一种治疗慢性感染创面的微针贴片及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及创面修复敷料，具体涉及一种治疗慢性感染创面的微针贴片及其制备方法和应用。


背景技术：

2.体表创面是一种极为常见的疾病，人体皮肤创面一般能够在两周之内愈合。但当创面面积大、创面深、污染以及机体系统性原因导致创面不遵循正常愈合进度而迁移不愈或反复破溃时，就形成慢性创面。常见的慢性创面包括静脉性溃疡、动脉性溃疡、糖尿病性溃疡、压力性溃疡和放射性溃疡等。慢性创面引起的疼痛、睡眠障碍、活动不便等不仅严重影响患者的身心健康，还给患者带来沉重的经济负担。细菌感染是慢性创面中普遍存在的问题，较浅创面为好氧细菌的生长提供有利的环境，较深的创面为一些厌氧细菌(如破伤风梭菌)的生长提供条件，这会导致皮肤表面菌群互利共生的动态平衡被打破，造成致病菌大量繁殖进而使创面感染，出现炎症和化脓现象。化脓是血液成分如血小板、血清的渗出现象，它为致病菌生长提供了营养，导致细菌的不可控生长进入恶性循环。因此，细菌感染会导致再上皮化功能障碍、毛细血管减少、肉芽分布改变以及氧气输送障碍，使创面愈合变得更加困难。抗生素是临床上用来治疗创面感染的主要手段，然而由于环境中耐药细菌的存在以及慢性创面上细菌耐药性的增强，抗生素抗感染治疗效果降低。
3.创面组织乏氧是阻碍慢性创面愈合的另一个棘手问题，在突发性损伤后，受损的血管无法将氧气输送到创面，导致在创面周围形成缺氧环境，并且缺氧程度会随着高耗氧炎性细胞的招募逐渐加剧。慢性创面长期缺氧会抑制血管生成、再上皮化和细胞外基质合成而损害愈合过程。向乏氧的创面组织补充足够的氧气可以促使慢性创面向正常创面转变，从而有效促进创面愈合。高压氧疗法是目前临床上解决伤口缺氧问题的主要方法，但患者暴露在高压氧环境中存在体表器官如耳、鼻和眼受损的风险，甚至发生氧中毒，而且受设备限制，应用有限。
4.因此，同时解决慢性创面的细菌感染和乏氧问题对于促进慢性创面愈合至关重要。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种微针贴片。
6.其技术方案如下：
7.一种治疗慢性感染创面的微针贴片，包括水凝胶背衬，该水凝胶背衬的一侧呈阵列分布有微针，其关键在于，所述微针由水溶性材料制成，所述微针负载有声敏纳米颗粒，所述声敏纳米颗粒能够在超声激发下产生活性氧。
8.作为优选，上述声敏纳米颗粒为包载姜黄素的沸石咪唑骨架-8(ccm@zif-8)。
9.作为优选，构成所述微针针体的材料为聚乙烯醇(pva)和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。
10.作为优选，上述微针针体中pva与pvp的质量比为1:1。
11.作为优选，上述水凝胶背衬内包被有活性微生物，所述活性微生物能够在光照下通过光合作用产生氧气。
12.作为优选，上述活性微生物为蓝藻，所述水凝胶背衬的基体材料为海藻酸钙和甲基纤维素。
13.作为优选，上述水凝胶背衬内的蓝藻浓度为1.3
×
109cfu
·
ml-1
。
14.本发明的目的之二在于提供一种微针贴片的制备方法。
15.其技术方案如下：
16.一种如上任意一项所述的一种微针贴片的制备方法，其关键在于按照以下步骤进行：将所述活性微生物分散于用于形成所述水凝胶背衬的前体溶液中，然后进行凝胶化处理，制备成所述水凝胶背衬；
17.制备所述声敏纳米颗粒，然后将所述声敏纳米颗粒分散于构成所述微针针体材料的水溶液中，得到混合悬液，将该混合悬液加入微针模具中，再将所述水凝胶背衬置于所述微针模具中，干燥后形成所述微针贴片。
