过滤细胞培养基的方法和装置与流程

过滤细胞培养基的方法和装置
1.相关申请的交叉引用
2.本公开要求2020年1月30日提交的美国临时专利申请为62/967,851的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明大体上涉及流体过滤(liquid filtering)和再循环(recycling)。更具体地，本发明涉及用于从诸如细胞培养基的流体中过滤废料和/或再循环细胞培养基的方法和装置。


背景技术：

4.细胞、蛋白质或疫苗的大规模生物制造基本上存在两种主要方法：分批补料或灌注。在分批补料过程中，细胞在体积高达25,000升的生物反应器中生长，并不断补充营养物，直到毒素达到阈值(通常为5mm的氨(ammonia)且细胞达到密度高达3000万细胞/ml。在灌注过程中，通过膜(通常是中空纤维膜)过滤细胞悬浮液而不断地更换培养基。这使得毒素被洗走，同时允许细胞达到密度高达2.7亿细胞/ml，生物反应器容量高达5000升。然而，灌注过程浪费了数十个容器体积，使得生产与分批补料过程一样昂贵(尽管工厂成本降低了30％)。
5.美国专利5,071,561公开了一种从细胞培养物中去除氨的方法和设备，是通过使水性培养基与被支撑的流体膜的一侧接触(其中支撑物是微孔疏水性聚合物膜基质)；以及保持剥离溶液(strip solution)与所述膜的另一侧接触来进行的。fidel rey等人(细胞技术(cytotechnology)6:121-130；1991)公开了通过使用沸石填充床从动物细胞培养物中选择性地去除氨。
6.需要一种改进的系统或方法，用于从细胞培养基中有效地过滤废料，从而用于细胞、蛋白质或疫苗的大规模生物制造。本发明满足了这一长期需求。


技术实现要素：

7.本文公开了用于从流体培养基中的废料中分离必需材料的各种过滤装置或系统。虽然这些装置或系统可用于处理大量的流体制剂或组合物，但本公开聚焦于使用这些系统作为从细胞培养基的必需品中分离废料组分的有效且简单的方式。
8.本公开的一个方面提供了一种用于过滤流体的容器。这种容器包括沿所述容器的长度延伸的多个中空纤维，以及占据所述多个中空纤维之间的空间的至少一种固体吸附材料。各个中空纤维包括至少一个开口和由所述中空纤维的所述壁限定的内腔，所述壁具有孔隙率分布，选择性地使所述流体中包含的废料从所述内腔通过，到达所述至少一种固体吸附材料。当所述流体沿着所述内腔流动时，所述流体被过滤。
9.在一些实施方式中，所述至少一种固体吸附材料处于ph≥7的流体环境中，用于与废料有效相互作用。
10.在一些实施方式中，所述流体是细胞培养基，所述细胞培养基包含选自以下组的一种或多种材料：细胞、组织、营养物、补充剂、饲料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量材料和废料。
11.在一些实施方式中，所述废料干扰所需细胞生长和/或所需细胞分化，所述废料包括但不限于氨、乳酸盐(lactate)、毒素和钠盐。在一些实施方式中，所述废料的分子量不大于60kda。
12.在一些实施方式中，所述细胞培养基包含用于产生抗体、产生生长因子或产生培养肉而培养的组织。当所述废料从所述细胞培养基中去除时，任何产生的抗体、产生的生长因子和产生的培养肉保留在所述细胞培养基中。
13.在一些实施方式中，所述中空纤维壁的所述孔隙率分布配置为提供允许小于60kda的分子通过的平均孔径大小和孔密度。在一些实施方式中，所述孔密度为各个中空纤维的壁表面的至少10％。
14.在一些实施方式中，所述至少一种固体吸附材料是微孔硅铝酸盐材料、活性炭、离子交换树脂、带电聚合物、硅胶、粘土材料、树脂材料或其组合。
15.在一些实施方式中，所述至少一种固体吸附材料是选自以下组的树脂材料：聚酯树脂、酚醛树脂、醇酸树脂、聚碳酸酯树脂、聚酰胺树脂、聚氨酯树脂、硅树脂、环氧树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂。
