7-羟基香豆素在制备防治草鱼嗜水气单胞菌感染药剂中的应用

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及到7-羟基香豆素在制备防治草鱼嗜水气单胞菌感染药剂中的应用。


背景技术：

2.嗜水气单胞菌是当前危害水产养殖业健康发展的一类重要条件致病菌，嗜水气单胞菌感染的防治手段主要包括抗生素、疫苗、中草药等。目前仍然是抗菌药物防治为主，常用抗菌药主要包括氟喹诺酮类、氨基糖苷类、氟苯尼考、强力霉素等。
3.由于抗菌药的长期大量使用，已经造成临床分离的嗜水气单胞菌出现严重耐药现象，如对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、氟苯尼考、多西环素产生了严重耐药性，导致抗菌药治疗效果低下，嗜水气单胞菌的临床发病率居高不下。而且抗菌药在水产养殖中的使用，容易导致养殖水域中大量抗生素的残留，造成严重的环境污染；且抗菌药在鱼体中的残留还可能引起水产类食品的安全问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供7-羟基香豆素在制备防治草鱼嗜水气单胞菌感染药剂中的应用，具体为以7-羟基香豆素作为活性成分的药剂在抑制嗜水气单胞菌毒力因子、破坏嗜水气单胞菌细胞膜和细胞壁的完整性中的应用。
5.为达上述目的，本发明提供了7-羟基香豆素在制备防治草鱼嗜水气单胞菌感染药剂中的应用。
6.进一步地，7-羟基香豆素体外对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为512μg/ml，即破坏嗜水气单胞菌细胞膜和细胞壁完整性的7-羟基香豆素的有效浓度不低于512μg/ml。
7.进一步地，药剂(7-羟基香豆素)用于抑制嗜水气单胞菌毒力因子的表达。
8.进一步地，有效抑制嗜水气单胞菌毒力因子的表达的药剂中的7-羟基香豆素的浓度为16-128μg/ml。
9.进一步地，7-羟基香豆素用于破坏嗜水气单胞菌细胞膜和细胞壁的完整性。
10.优选的，7-羟基香豆素以dmso配制成100mg/ml的母液，临用前以无菌水配制成所需浓度的水溶液，dmso在溶液中浓度不超过1％，对细菌的生长和溶血活性均无影响。
11.优选的，药剂为注射剂(但不限定于注射剂，其它常规给药方式也可)，通过将7-羟基香豆素注射于草鱼腹腔中，降低草鱼死亡率，草鱼死亡由嗜水气单胞菌感染引起。
12.进一步地，降低草鱼死亡率的7-羟基香豆素的有效浓度为50-100mg/kg，其中是以草鱼的体重作为标准，即可以降低1kg草鱼的死亡率的有效浓度为50-100mg的7-羟基香豆素。
13.综上所述，本发明具有以下优点：
14.1、本发明经过草鱼动物试验表明：7-羟基香豆素直接注射于患病草鱼腹部，可以
显著减轻草鱼感染嗜水气单胞菌时的症状，同时有效降低嗜水气单胞菌感染引起的草鱼死亡率，提高存活率。
15.2、本发明经过体外试验表明：7-羟基香豆素作为一种重要的植物来源的化合物，能够抑制嗜水气单胞菌的生长并减弱其致病性。主要原理是在亚抑菌浓度(16-128μg/ml)下可以抑制嗜水气单胞菌的毒力因子，在抑菌浓度(≥512μg/ml)下则直接影响细菌的细胞膜和细胞壁的完整性发挥抗菌作用，其作用呈现明显的量效关系。
附图说明
16.图1为7-羟基香豆素对嗜水气单胞菌细胞膜的影响；
17.图2为7-羟基香豆素对嗜水气单胞菌细胞壁的影响；
18.图3为7-羟基香豆素对嗜水气单胞菌溶血作用的影响；
19.图4为7-羟基香豆素对嗜水气单胞菌生物膜的影响；
20.图5为7-羟基香豆素对草鱼嗜水气单胞菌攻毒后存活率的影响。
具体实施方式
21.以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
22.实施例1
23.本实施例提供了7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用，具体的，测定7-羟基香豆素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(mic)。