18.作为优选，所述混合悬液中声敏纳米颗粒的浓度为1.56～50μg
·
ml-1
。
19.本发明的目的之三在于提供一种微针贴片的用途。
20.其技术方案如下：
21.如上任意一项所述的微针贴片在制备治疗慢性创面的敷料中的应用。
22.本发明的目的之四在于提供一种创面治疗系统。
23.其技术方案如下：
24.一种创面治疗系统，其关键在于，包括如上任意一项所述的微针贴片，以及超声发生装置和白光光源。
附图说明
25.图1为本发明的微针贴片制备过程示意图；
26.图2为ccm@zif-8纳米颗粒的形貌图片，其中：(a)场发射电子扫描显微镜照片，(b)透射电子显微镜照片；
27.图3为分散于水溶液中的声敏纳米颗粒在超声激发下产生活性氧的电子自旋共振(esr)谱图，其中：(a)dmpo捕获
·
oh的esr图谱，(b)temp捕获1o2的esr图谱；三组试验条件分别为：添加ccm@zif-8纳米颗粒至水溶液中并进行超声处理(nps us)、单独对水溶液进行超声处理(us)、单独添加ccm@zif-8纳米颗粒至水溶液(nps)；
28.图4为微针的形貌图，其中：(a)载ccm@zif-8纳米颗粒和不载药的单根微针明场、暗场和明暗场叠加形貌图；(b)载ccm@zif-8纳米颗粒的微针贴片形貌图；
29.图5为包载不同浓度纳米颗粒的微针杀菌性能比较，其中：(a)大肠杆菌(e.coli)存活率，(b)耐甲氧西林金葡菌(mrsa)存活率；各组分别为：仅施加微针(nps)，无氧条件下施加微针和超声作用(nps us),有氧条件下施加微针和超声作用(nps us o2)；
30.图6为包载蓝藻的蓝藻凝胶放置不同时间后在光照下的产氧曲线；
31.图7为小鼠伤口愈合过程照片记录，其中各组分别为：对照组(control)，等待伤口自然愈合；抗生素组(antibiotic)，使用多粘菌素b进行治疗；微针针尖介导超声治疗组(sdt)，将不含蓝藻的微针贴片覆盖在伤口上，并使微针插入伤口，然后进行声动力治疗；蓝
藻贴片组(alga-gel)，蓝藻凝胶敷于伤口上并固定，光照处理；微针介导综合治疗组(mns)，将载ccm@zif-8纳米颗粒和蓝藻的微针贴片覆盖在伤口上，微针插入伤口后固定，联合进行声动力治疗和光照处理。
具体实施方式
32.以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
33.(一)微针贴片的制备
34.使用微针模具制备微针贴片，如图1所示，采用两步法制备。微针模具可使用常用的pdms模具，微针模具的模腔包括凹槽部和连接在该凹槽部下方并呈阵列分布的倒锥形盲孔。
35.先制备水凝胶背衬。然后制备声敏纳米颗粒，再将声敏纳米颗粒分散于构成微针针体材料的水溶液中，得到混合悬液，接着将该混合悬液加入微针模具中，填充倒锥形盲孔，并除去多余混合悬液，最后将水凝胶背衬置于微针模具中，干燥后形成微针贴片。
36.使用时将微针贴片覆盖在创面上，微针刺入创面组织，由于微针针体材料为水溶液材料，因此能够很快溶解并释放声敏纳米颗粒。使用超声仪的探头贴近水凝胶背衬，通过超声作用使声敏纳米颗粒产生活性氧，起到局部杀菌效果，同时提高创面组织的氧浓度。
37.在制备水凝胶背衬时，可以将活性微生物分散于用于形成水凝胶背衬的前体溶液中，然后进行凝胶化处理，制备成包埋有活性微生物的水凝胶背衬。这种活性微生物能够在光照下通过光合作用产生氧气，将微针贴片覆盖在创面上后，水凝胶背衬留在创面上，允许活性微生物在光照条件下进一步为创面供氧。