16.在一些实施方式中，所述废料包含氨和所述固体吸附材料，或所述废料处理材料包含硅铝酸盐材料。在一些实施方式中，所述固体吸附材料是斜发沸石或包含斜发沸石。
17.在一些实施方式中，所述废料分子包含乳酸盐，所述固体吸附材料或所述废料处理材料包含离子交换树脂。在一些实施方式中，所述固体吸附材料是在一些实施方式中，所述固体吸附材料是ira-400或包含ira-400。
18.在一些实施方式中，所述废料分子包含两亲性毒素，所述固体吸附材料或所述废料处理材料包含碳。在一些实施方式中，所述固体吸附材料是活性炭或包含活性炭。
19.在一些实施方式中，所述废料分子包含过量的钠离子，所述固体吸附材料或所述废料处理材料包含离子交换树脂。在一些实施方式中，所述固体吸附材料是在一些实施方式中，所述固体吸附材料是252rfh或包含252rfh。
20.本公开的另一方面提供了一种用于过滤细胞培养基的系统。这种系统包括至少一个上文和本文所述的容器，用于使细胞培养基流过所述容器中的所述多个中空纤维的装置，用于循环所述细胞培养基的装置和生物反应器。
21.在一些实施方式中，用于使细胞培养基流动的所述装置是泵。
22.在一些实施方式中，所述过滤系统还可以包括至少一个传感器，配置为记录与通过所述容器的所述细胞培养基流动(the flow)和/或所述细胞培养基含量(the content)相关的至少一个参数的值。在一些实施方式中，所述系统还可以包括控制器，所述控制器电连接到所述泵和所述至少一个传感器。所述控制器被配置为基于从所述至少一个传感器接收的信号来启动所述泵。
23.在一些实施方式中，所述过滤系统还可以包括至少一个流动适配器，所述流动适配器被配置为将所述至少一个容器流体连接到再循环系统。
24.在一些实施方式中，所述再循环系统是交替切向流(alternating tangential flow,atf)系统、切向流过滤(tangential flow filtration,tff)系统或分批补料培养系统(fed-batch culturing system)或其变体。
25.在一些实施方式中，所述过滤系统包括两个或更多个流体连接到再循环系统的容器。在一些实施方式中，所述两个或更多个容器流体连接成一行或彼此平行。在一些实施方式中，所述两个或更多个容器中的每一个都被配置为处理不同的废料。在一些实施方式中，所述两个或更多个容器中的每一个都被配置为去除和/或失活两种或更多种不同的废料。
26.在一些实施方式中，所述两个或更多个容器中的每一个都包括用于处理两种或更多种不同废料的两种或更多种固体吸附材料的混合物。在一些实施方式中，所述混合物中的所述两种或更多种固体吸附材料中的每一种被分别填充在每个容器内的不同隔室中。
27.在一些实施方式中，所述过滤系统还包括被动流动容器(passive flow receptacle)。在一些实施方式中，所述被动流动容器被配置为通过渗透或扩散来再循环培养基。在一些实施方式中，所述被动流动容器与细胞培养容器不可拆卸地集成，或者可拆卸地放置在细胞培养容器内或者可拆卸地连接到细胞培养容器的内壁。在一些实施方式中，所述细胞培养容器是细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养生物反应器。
28.在一些实施方式中，所述细胞培养基是包含动物细胞的悬浮液，所述悬浮液通过泵被灌注到所述多个中空纤维中。在一些实施方式中，所述泵是正排量泵，所述正排量泵推动所述悬浮液通过所述多个中空纤维，或者在将所述悬浮液推入所述多个中空纤维和将所述悬浮液抽出进入到所述生物反应器中之间交替。
29.本公开的又一方面提供了一种用于过滤细胞培养基的方法。该方法包括使所述细胞培养基流过上文和本文所述的容器，然后使废料分子通过所述多个中空纤维的所述壁到达至少一种固体吸附材料，所述至少一种固体吸附材料存在于所述内腔外部以及所述多个中空纤维之间的空间处。在该方法中，所述营养物被保留在内腔中，同时所述废料分子离开所述内腔，并通过所述中空纤维壁，以到达至少一种固体吸附材料处于ph≥7的流体环境中。