24.试验过程包括：通过微量肉汤稀释法测定药物的mic。
25.具体的：将过夜培养的嗜水气单胞菌，用pbs洗下细菌，并用tsb培养基稀释至菌浓度为1
×
106cfu/ml。在tsb肉汤中按照1:100的比例加入0.5％ttc显色剂，作为底液。试验设置9个浓度梯度的药物组、溶剂对照组、菌液对照组以及空白对照组。最高浓度组加入7-羟基香豆素，使得孔内药物浓度为4096μg/ml，再进行二倍稀释，溶剂对照组dmso添加量与最高浓度药物组添加量一致。最后加入稀释好的菌液100μl。最终的9个药物组浓度为8μg/ml-2048μg/ml。30℃培养24h，观察孔内溶液清澈透明的最低质量浓度即为该药物的mic值。
26.实验结果显示7-羟基香豆素在体外对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(mic)为512μg/ml。
27.实施例2
28.本实施例提供了7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用，具体的，7-羟基香豆素用于破坏嗜水气单胞菌细胞膜的完整性。
29.试验过程包括：将培养至对数期的嗜水气单胞菌，4500r/min，离心10min，弃去上清液后加入3ml灭菌的pbs清洗菌体，离心，重复三次。最后一次加入适量pbs清洗菌体后，加入无菌tsb培养基中，使最终菌液浓度为1
×
108cfu/ml。加入7-羟基香豆素，使药物终浓度分别为1024μg/ml(2mic)及512μg/ml(mic)，菌液对照组加入对应体积tsb；于30℃，160r/min摇床振摇培养。在0h、1h、2h、4h、6h、8h时，每组分别取3ml培养液，4500r/min离心10min，取上清，用5％的葡萄糖溶液稀释20倍后，测定电导率。绘制各组电导率随时间的变化曲线。
30.实验结果如图1所示，由图1可知，当7-羟基香豆素浓度≥512μg/ml时，可在体外有效抑制嗜水气单胞菌的生长，并能破坏嗜水气单胞菌的细胞膜的完整性。
31.实施例3
32.本实施例提供了7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用，具体的，7-羟基香豆素用于破坏嗜水气单胞菌细胞壁的完整性。
33.试验过程包括：将培养至对数生长期的嗜水气单胞菌，以无菌tsb培养基稀释至菌液终浓度为1
×
108cfu/ml。向菌液中加入7-羟基香豆素，使药物终浓度分别为1024μg/ml(2mic)及512μg/ml(mic)，于30℃，160r/min摇床振摇培养。分别于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h取3ml菌液离心(4500r/min，10min)取上清，使用碱性磷酸酶(akp)测定试剂盒，检测培养体系中，各组菌液上清中的akp酶含量，绘制akp酶含量与时间的相关性曲线，反映三种羟基香豆素对细菌细胞壁的影响。
34.实验结果如图2所示，由图2可知，当7-羟基香豆素浓度≥512μg/ml时，可在体外有效抑制嗜水气单胞菌的生长，并能破坏嗜水气单胞菌的细胞壁的完整性。
35.实施例4
36.本实施例提供了7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用，具体的，7-羟基香豆素用于抑制嗜水气单胞菌毒力因子的表达，以溶血作用的影响为检验指标。
37.试验过程包括：将过夜活化的嗜水气单胞菌菌悬液，按1％(v/v)的比例稀释菌液，加入7-羟基香豆素，使其终浓度为该药的亚抑菌浓度，分别为16μg/ml(1/32mic)、32μg/ml(1/16mic)、64μg/ml(1/8mic)、128μg/ml(1/4mic)。另外设置培养基菌液对照组、溶剂对照组和空白对照组。样品于30℃摇床，160r/min震荡共培养17h后，4500r/min离心10min。取60μl上清液，加入940μl5％兔血红细胞溶液中，空白对照组加入等量tsb培养基，混匀后置于37％培养箱内孵育20min。10000r/min离心2min，取上清，在543nm处测定吸光度。