38.一类微针贴片以包载姜黄素的沸石咪唑骨架-8(ccm@zif-8)为声敏剂，以蓝藻作为活性微生物，以下实施例具体说明几种微针贴片的制备过程。实验材料如表1所示。
39.表1实验用材料
[0040][0041]
实施例1
[0042]
一种微针贴片，制备过程为：
[0043]
步骤一，采用一步法进行ccm@zif-8纳米颗粒的制备。将150mg六水合硝酸锌充分搅拌溶解在5ml去离子水中，将330mg的2-甲基咪唑和5mg的ccm充分搅拌溶解于10ml无水甲醇中。在室温下，将2-甲基咪唑和ccm的混合甲醇溶液置于磁力搅拌装置上，调节转速为100rpm，用胶头滴管将硝酸锌溶液逐滴加入混合溶液中，保持100rpm转速搅拌30min。溶液由澄清橙色液体逐渐变为不透明橙色乳状液体，待颜色稳定不再发生变化。将上述溶液转移至离心管中，于10000rpm离心15min收集橙色沉淀，用甲醇洗涤沉淀，重复多次离心，直至上清液澄清无色。最后将产物进行干燥保存，用于后续实验。
[0044]
步骤二，制备蓝藻凝胶。使用海藻酸钙/甲基纤维素共混物作为凝胶材料，在每毫升bg-11培养基中溶解30mg海藻酸钠和10mg甲基纤维素，在121℃下高压灭菌20min备用。把od
750
＝0.8的蓝藻液在6000rpm离心5min，将藻液中的蓝藻离心下来，并用pbs溶液清洗三次。在上述混合溶液中加入蓝藻颗粒，在室温下充分搅拌2h，以允许甲基纤维素充分溶胀得到均匀的糊状物。将得到糊状物平铺在载玻片上，浸泡入已灭菌的100mm氯化钙溶液，静置15min得到蓝藻凝胶，蓝藻凝胶中蓝藻浓度为1.3
×
109cfu
·
ml-1
。甲基纤维素的加入，有助于提高海藻酸钙水凝胶的韧性。
[0045]
步骤三，制备微针贴片。选择聚乙烯醇(pva)和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)作为制造微针阵列的材料，在去离子水中按pva:pvp＝1:1的质量比溶解聚合物，得到质量浓度为15％的聚合物溶液。将0.5mg上述制备好的ccm@zif-8纳米颗粒加入10ml聚合物溶液中，得到混合悬液，混合悬液中ccm@zif-8纳米颗粒的质量浓度为50μg
·
ml-1
。把适量混合悬液加入pdms模具中，填充满倒锥形孔，置于真空干燥箱中保持10min(真空度：0.09mpa)后拿出，超声除泡并将针尖上层多余溶液刮去，剪裁大小合适的蓝藻凝胶填补模具上层空缺，作为水凝胶背衬。将微针置于恒温干燥箱中干燥48h左右直至针尖部分完全干燥(温度：25℃，湿度：30％rh)，最后小心脱模取出干燥的微针贴片。
[0046]
在微针的材料选择方面，pva由于良好的生物相容性而作为候选，但pva的水溶液粘稠，在制备微针过程中不易塑形，制得的微针针体内会产生很多气泡和空腔，向pva溶液其中加入pvp可以很好的改善这一状况。通过在pva中加入不同比例的pvp制备微针，并在体式显微镜下对其形貌进行观察，发现随着pvp的加入，微针内气泡和空腔逐渐减少，当pva:pvp＝1:1时效果最好。
[0047]
实施例2
[0048]
一种微针贴片，参照实施例1的方法进行制备，不同之处在于，步骤二中，不加入蓝藻颗粒，得到的是不含蓝藻的水凝胶。
[0049]
实施例3
[0050]
一种微针贴片，参照实施例2的方法进行制备，不同之处在于，步骤三中，将ccm@zif-8纳米颗粒加入聚合物溶液中，得到50μg
·
ml-1
混合悬液，再将其稀释至25μg
·
ml-1
，用于制备微针针体。
[0051]
实施例4
[0052]