30.在一些实施方式中，上文和本文所述的方法还可以包括从所述至少一个开口收集所述细胞培养基，并将其通过所述多个中空纤维一次或多次重新流动，从而再循环所述细胞培养基。
31.在一些实施方式中，上文和本文所述的方法涉及单个泵。
32.在一些实施方式中，上文和本文所述的方法不涉及主动泵送。在一些实施方式中，所述方法涉及使所述废料分子被动地渗透通过所述多个中空纤维的所述壁。
33.在一些实施方式中，上文和本文所述的方法涉及废料分子氨和/或乳酸盐。
34.在一些实施方式中，上文和本文所述的方法用于生长培养的肉。
35.本公开的一些方面提供了一种用于生产培养组织的方法。该方法包括在含有营养物和废料分子的细胞培养基中培养组织；以及根据上文和本文公开的过滤细胞培养基的方法过滤细胞培养基，以减少来自所述培养基的废料分子的量。
36.在一些实施方式中，所述培养的组织用于生产培养的肉。
附图说明
37.本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。专利局将根据请求和支付必要的费用提供本专利或专利申请出版物的彩色附图副本。
38.为了更好地理解本文公开的主题，并举例说明如何在实践中实施该主题，现在将参考附图仅以非限制性示例的方式来描述实施例，其中：
39.图1是在从培养基中去除废料的同时保持营养物的一般过程的流程图。
40.图2是培养基中流体再循环的示意图。
41.图3是培养基再循环装置的框图。
42.图4a和4b是使用培养基再循环装置的培养基再循环的示意图。
43.图5是在切向流过滤(tff)模式下使用包含至少一个中空纤维膜的培养基再循环装置的培养基再循环的示意图。
44.图6是用于流体(例如培养基)再循环的系统的示意图。
45.图7是闭环培养基再循环过程的流程图。
46.图8a-8b描述了不同类型的再循环装置。图8a是添加到培养基容器的至少一个可拆卸地组装的再循环装置的示意图。图8b是至少一个不可拆卸再循环装置的示意图，该不可拆卸再循环装置是培养基容器的组成部分。
47.图9a和9b是显示氨在培养基中累积(图9a)和从培养基中去除氨(图9b)的图。
48.图10是显示细胞悬浮液通过或不通过填充有沸石的中空纤维后暴露于毒性氨浓度下的细胞生存力测量的柱状图，表明氨吸附之后的细胞存活。
49.图11是显示树脂对乳酸盐的吸附的柱状图。
50.图12提供了葡聚糖和聚赖氨酸涂层中的最佳乳酸盐结合而没有葡萄糖的残余结合的指示。
具体实施方式
51.为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考实施例，并且将使用特定语言来描述这些实施例。然而，应当理解的是，本公开的范围不旨在限制本公开的范围，如本文所示的本公开的这种改变和进一步修改，被认为是本公开所涉及的领域的技术人员通常会想到的。
52.本文所使用的术语仅仅是为了描述特定实施例，而不旨在限制本发明。
53.如本文所用，术语“培养基”或“细胞培养基”包括本领域已知的任何此类培养基，包括细胞悬浮液、血液和包含生物来源成分的组合物。此类培养基和培养物可以含有细胞(哺乳动物细胞、鸡细胞、甲壳动物细胞、鱼细胞和其它细胞)、血液成分、营养物、补充剂和饲料、氨基酸、肽、蛋白质和生长因子(例如白蛋白、过氧化氢酶、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子(fgf)等)、维生素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量材料、某些盐(如钾盐，钙盐，镁盐)，以及废料如氨、乳酸盐、毒素和钠盐。培养基通常是促进所需细胞活性的水基溶液，所述细胞活性例如为培养基中培养的细胞的生存力、生长、增殖、分化。培养基的ph应适合待生长的微生物。大多数细菌在ph6.5至7.0下生长，而大多数动物细胞在ph7.2至7.4下生长旺盛。
54.如本文所用，术语“废料(waste material(s))”和“废料分子(waste molecule