38.实验结果如图3所示，由图3可知，当7-羟基香豆素浓度为16-128μg/ml时，在不抑制细菌生长的情况下，可呈浓度依赖性地抑制嗜水气单胞菌引起的溶血作用。
39.实施例5
40.本实施例提供了7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用，具体的，7-羟基香豆素用于抑制嗜水气单胞菌毒生物被膜的形成。
41.试验过程包括：将过夜培养的嗜水气单胞菌菌液按照1:100的比例稀释，在96孔板中每孔添加200μl稀释后的菌液，然后加入7-羟基香豆素，使其终浓度分别为低于最低抑菌浓度的16μg/ml(1/32mic)、32μg/ml(1/16mic)、64μg/ml(1/8mic)、128μg/ml(1/4mic)，另外设置培养基菌液对照组。30℃分别培养12h、24h、48h、72h后取样，测定菌液的od600值以检测细菌的浓度，弃去孔内菌液，用pbs轻轻清洗3次，加入200μl甲醇固定15min，吸出甲醇，室温下干燥。加入200μl 1％(w/v)结晶紫溶液染色30min，弃结晶紫染液，用蒸馏水冲洗至液体呈无色，室温干燥。加入33％(v/v)冰乙酸溶液洗脱染色后的结晶紫，37℃孵育30min，利用酶标仪检测od590值。采用od590/od600的比值来反映细菌生物膜的形成能力。
42.实验结果如图4所示，由图4可知，当7-羟基香豆素浓度为16-128μg/ml时，在不抑制细菌生长的情况下，可呈浓度依赖性地抑制嗜水气单胞菌生物被膜的形成。
43.实施例6
44.本实施例提供了7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用，具体的，将不
同浓度的7-羟基香豆素注射于草鱼腹腔中，检测草鱼存活率的变化。
45.包括：
46.(1)实验动物
47.试验草鱼120尾适应性饲养7天，每日按体重的3％定时饲喂三次。用加热棒加热并维持水温恒定为21
±
1℃，用增氧泵持续曝气。实验过程中的光照维持每天12h光照，12h黑暗；每日换水注水1/3。
48.(2)分组及给药
49.将120尾草鱼分为四组，每组设置3个重复组，每个重复组10尾鱼。
①
空白对照组；
②
嗜水气单胞菌感染模型组；
③
7-羟基香豆素高剂量组(100mg/kg)；
④
7-羟基香豆素低剂量组(50mg/kg)。模型组和药物组腹腔注射地塞米松注射液200μg/尾。注射地塞米松后第三天药物组腹腔注射对应剂量药物0.1ml，模型组注射等量dmso，空白对照组注射等量pbs。给药后2h，腹腔注射嗜水气单胞菌(5
×
108cfu/ml)0.1ml进行攻毒。
50.(3)存活率观察
51.观察攻毒后各组试验鱼在12h、24h、36h和48h的死亡情况，并计算各组的存活率。
52.(4)实验结果
53.草鱼存活率的变化如图5所示。由图5可知：当给草鱼腹腔注射100mg/kg、50mg/kg剂量的7-羟基香豆素时可显著减轻草鱼感染嗜水气单胞菌时的症状，同时有效降低嗜水气单胞菌感染引起的草鱼死亡率，提高存活率。草鱼感染嗜水气单胞菌48h的存活率由20.80％提升至44.80％(50mg/kg)和61.38％(100mg/kg)。
54.综上所述，亚抑菌浓度7-羟基香豆素对于嗜水气单胞菌毒力因子具有抑制作用，亚抑菌浓度为16-128μg/ml。
55.抑菌浓度7-羟基香豆素对嗜水气单胞菌细胞膜、细胞壁完整性有明显的影响，抑菌浓度需大于或等于512μg/ml。
56.7-羟基香豆素在草鱼嗜水气单胞菌感染中的应用方案包括注射浓度为50-100mg/kg均可以提高嗜水气单胞菌感染的草鱼的存活率，包括从感染嗜水气单胞菌后48h的存活率由20.80％提升至44.80-61.38％。
57.虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。