一种微针贴片，参照实施例2的方法进行制备，不同之处在于，步骤三中，将ccm@zif-8纳米颗粒分散于聚合物溶液中得到的混合悬液稀释至12.5μg
·
ml-1
，用于制备微针针体。
[0053]
实施例5
[0054]
一种微针贴片，参照实施例2的方法进行制备，不同之处在于，步骤三中，将ccm@zif-8纳米颗粒分散于聚合物溶液中得到的混合悬液稀释至6.25μg
·
ml-1
，用于制备微针针体。
[0055]
实施例6
[0056]
一种微针贴片，参照实施例2的方法进行制备，不同之处在于，步骤三中，将ccm@zif-8纳米颗粒加入混合溶液中，得到混合悬液，混合悬液中ccm@zif-8纳米颗粒的质量浓度为3.13μg
·
ml-1
。
[0057]
实施例7
[0058]
一种微针贴片，参照实施例2的方法进行制备，不同之处在于，步骤三中，将ccm@zif-8纳米颗粒加入混合溶液中，得到混合悬液，混合悬液中ccm@zif-8纳米颗粒的质量浓度为1.56μg
·
ml-1
。
[0059]
实施例8
[0060]
一种微针贴片，参照实施例2的方法进行制备，不同之处在于，步骤三中，将ccm@zif-8纳米颗粒加入混合溶液中，得到混合悬液，混合悬液中ccm@zif-8纳米颗粒的质量浓度为0.78μg
·
ml-1
。
[0061]
(二)产品表征
[0062]
ccm@zif-8纳米颗粒的形貌
[0063]
取实施例1中制备的ccm@zif-8纳米颗粒，采用常规方法制样，通过场发射电子扫描显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)表征了ccm@zif-8纳米颗粒的微观结构。如图2示，纳米颗粒形貌和尺寸规整，呈正十二面体状，平均大小为120nm。
[0064]
ccm@zif-8纳米颗粒的声动力性能
[0065]
zif-8纳米颗粒具有类声敏剂性质，在超声激发下可以产生活性氧，通过电子自旋共振(esr)对其产生的活性氧进行捕捉和鉴别。以水做溶剂，分别用5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)和4-氨基-2,2,6,6-四氢甲基哌啶(temp)作为羟基自由基(
·
oh)和单线态氧自由基(1o2)的捕捉剂，评估1o2和
·
oh的产生，记作nps us组。将3μl的temp与10.0μl的浓度为10.0μg
·
ml-1
的ccm@zif-8纳米颗粒水分散液均匀混合，超声辐照1min，超声频率为10mhz，功率密度1.5w
·
cm-2
。10μl的dmpo与50μl的浓度为100μg
·
ml-1
的ccm@zif-8纳米颗粒水分散液均匀混合，超声照射1min，超声频率为1mhz，功率密度1.5w
·
cm-2
。使用电子自旋共振光谱仪检测1o2和
·
oh的信号。设置两个对照组，其中nps组加入ccm@zif-8纳米颗粒，而不施加超声处理；另一组为us组，不加入zif-8，仅对溶液进行超声处理。
[0066]
如图3所示，电子自旋共振光谱(esr)谱图显示，单独的ccm@zif-8纳米颗粒和单独的超声处理均无明显的峰出现，而ccm@zif-8纳米颗粒经过超声作用出现了明显的dmpo-·
oh和temp-1
o2特征峰，表明ccm@zif-8纳米颗粒是一种高效的声敏剂，在超声作用下可以产生大量
·
oh和1o2，具有优异的声动力性能。
[0067]
微针形貌
[0068]
采用实施例1的方法制备不载ccm的微针贴片，制备过程的不同之处在于，步骤一中不加入ccm。
[0069]
