一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法及其应用

1.本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法及其应用。


背景技术：

2.原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈上升趋势。而在中国，肝癌发病率已位居恶性肿瘤第4，并且是第2位肿瘤致死病因。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, hcc)是最常见的肝癌类型，约占病例总数的90％。目前，肝癌的外科治疗包括肝切除术和肝移植术仍是肝癌病人获得长期生存最重要的手段。但手术切除治疗后面临的转移和高复发率问题是制约肝癌患者术后生存率的一大难题。
3.研究表明，肿瘤数目可作为影响肝癌患者术后早期复发的独立危险因素，对预后判断有价值。但以往的研究主要通过癌结节间的影像学特征和病理组织学表现来区分不同的转移灶，该方法不适用于早期转移或中低分化水平的肝癌患者，不能有效的阐明肝癌结节间的异质性。因此，寻找新的分子标记，更好的评估肝癌患者的转移潜能和预后进而指导临床决策，及时采取有效的个体化防治方案是提高肝癌疗效的关键。
4.全外显子组测序技术能够有效识别蛋白质编码区中的基因突变，是精准医学背景下用于检测致病突变基因和易感基因位点的常用技术。应用该技术，研究人员发现了多个与人类肝癌发生有关的驱动基因，如：tp53、arid1a、ctnnb1、cdkn2a和pten等。因此，本研究选取了具有单个和多个肝癌结节背景的肝癌病人样本进行外显子组测序，以期揭示多结节肝癌发生发展中的体细胞突变图谱和可能的调控模式，为多结节肝癌的精准医疗提供科学依据。