(s))”可互换。这些是干扰在细胞培养基中培养的细胞的期望生长和/或期望分化，例如抑制细胞生长和/或分化或诱导细胞死亡的任何材料/分子。这些材料/分子通常选自矿物质(主要是钠盐)和小分子(低分子量分子)。作为非限制性示例，废料/分子包括但不限于氨、乳酸盐、毒素和钠盐。
55.如本文所用，“中空纤维(hollow fibers)”是细长管状膜，具体地，其可由聚合物材料或其它材料制备，或可替代地，可商购获得。作为非限制性示例，可根据本公开使用、修改或适应的中空纤维和使用该中空纤维的系统包括如下美国专利9,738,918；9,593,359；9,574,977；9,534,989；9,446,354；9,295,824；8,956,880；8,758,623；8,726,744；8,677,839；8,677,840；8,584,536；8,584,535和8,110,112中公开的那些，其中每一个通过引用并入本文。
56.如本文所用，术语“固体吸附材料(solid absorbent material(s))”和“废料处理材料(waste treatment material(s))”可互换。这些是存在于内腔外部和容器的多个中空纤维之间的空间处的材料。合适的固体吸附材料或废料处理材料包括但不限于微孔硅铝酸盐材料、活性炭、离子交换树脂、带电聚合物、硅胶、粘土材料、树脂材料及其组合。根据要从细胞培养基中去除的废料的类型，可以使用不同的固体吸附材料或废料处理材料。
57.应注意，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，术语如“包括(comprises、comprised、comprising)”等可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可以意指“包含(includes、included、including)”等；并且术语诸如“基本上由
……
组成(consisting essentially of和consists essentially of)”具有在美国专利法中赋予其的含义，例如，其允许未明确列举的元素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的元素。
58.如本文所公开，悬浮液中含有细胞的细胞培养基通过填充在固体吸附材料内的细长中空纤维集合。细长的中空纤维允许通过其多孔壁进行大小选择性过滤，由此防止营养物和其它必需品通过中空纤维壁，并因此保持在由中空纤维壁形成的内腔中，而允许废料通过多孔壁，并被吸附在固体吸附材料中。根据废料的性质和量，其与固体吸附材料的相互作用可以是可逆的或不可逆的，还可以涉及化学相互作用，该化学相互作用将废料转化成一种或多种其它材料，该其它材料与固体吸附材料的结合可以是改善的或不可逆的。
59.在一些实施方式中，细胞培养基一次或多次通过中空纤维的集合，允许尺寸选择性过滤。在一些实施方式中，允许细胞培养基在压力和允许有效过滤的其它条件下在中空纤维的内腔中流动。不考虑进行过滤的方式，由于以下原因，可以实现优异且有效的分离：(1)中空纤维的孔隙率分布对基本上仅废料通过具有选择性；(2)包括孔径在内的孔隙率分布能有效地防止蛋白质(例如白蛋白)通过，同时允许废料容易地通过至固体吸附材料；(3)选择所述固体吸附材料以与废料相互作用或通常保留废料，从而基本上防止废料流回中空纤维的内腔中；(4)固体吸附材料可在高于或等于7的ph下操作；以及(5)酸性细胞培养基不用于捕获碱性废料(例如氨)或与其相互作用，从而避免碱性废料流回中空纤维的内腔中，从而减少调节中空纤维内腔中细胞培养基的ph的需要。
60.本公开的一个方面提供了一种用于过滤流体的容器。这种容器包括沿所述容器长度延伸的多个中空纤维和占据多个中空纤维之间的空间的至少一种固体吸附材料。每个中空纤维包括至少一个开口和由中空纤维的壁形成的内腔。中空纤维的壁具有孔隙率分布，
该孔隙率分布对包含在流体中的废料从内腔到至少一种固体吸附材料的通过具有选择性，从而当流体沿内腔流动时过滤流体。