使用荧光显微镜观测微针形貌，暗场模式下荧光显微镜rhoda通道的激发波长为
500～600nm。如图4(a)所示，不载ccm@zif-8纳米颗粒的微针不发荧光，而携载ccm@zif-8纳米颗粒的微针发射出红色荧光，这是因为ccm@zif-8具有光致发光效应。根据明场照片和荧光照片的叠加照片中荧光分布可以看出，ccm@zif-8纳米颗粒被均匀地包载在微针中。
[0070]
按照常规方法制样，使用sem观察实施例1制备的微针贴片形貌，如图4(b)所示，微针形貌规整，均匀排列在1.5cm
×
1.5cm
×
0.3cm的背衬上，圆锥形微针长度650μm，底面直径300μm，顶角3
°
，相邻针尖距离为700μm。
[0071]
微针穿刺和溶解性能
[0072]
将微针贴片稍加压贴覆于小鼠皮下组织，发现微针能够轻松刺入，在120s内，微针针体能够溶解，从而与水凝胶背衬相互分离。
[0073]
微针介导的声动力作用杀菌性能
[0074]
将实施例2～8制备的微针贴片进行声动力实验，以考察超声激发下不同浓度的载ccm@zif-8纳米颗粒的微针产生活性氧的杀菌性能。将超声仪参数固定在1.0mhz，1.5w
·
cm-2
，50％占空比，10min。分别在缺氧和给氧环境下，用不同ccm@zif-8纳米颗粒浓度的微针进行杀菌实验，并进行涂板和活死染色计算细菌的存活率，来确定纳米颗粒的最小杀菌浓度。分别使用大肠杆菌(e.coli)和耐甲氧西林金葡菌(mrsa)进行实验，实验组将微针溶于培养基中，进行超声处理，然后涂布平板；对照组仅将微针溶于培养基中，不经超声处理，然后涂布平板。
[0075]
如图5所示，由实验结果可知，随着微针中纳米颗粒浓度增大，声动力杀伤效果增强，细菌存活率降低。在给氧条件下，50μg/ml的纳米颗粒对e.coli的杀伤效率可达100％，而对于mrsa最小杀菌浓度仅为25μg/ml。
[0076]
微针背衬光控产氧性能
[0077]
首先，按照实施例1步骤二的方法制备蓝藻浓度分别为2
×
108cfu
·
ml-1
～2
×
109cfu
·
ml-1
的一系列梯度浓度的待测蓝藻凝胶(1.5cm
×
1.5cm，厚0.3cm)，比较其产氧能力。
[0078]
利用微电极测试水中溶解氧含量。取制备的待测凝胶，浸入密闭三颈瓶中的去离子水中，微电极从三颈瓶上方伸入瓶中并固定，保证微电极探头在水面以下。开始测试前通氮气除去瓶中氧气，待示数稳定后开始测试。测试过程中利用亮度为10000lx的白光对瓶中载蓝藻水凝胶进行1h照射，每隔5min对溶氧量进行三次读数，取平均值进行记录。通过比较单位时间内蓝藻凝胶的产氧能力，结果发现蓝藻浓度为1.3
×
109cfu
·
ml-1
的蓝藻凝胶(实施例1)产氧效率最高。因此，选择该浓度的蓝藻凝胶进行稳定性试验。
[0079]
为测试蓝藻凝胶的稳定性，在凝胶制备完成后，于第1、2、7、10、14天对其进行光照处理，测定其释放的溶解氧含量。
[0080]
如图6所示，包载蓝藻的水凝胶背衬在10000lx白光照射下可以产生氧气使水中溶解氧含量增高，经过60min照射，水中溶解氧含量从0mg
·
ml-1
增长至3mg
·
ml-1
，并且制备完成14天后微针的产氧性能几乎不变，表明凝胶内的蓝藻在14天内稳定保持了良好的产氧活性。
[0081]
(二)微针贴片用于创面治疗动物实验
[0082]
实施例9
[0083]
动物模型建立：使用链脲佐菌素诱导balb/c小鼠成为糖尿病小鼠，将balb/c小鼠
随机分为五组，每组至少六只。将小鼠的部分表皮层与真皮层在第1天完整切除，形成一个直径8mm的圆形缺口，露出粉色的筋膜层，将1