技术实现要素：

5.本发明一方面提供一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
6.(1)收集肝癌组织标本及对照癌旁标本；
7.(2)提取样本dna进行全外显子组测序；
8.(3)生物信息学分析。
9.优选地，所述步骤(2)的具体操作为：采取covaris技术将检测合格的dna样品打断成180-220bp的片段，采用roche nimblegen seqcap ez exome v3/agilent sureselect humanall exon v6外显子捕获试剂盒构建文库，经illumina nova seq6000系列测序仪完成双端测序。
10.更优选地，所述步骤(3)的具体操作为：原始下机数据进行过滤后得到高质量数据，将之与参考基因组序列进行比对，后再完成生物信息学分析。
11.更优选地，还包括步骤(4)结合样本的病理学信息特征进行个性化分析，得到与肝癌多结节发生密切相关的驱动基因并进行功能富集。
12.更优选地，筛选得到的肝癌结节相关驱动基因包括mtor、cdkn1a、macf1、chd8和kdm6b等。
13.本发明的另一方面提供上述筛选方法在肝癌多结节相关驱动基因筛选中的应用。
14.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
15.本发明筛选得到了多个与人类肝癌结节发生发展有关的驱动基因，如：mtor、cdkn1a、macf1、chd8和kdm6b等。因此，本发明为多结节肝癌的精准医疗提供了科学依据。
附图说明
16.图1为实施例1中单结节组和多结节组体细胞snv在基因组不同区域的分布情况图。
17.图2.1为实施例1中体细胞snv突变图谱。
18.图2.2为实施例1中突变特征分布图。
19.图3.1为实施例1中突变特征贡献图。
20.图3.2为实施例1中突变特征余弦相似度热图。
21.图4为实施例1中单结节肝癌与多结节肝癌驱动基因韦恩图。
22.图5.1为实施例1中多结节特有驱动基因go注释结果图。
具体实施方式
23.实施例1
24.1.1病例收集
25.本研究的样本来自广西医科大学肿瘤附属医院接受外科手术的14位hcc患者，收集相应肿瘤组织标本及对照癌旁标本共54例(其中，对于存在多个肝癌结节的患者，选取对应数量的癌结节组织)。所有病例的hcc诊断均由广西医科大学肿瘤附属医院病理科医生进行组织学证实，所有组织样本经外科手术切除后立即放置于液氮中冻存。本研宄符合赫尔辛基宣言原则，用于开展实验的患者样本以及研究方案均经医院中心伦理委员会批准，每位患者均已签署知情同意书。
26.1.2全外显子组测序
27.54例组织样本的dna提取采用omegatissuednakit。经检测合格的dna样品采取covaris技术打断成180-220bp的片段。采用rochenimblegenseqcapezexomev3/agilentsureselecthumanallexonv6外显子捕获试剂盒构建文库，经illuminanovaseq6000系列测序仪(illuminape150)完成双端测序。
28.1.3生物信息学分析
29.原始下机数据进行过滤后得到高质量数据(cleandata)与参考基因组序列进行比对，根据百迈客生物科技有限公司的规范流程完成后续生物信息学分析。结合样本的病理学信息特征进行个性化分析得到与肝癌多结节发生密切相关的驱动基因并进行功能富集。
30.2.结果
31.2.1质控结果
32.共计完成54个样品的外显子组测序(其中40个样品为肿瘤组织，14个样品为癌旁
对照组织)。每个样品平均产生21.86gb clean data，质量值为q30(错误率小于0.1％)的碱基比例为93.42％。样本的一致性检测(评估肿瘤组织和对照组织是否来自于同一个体)结果如表1所示：除编号为s77-1的样本以外，其余肿瘤组织与癌旁对照组织样本的一致性水平均接近99—100％，认为是一致的，而s77-1与s77-p的一致性仅为41.45％，原因可能是混样或送样有误。clean reads的比对结果如表2所示：所有样本的目标区域测序片段均能很好的比对到参考基因组上(比对百分数均达98％以上)，表明该批样本的外显子测序数据质量较好，结果可靠。
33.表1样本一致性信息
34.[0035][0036]
注：tumor_id：肿瘤样品id；normal_id：配对的正常样品id；concordance(％)：正常和肿瘤样品一致性比例；tumor contamination：肿瘤污染比例；normal contamination：为正常污染比例。
[0037]
表2样品与参考基因组比对信息
[0038]
[0039]
[0040][0041]
注：id：样品编号；total_reads：clean reads数；mapped(％)：定位到参考基因组的 clean reads数占所有clean reads数的百分比；properly mapped(％)：双端测序序列均定位到参考基因组上且距离符合测序片段的长度分布的百分比。
[0042]
2.2体细胞突变分析
[0043]
从基因组学角度上，体细胞突变被认为是引起肿瘤的重要基础，有超过95％的肿瘤是源于累积了大量dna突变的单一体细胞。识别体细胞突变是进一步明确癌基因和认定肿瘤驱动基因的必要步前提。将癌组织的基因型与癌旁正常组织的基因型不同的变异认定为体细胞突变。snv(single nucleotide variant)是指在基因组上由单个核苷酸的替换所引起的变异，针对54例hcc和癌旁组织样本，我们使用gatk软件的mutect2工具包进行体细胞snv鉴定，结果如图1所示。与单结节hcc组织样本相比，多结节组发生体细胞snv的数目明显更多。此外，单结节组与多结节组中发生snv的基因组区域均主要集中在内含子区域、基因间和外显子区域。值得注意的是，多结节组在内含子和外显子区域发生snv的数量均多于单结节组，高达两倍以上。而该区域是参与基因表达调控和编码蛋白的重要部分，由此得知，多结节的发生是多种关键基因的表达异常和调控共同作用的结果。
[0044]
2.3突变频谱和突变特征分析
[0045]