61.在一些实施方式中，所述至少一种固体吸附材料处于ph≥7的流体环境中。这种环境使得容器有效地捕获通过中空纤维壁的废料。
62.在一些实施方式中，废料的分子量不大于60kda，例如不大于55kda、不大于50kda、不大于45kda、不大于40kda、不大于35kda、不大于30kda、不大于25kda、不大于20kda、不大于15kda或不大于10kda。
63.在一些实施方式中，各个中空纤维包括第一开口和第二开口。因此，提供了一种过滤容器，该过滤容器包括沿容器的长度延伸的多个中空纤维和占据多个中空纤维之间的空间的至少一种固体吸附材料。每个中空纤维具有第一开口和第二开口，以及在第一和第二开口之间延伸的内腔。内腔具有由中空纤维的壁限定的容积，从而允许第一开口和第二开口之间的流体连通。壁具有孔隙率分布，该孔隙率分布对包含在流体中的废料从内腔到至少一种固体吸附材料的通过具有选择性。在一些实施方式中，固体吸附材料处于ph≥7的流体环境中。
64.在一些实施方式中，提供了一种过滤容器，该过滤容器具有第一面和第二面，并且包含至少一种处于ph≥7的环境中的固体吸附材料。嵌入多个中空纤维的固体吸附材料在由容器的第一面和第二面之间的距离限定的长度内延伸。中空纤维具有多孔壁，允许废料从每个中空纤维的内腔不可逆地通过到固体吸附材料，其中容器被配置为允许流体在第一面和第二面之间流动。
65.在一些实施方式中，提供了一种过滤容器，该过滤容器具有第一面和第二面，并且包含至少一种处于ph≥7的环境中的固体吸附材料。嵌入多个中空纤维的固体吸附材料在容器的第一面和第二面之间的距离限定的长度内延伸。具有多孔壁的中空纤维允许分子量不大于60kda的分子从每个中空纤维的内腔传递到固体吸附材料，其中容器被配置为允许流体沿着第一面和第二面之间的各个中空纤维的内腔流动。
66.如上文和本文所述，在各种配置中，容器包括多个中空纤维。每个中空纤维的特征在于其内腔的形状和尺寸允许细胞培养基从中流过。培养基包含一种或多种生物来源的材料，包括但不限于细胞、组织、营养物、补充剂和饲料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量材料和废料。在一些实施方式中，细胞培养基包含血细胞，并且待过滤的培养基是血液。在一些实施方式中，细胞培养基包含哺乳动物细胞、鸡细胞、甲壳动物细胞或鱼细胞。
67.在一些实施方式中，废料是在细胞培养基中培养的细胞的期望生长和/或期望分化的任何材料。例如，废料可抑制细胞生长和/或分化或诱导细胞死亡。在一些实施方式中，废料选自矿物质(主要是钠盐)和小分子(低分子量分子)。作为非限制性示例，废料包括但不限于氨、乳酸盐、毒素和钠盐。
68.在一些实施方式中，细胞或组织的培养基被过滤并再循环，其中组织被培养用于产生抗体。通过过滤，废料被从培养基中去除，同时产生的(或分泌的)抗体被保留在培养基中。
69.在一些实施方式中，细胞或组织的培养基被过滤并再循环，其中组织被培养用于产生生长因子。通过过滤，废料被从培养基中去除，同时产生的(或分泌的)生长引子被保留
在培养基中。
70.在一些实施方式中，细胞或组织的培养基被过滤并再循环，其中组织在至少一个容器(例如，生物反应器)中被培养用于产生培养肉。通过过滤，干扰培养肉的适当生长和/或引起细胞死亡的废料被从培养基中去除，而培养肉的适当生长所需的营养物被保留在培养基中。
71.为了允许培养基沿着内腔流动，每个中空纤维被配置为具有至少0.1mm、或至少0.5mm、或至少0.75mm、直至5mm的内径。在一些实施方式中，每个中空纤维被配置为具有允许细胞和直径在5至20微米之间的其它培养组分流动的内径。
72.中空纤维可以被认为是具有膜状或多孔壁的管状膜，其允许废料从内腔不可逆地通过到被固体吸附材料占据的中空纤维外部的区域。废料通过的不可逆性尤其取决于固体吸附材料不可逆地保持或结合到废料的能力。虽然在固体吸附材料上的吸附可以是动态稳定状态，其中废料具有高的结合概率和低的释放概率，但是基于它们的亲和力，可以观察到废料的不显著回流。因此，在本公开的范围内，废料的回流可能高达50％。