×
108cfu/ml的mrsa与e.coli混合菌液棉签蘸取轻涂在伤口表面，以进行细菌接种，建立细菌感染慢性创面模型。五组小鼠处理方式分别为：对照组(control)，不对创面做处理；抗生素组(antibiotic)，使用多粘菌素b进行治疗，在建模后第1～3天，每天均匀涂抹约100mg药膏于伤口表面；微针针尖介导超声治疗组(sdt)，在建模后，将实施例2制备的不含蓝藻的微针贴片覆盖在伤口上，并使微针插入伤口，然后将超声仪的探头靠近微针贴片的水凝胶背衬，对伤口进行10min声动力治疗，超声条件为1.0mhz，1.5w
·
cm-2
，50％占空比，声动力治疗在第1～3天每天进行一次；蓝藻贴片组(alga-gel)，使用实施例1步骤二制备的蓝藻凝胶敷于伤口上，并用3m透明敷料膜和医用胶带固定，每日在10000xl混合波长的光照下照射1h；微针介导综合治疗组(mns)，在建模后，将实施例1制备的微针贴片覆盖在伤口上，并使微针插入伤口，用3m透明敷料和医药胶带固定，前三天用与alga-gel组相同方式光照1h后，进行10min超声治疗，之后每天进行1h光照。每天对各组小鼠伤口拍照记录伤口愈合情况。
[0084]
如图7，从第3天起，对照组、蓝藻贴片组小鼠伤口呈现明显的炎症反应，伤口表面布满白色和浅黄色渗液，特别是对照组小鼠在第三天时伤口明显溃烂并且化脓严重，伤口创面呈浅黄色半固体状态，散发很大异味。在第6天后对照组小鼠伤口化脓减轻，但伤口表面仍有渗液，愈合速率较慢。抗生素组、sdt组和mns组的伤口表面干净且无明显渗液，在第3天后有轻微结痂，属正常现象。
[0085]
比较sdt组与对照组小鼠伤口愈合情况，发现使用不载蓝藻的微针贴片对小鼠伤口进行处理后，小鼠伤口愈合较对照组更快，并且能够减少创面炎症反应和渗出，表明载ccm@zif-8的微针超声介导治疗对小鼠伤口愈合有促进作用；比较蓝藻贴皮组和对照组小鼠伤口愈合情况，发现在第6天后，蓝藻贴皮组小鼠伤口愈合加快，说明光控产氧处理对伤口愈合有一定促进作用。
[0086]
从第3天起，mns组伤口面积始终为所有组中最小，且在第9天无肉眼可见伤口，在第12天伤口处完全愈合，毛发再生，与建模前无异，表明载有声敏纳米颗粒的微针介导超声结合光控产氧处理对小鼠创面愈合具有最强的促进作用。
[0087]
动物实验说明，微针能够将声敏纳米颗粒送入创面组织，且声敏纳米颗粒介导的超声治疗有助于减轻创面感染和炎症反应，有助于加快创面愈合。通过蓝藻的光合作用实现光控产氧，升高创面组织氧浓度，在早期对创面愈合作用不明显，但在后期有加快创面愈合的作用。然而，无论是单独声敏纳米颗粒介导的超声治疗还是单独进行光控产氧治疗，对创面修复的促进作用均不及两者相结合的综合治疗。
[0088]
现有研究发现，慢性创面由于长期反复感染和纤维增生，传统的包覆治疗难以使抗菌药物在创面深层组织达到有效治疗浓度并维持较长时间，本发明的微针贴片则能够直接将声敏纳米颗粒导入创面组织，结合超声作用，有助于深层创面组织的修复。因此，除用于急性创面外，本发明的微针贴片及治疗方法在慢性创面治疗方面将有较大潜力。
[0089]
本发明的有益效果：微针能够将声敏纳米颗粒局部导入创面组织，声敏纳米颗粒在超声激发下产生活性氧，起到杀菌和减轻创面组织炎症反应的作用，有助于创面修复，将超声介导治疗与光控活性产氧结合，能够进一步促进创面愈合，具有临床应用前景，有利于减少由于长期使用抗生素带来的细菌耐药性。
[0090]
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。