点突变共有6种变异类型:c》a/g》t，c》g/g》c，c》t/g》a，t》a/a》t，t》c/a》g，t》g/a》c。本研究中，分析wes突变频谱(如图2.1)可知：c》a/g》t替换是多结节肝癌中最常见的单核苷酸变异类型。此外，体细胞突变往往伴随着多种突变过程，包括dna复制错配、内源或外源诱变剂暴露、dna酶修饰以及dna修复缺陷等，而不同的突变过程会产生特定组合的突变类型，可称之为突变特征(mutational signatures)。为了比较单结节和多结节肝癌样本是否具有某种突变特征的偏好性，我们通过非负矩阵分解(nonnegative matrix factorization, nmf)算法，对所有hcc样本中的96种突变类型进行分解，得到了4种不同的突变特征，分别为s1-4(如图2.2)。基于每个hcc样本中4种突变特征强度的分布情况，我们进一步分析得到hcc患者突变特征贡献图。由图3.1我们得知：在肝癌多结节样本中，来自同个病人的不同肝结节的突变特征基本一致，而对于不同患者，尽管他们的癌结节数相同，但是仍会呈现显著不同的基因突变模式。这说明，本研究所收集的多结节肝癌样本属于肝内转移 (intrahepatic metastasis,im)型而非多中心起源型。值得关注的是，所有的单结节
kalrn、 mme、smarcad1、sdha、csf1r、mdn1、ints1、hnrnpa2b1、hgf、plec、nr4a3、ahnak、men1、 etv6、irs2、myo5a、tsc2、srrm2、grin2a、cnot1、cdh11、col1a1、smarca4、atrx、znf384、 epha3、trim7、ephb6、fgfr2、ahnak2、myo1d、setbp1、erg、tnfrsf14、dis3l2、cux1、 srsf2、araf、setx、blm、runx1t1、tnks1bp1、atm、ncoa3、syne1、nutm1、zfhx3、inpp4a、 fat1、eln、trrap、kiaa1549、ptk6、prdm1、olig2、cul3、lifr、il6st、hsp90ab1、bcl11b、 srcap、egfr、cobll1、ntrk1、myd88、nckipsd、itk、kcnj5、tuba1a、dido1、phlda1、nav1、 cep170、sf3b1、mecom、card11、ndrg1、stip1、nav3、cdk12、axin2、ewsr1、ezr、kmt2a、 jak1、nlrp3、anapc1、erbb4、smc4、hla-b、fam131b、nup214、herc1、matk、carm1、zeb2、 kit、ik、hist1h3b、pml、ntrk3、foxo4、kmt2c、arid1a、ahdc1、baz1b、tet1、wif1、ptprb、 rb1、amph、ar、slc34a2、ptprk、mki67、vezt、huwe1、wt1、usp6、uhrf1bp1l、ubr5、ttk、 trio、top1、tnpo1、tanc2、tal2、syk、sptan1、snd1、slc25a10、sgk1、setd2、ros1、 ralgds、rabep1、ptprc、ptch1、ppfia4、polq、per1、p4hb、nup98、notch2、nfatc2、nbpf10、 mycbp2、mst1、mkl1、mitf、mga、mef2a、mcm7、map3k4、map3k3、map1a、maml2、kif20b、 kiaa1109、ing1、il21r、hsp90aa1、foxo3、flt4、fgfr1op、fcrl4、fbn2、etv5、erc1、 epb41l3、ep300、ebf1、dst、dnajb1、ctnnd1、chd7、chd4、cfh、brca2、bcl7a、aspm、 arhgap32、arhgap26、ankrd11、akap9、aff3、abcb1、ahctf1、alk、apc、arid1b、arid2、atic、b2m、baz2a、brca1、cad、ccar1、cd79b、cdkn2a、clip1、cltc、creb3l1、dab2ip、 g3bp1、gnas、gopc、hla-a、hmgxb4、kdm5a、lepr、malt1、map3k1、mdc1、med13、mical1、 myc、ncor1、nfe2l2、nin、pax3、ptpn13、ralgapa1、rif1、sin3a、stk11、taf15、tbx3、 tert、tjp2、tlr4、tnfaip3、tpr、tshz3、znf451、znf91共244个。
[0054]
3.讨论
[0055]
多结节肝癌在临床具有较高的发病率，但并无有效的治疗措施。根据其细胞克隆来源将多结节肝癌患者分为多中心起源和肝内转移(im)两种类型，而后者在接受手术切除或肝移植后极易出现复发，一般预后不良。为了提高im病人术后的生存率，临床主要的治疗策略是防治其进一步侵袭转移，但是关于多结节肝癌的发生规律并没有较为系统的认识，因而难以取得理想的疗效。本研究通过对单结节肝癌和多结节肝癌的组织样本进行全外显子组测序分析，初步揭示了多结节肝癌的突变特征、病因学基础以及关键驱动基因。通过对多结节肝癌特有的驱动基因进行富集分析，我们发现，多结节肝癌发生发展过程中伴随着较高的肿瘤突变负荷，并且这些突变基因比较集中在调控肝癌细胞的转录失调以及各种激酶活性方面，结合驱动基因的细胞组分注释结果可知：这些驱动基因大多分布在染色体区域、微管末端和端粒区，而这些结构是基因转录环节的重要场所，这说明，多结节的演变过程中有很多关键基因被特异性的激活或沉默，如果能有效鉴别出这些分子靶点并给予适当的干预，将极大提升多结节肝癌的治疗效果。此外，我们还发现，多结节肝癌特有的驱动基因也富集在pi3k-akt 信号通路上，而该通路已被证实在肝癌组织中过表达，是促进肝癌转移的重要信号转导途径，这提示：im肝癌病人术后如果联合pi3k-akt信号通路抑制剂，或可一定程度上减小复发的概率。
[0056]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。