73.多孔中空纤维壁起到防止营养物质和其它必需材料通过的作用。这是通过选择孔隙率分布以提供最佳孔径和孔密度来实现的。可以选择每个中空纤维以具有相同的孔隙率分布。虽然孔径(截止尺寸)可能不是恒定的，但平均而言，孔径应选择为防止高分子量材料通过，同时允许小分子(即低分子量)废料容易且有效地通过。在一些实施方式中，截止孔尺寸不大于或小于6 0kda(并且不同于或大于0kda)。在一些实施方式中，平均孔径使得分子量在10至60kda之间的材料可以通过。在一些实施方式中，平均孔径使得分子量为10至20kda、10至25kda、10至30kda、10至35kda、10至40kda、10至45kda、10至50kda、10至55kda、15至60kda、20至60kda、25至60kda、30至60kda、35至60kda、40至60kda、45至60kda或50至60kda之间的材料可以通过。在一些实施方式中，截止孔径不大于10kda。
74.孔密度，即内纤维壁的每单位表面积的孔的数量，可以根据中空纤维的孔隙率而变化。在一些实施方式中，至少10％的内纤维壁是多孔的。在一些实施方式中，高达80％的内纤维壁是多孔的。
75.细胞培养基包含营养物质、必需材料和废料，其中需要分离以从培养基中去除废料。必需材料和营养物质根据其尺寸与废料区分开，因为废料是分子量低于(或不大于)60kda的材料，而必需材料和营养物质是分子量大于或等于61kda的材料。
76.对于上文和本文所述的容器，至少一种固体吸附材料在多个中空纤维之间的空间处被填充在每个容器中。换句话说，固体吸附材料可以被认为是基质吸附材料，其占据多个中空纤维外部和之间的体积。如上文和本文中所解释的，固体吸附材料可以是能够不可逆地结合(binding/associating to)至通过纤维壁的孔的废料的形式。固体吸附材料可以是树脂的形式或小球、颗粒、胶囊形式或无定形的形式。不管其形式如何，固体吸附材料可以是任何适于废料处理的材料。
77.在一些实施方式中，选择至少一种固体吸附材料，使其具有每克固体吸附材料约5至100mg的结合容量。例如，对于氨，可以使用斜发沸石，其结合容量介于9至20mg nh
4
/g沸石。膨润土可用于以约5mg nh
4
/g沸石的速率结合氨。可以用ira-400实现乳酸盐结合，其表现出每克树脂20至40mg乳酸盐的结合容量。
78.尽管如此，固体吸附材料可以选自或可以包含微孔硅铝酸盐材料、活性炭、离子交
换树脂、带电聚合物、硅胶、粘土材料和树脂材料中的一种或多种。在一些实施方式中，固体吸附材料是树脂材料，选自：聚酯树脂、酚醛树脂、醇酸树脂、聚碳酸酯树脂、聚酰胺树脂、聚氨酯树脂、硅树脂、环氧树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂。
79.在一些实施方式中，废料包含氨，固体吸附材料或废料处理材料包含硅铝酸盐材料。在一些实施方式中，固体吸附材料是斜发沸石或包含斜发沸石。
80.在一些实施方式中，废料分子包含乳酸盐，固体吸附材料或废料处理材料包含离子交换树脂。在一些实施方式中，固体吸附材料是在一些实施方式中，固体吸附材料是ira-400或包含ira-400。
81.在一些实施方式中，废料分子包含两亲性毒素，固体吸附材料或废料处理材料包含碳。在一些实施方式中，固体吸附材料是活性炭或包含活性炭。
82.在一些实施方式中，废料分子包含过量的钠离子，固体吸附材料或废料处理材料包含离子交换树脂。在一些实施方式中，固体吸附材料是在一些实施方式中，固体吸附材料是252rfh或包含252rfh。
83.在一些实施方式中，固体吸附材料是沸石。在一些实施方式中，沸石的量为7.5至600g沸石/升生物反应器体积。在一些实施方式中，沸石用于从培养基中去除氨。
84.在一些实施方式中，固体吸附剂是amberlite ira-400。在一些实施方式中，amberlite ira-400的量为750至54,000g amberlite ira-400/升生物反应器体积。在一些实施方式中，amberlite ira-400用于去除乳酸盐。
