一种灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶的应用

技术特征：
1.灰盖拟鬼伞(coprinopsis cinerea)甘露聚糖酶在β-半乳甘露聚糖精细结构鉴定和/或水解β-半乳甘露聚糖制备甘露二糖中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甘露聚糖酶为灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶ccman5c，能够以内切方式水解β-半乳甘露聚糖主链上由带有α-(1
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6)-分支半乳糖基的甘露糖基c1位(还原端)半缩醛羟基或c4位(非还原端)羟基与其相邻的甘露糖基相应羟基形成的β-(1
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4)-甘露糖苷键以及内部的不带有α-(1
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6)-分支半乳糖基的β-(1
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4)-甘露糖苷键，产生还原末端或非还原末端带有α-(1
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6)-分支半乳糖基的甘露寡糖，以及不带有或末端不带有α-(1
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6)-分支半乳糖基的甘露寡糖，寡糖的聚合度(dp)为2-5。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶作为糖链分析工具酶应用于角豆胶β-半乳甘露聚糖(locust bean gum glactomannan polysaccharides，lbg)的水解，结合高效阴离子色谱偶联质谱方法分析和鉴定水解产物寡糖结构，得出角豆胶半乳甘露聚糖中2个带有分支的半乳糖基的甘露糖基之间间隔的不带分支半乳糖基的甘露糖基数目(m)是变化的，m可以从1至5，角豆胶β-半乳甘露聚糖具有如下精细结构：4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶水解角豆胶β-半乳甘露聚糖主要产物为甘露二糖，经分子排阻色谱法分离纯化获得甘露二糖。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶由成熟甘露聚糖酶mccman5c的cdna片段整合到表达质粒上，导入毕赤酵母菌中获得重组表达成熟甘露聚糖酶mccman5c的异源重组表达毕赤酵母菌菌株发酵获得；所述成熟甘露聚糖酶mccman5c编码基因的cdna片段以灰盖拟鬼伞菌体中提取的mrna为模板通过rt-pcr合成，或者根据编码基因的cdna序列由人工直接合成。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶ccman5c的cdna片段是指甘露聚糖酶ccman5c cdna的64-1329碱基对的核苷酸序列，即不含编码1-21位氨基酸的1-63碱基对的核苷酸序列及终止密码子的成熟甘露聚糖酶cdna(mccman5c cdna)；所述甘露聚糖酶ccman5c编码基因cdna在ncbi数据库中为cc1g_09314基因、eau91632.1基因、xp_001830154.1基因、xm_001830102.1基因或者nw_003307542.1基因，或其同源蛋白基因kag2015513.1、kag2015514.1、kag2015515.1中的任意一种；所述毕赤酵母菌为毕赤酵母菌gs115。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶异源重组表达毕赤酵母菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将固体或液体培养基上生长的灰盖拟鬼伞菌丝体或子实体，冷冻后充分研磨成粉末提取制备总rna样品，将mrna逆转录合成cdna；(2)设计引物，以步骤(1)合成的cdna为模板pcr扩增得到成熟ccman5c cdna片段(mccman5c cdna)，将mccman5c cdna片段产物和质粒ppiczαa分别经酶切处理后混合连接，并转化至感受态细胞，提取质粒，获得重组的表达质粒ppiczαa-mccman5c；
(3)将上述所获得的重组表达质粒ppiczαa-mccman5c线性化处理后电转至毕赤酵母菌细胞中，得到含有质粒ppiczαa-mccman5c的毕赤酵母菌即为重组表达成熟甘露聚糖酶mccman5c的异源重组表达毕赤酵母菌。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在在于，步骤(2)所述引物为用带ecor i酶切位点上游引物(5
’‑
agagaggctgaagctgaattcgtaggcccttggggccagt-3’)和带not i酶切位点下游引物(5
’‑
tgttctagaaagctggcggccgccccgcgagccttcatgg-3’)。9.根据权利要求5所述的应用，所述甘露聚糖酶的制备包括如下步骤：(1)将重组表达成熟甘露聚糖酶mccman5c的异源重组表达毕赤酵母菌接种培养基中，过夜培养，离心收集菌体，将菌体悬浮后接种至培养基中，扩大培养，进行诱导表达，同时取样测定培养基上清液的酶活，当酶活不再增加即终止培养；(2)将停止培养的重组菌发酵液离心收集上清，进行柱层析，收集合并有活性的重组蛋白组分，对透析缓冲液透析过夜，得到纯化的甘露聚糖酶制剂。10.一种角豆胶β-半乳甘露聚糖精细结构为：

技术总结
本发明公开了一种灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶的应用，将灰盖拟鬼伞甘露聚糖酶作为糖链分析工具酶应用于β-半乳甘露聚糖的水解，结合高效阴离子色谱偶联质谱方法分析和鉴定水解产物寡糖结构，得出β-半乳甘露聚糖精细结构；同时灰盖鬼伞甘露聚糖酶水解β-半乳甘露聚糖经分子排阻色谱法分离纯化获得甘露二糖，本发明所制得甘露二糖对DPPH自由基的清除活性是同样浓度甘露聚糖5-7倍,是其他纤维二糖、昆布二糖、乳糖、龙胆二糖、蔗糖的DPPH自由基清除率3.5-8.0倍，可用作优质功能性食品或膳食益生元。元。


技术研发人员：袁生 颜颂玲 张真庆
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2022.06.20
技术公布日：2022/9/13