细胞的7天生长曲线如图3所示。利用半高度法计算细胞倍增时间为14.4小时。
128.2.2.2细胞贴壁率
129.种植6小时后大部分细胞(95％以上)均可以贴壁生长，细胞贴壁率随时间变化如图4所示。
130.2.3流式鉴定细胞类型
131.如图5所示，利用流式细胞仪检测，pnf1-9hosp-02细胞的s100b( )细胞含量在99.38％。
132.2.4细胞免疫荧光检测s100b表达
133.如图6所示，利用细胞免疫荧光法，检测到施旺细胞特异性标记物s100b主要在胞浆内表达。
134.本发明所述pnf1-9hosp-02细胞系是来源于人i型神经纤维瘤病的良性肿瘤细胞系，具有中国人的遗传背景，与国外已有细胞系对相比，在研究中国人i型神经纤维瘤病中具有无法比拟的优势。本发明所述的pnf1-9hosp-02细胞为永生化的良性细胞，根据本发明给出的培养条件，可在体外稳定存活及传代，为神经纤维瘤相关的研究提供了良好的材料。
135.以上对本技术实施例所提供的一种来源于人i型神经纤维瘤病的肿瘤细胞系及其构建方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的
技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。