85.上文和本文描述的容器可以与交替切向流(atf)系统、切向流过滤(tff)系统或分批补料培养系统结合使用。因此，容器可以直接或间接地连接到至少一个流体流动适配器，该流体流动适配器被配置为将容器连接到交替切向流(atf)系统、切向流过滤(tff)系统或分批补料培养系统。
86.在一些实施方式中，容器直接或间接地连接到流体流动适配器，该流体流动适配器被配置为将容器连接到血液灌注系统。
87.在一些实施方式中，容器被配置为循环高达1000升的流体。
88.本公开的另一方面提供了一种用于过滤细胞培养基的系统。这种系统包括至少一个如上文和本文所述的容器；用于使介质流过容器中的多个中空纤维的装置；用于循环介质的装置；以及生物反应器。
89.在一些实施方式中，所述至少一个容器是一次性的。
90.在一些实施方式中，所述系统不含吸附柱。
91.在一些实施方式中，用于使介质流动的所述装置包括泵或者是泵。
92.在一些实施方式中，所述系统还包括至少一个传感器，被配置为记录与通过容器的培养基的流动和/或培养基的含量相关的至少一个参数的值。
93.在一些实施方式中，所述系统还可以包括控制器，电连接到所述泵和所述至少一个传感器，其中所述控制器被配置为基于从所述至少一个传感器接收的信号来启动所述泵。
94.上文和这里描述的系统还可以包括至少一个流动适配器，该流动适配器被配置为将一个或多个容器流体连接到再循环系统。作为非限制性示例，所述再循环系统可以是交
替切向流(atf)系统、切向流过滤(tff)系统或分批补料培养系统或其任何变体。在一些实施方式中，两个或更多个容器流体连接到所述循环系统。在一些实施方式中，每个容器被配置为处理不同的废料。在一些实施方式中，两个或更多个容器流体连接成一行或彼此平行。
95.在一些实施方式中，所述容器被配置为具有小于100毫升，例如小于50毫升、小于20毫升、小于10毫升、小于5毫升或任何中等、更小或更大的体积的固定体积(dead volume)。在一些实施方式中，上文和本文描述的系统中的两个或更多个容器中的每一个被配置为处理，例如去除和/或失活两种或更多种不同的废料。作为非限制性示例，废料包含氨和乳酸盐。在一些实施方式中，每个容器包含用于处理两种或更多种不同废料的固体吸附材料的混合物。在一些实施方式中，混合物中的每种固体吸附材料分别填充在容器内的不同隔室中。在一些实施方式中，不同的隔室在容器内流体连接成一行或彼此平行。
96.在一些实施方式中，所述容器是一次性的。在一些实施方式中，单个容器被配置为再循环高达1000升的流体，例如高达500升、高达100升或任何中等、更小或更大体积的流体。在一些实施方式中，当每天循环500升细胞培养基时，所述容器具有高达30天的故障前平均时间。
97.在一些实施方式中，所述系统包括被动流动容器。在一些实施方式中，被动流动容器被配置为通过渗透或扩散使来再循环培养基。在一些实施方式中，被动流动容器是细胞培养容器是细胞培养容器(例如细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养生物反应器)的附加装置或可拆卸装置。在一些实施方式中，被动流动容器至少部分浸没在细胞培养容器如生物反应器内的培养基中。在一些实施方式中，被动流动容器可拆卸地连接到细胞培养容器的壁上。可替代地，被动流动容器不可拆卸地连接到细胞培养容器上，并且是细胞培养容器的组成部分。
98.在所述系统中，培养基过滤或再循环装置与细胞培养容器(例如细胞培养板、细胞培养瓶或生物反应器)流体连通。来自容器的培养基流过过滤或再循环装置。在一些实施方式中，流入过滤或再循环装置的培养基包含悬浮培养的细胞或组织。在一些实施方式中，流入过滤或再循环装置的培养基包含细胞正常生长和/或分化所需的废料分子和营养物。作为非限制性示例，营养物包括但不限于蛋白质、激素和生长因子中的至少一种。
99.在过滤之后，与进入过滤或再循环装置的培养基中的废料分子的量相比，离开过滤或再循环装置的再循环培养基包含少于30％，例如少于20％、少于10％、少于5％、少于2％或任何中等、更小或更大百分比值的废料分子。在一些实施方式中，与进入过滤或再循环装置的培养基中所选营养物的量相比，离开再循环装置的再循环培养基包含超过60％，例如超过70％、超过80％、超过90％、超过95％或任何中等、更小或更大百分比值的所选营养物。
100.在一些实施方式中，细胞培养基是包含动物细胞的悬浮液，使用泵将该悬浮液灌注到中空纤维中。所述泵可以是正排量泵，其用于推动悬浮液通过中空纤维，或者在将悬浮液推入中空纤维和将其抽出进入到生物反应器中之间交替。在一些实施方式中，细胞由于其大小而与营养物一起保留。在一些实施方式中，使用过滤器将动物细胞保留在生物反应器中，并且仅将培养基引入中空纤维中。
101.本公开的另一方面提供了一种用于过滤细胞培养基的方法或过程。这种方法或过程包括使细胞培养基流过上文和本文所述的任何容器，并使废料分子通过多个中空纤维的
壁到达存在于多个中空纤维之间的空间处的至少一种固体吸附材料，同时将营养物保留在内腔中。通过过滤，固体吸附材料处于ph≥7的流体环境中。
102.在一些实施方式中，容器包括多个中空纤维，每个中空纤维具有第一开口和任选的第二开口以及由中空纤维的壁限定的内腔，从而允许包含废料和营养物的细胞培养基通过第一开口流动。纤维壁具有允许废料通过内腔到达存在于多个中空纤维之间的空间中的固体吸附材料的孔隙率分布。
103.在一些实施方式中，所述方法还包括从第一或第二开口，如果存在，收集细胞培养基，并使其通过中空纤维回流一次或多次，从而再循环细胞培养基。
104.上文和这里描述的系统或过程不需要复杂的反馈机制。在一些实施方式中，细胞培养基的再循环是在开环过程中进行的，即，不考虑细胞培养基中废料的水平。在一些实施方式中，系统由单个泵启动，用于从培养基中去除废料和将所需的营养物保留在培养基中。泵可以被启动，同时在培养基中保留所需的营养物和蛋白质水平。可替代地，再循环不需要将培养基主动泵送到容器中，而是基于废料通过纤维壁流向固体吸附材料的被动渗透。在一些实施方式中，通过主动泵送细胞培养基通过纤维进行培养基再循环。在一些实施方式中，细胞培养基的主动流导致废料穿透纤维壁，同时将营养物保留在细胞培养基中。在一些实施方式中，流入容器的培养基的压力高达6巴，或高达5巴、高达4巴，或任何中等、更小或更大的压力值。
105.实施例1：一般再循环过程
106.在容器中培养的细胞和/或组织分泌废料分子，例如氨、乳酸盐和两亲性毒素。另外，在细胞和/或组织生长过程中，废料分子在细胞培养基中累积。废料分子或其积累对细胞和/或组织的培养具有负面影响。例如，废料分子抑制培养材料的生长和/或分化。通常，细胞培养基在废料分子被处理(例如被去除或失活)之后被再循环，同时将对生长和分化重要的蛋白质和其他分子保留在培养基中。
107.参照图1，描述了再循环细胞培养基的一般过程。在该过程中，在框102处，将细胞培养基放置成与培养基再循环装置(例如再循环器)接触。通过泵将培养基主动地输送到再循环器中，或者可替代地，培养基通过扩散或渗透被动地进入再循环器中。将再循环器放置于培养基中，例如，用于生长和/或分化细胞或组织的容器内，或者可替代地，再循环器是容器的组成部分。该容器可以包括至少一个细胞培养板、至少一个被配置为培养细胞和/或组织的烧瓶，和/或至少一个生物反应器。
108.通常，在框104处，来自细胞培养基的废料分子由再循环器处理(图1)。再循环器使废料分子失活，例如减少或消除废料分子对培养的细胞和/或组织的生长和/或分化的影响。失活后，废料分子被保留在培养基中或转移回培养基中。可替代地，再循环器从培养基中去除废料分子，例如通过从培养基中吸附或吸收废料分子来去除废料分子。
109.在框106处，当废料分子被处理时，培养的细胞和/或组织的生长和/或分化所需的所选的分子(例如，营养物)被保留在培养基中(图1)。再循环器通过防止营养物接触用于处理废料分子的材料而将营养物保留在培养基中。为此，再循环器可以通过过滤膜选择性地防止营养物接触材料，所述过滤膜被配置为允许所选的分子从培养基通过而到达用于处理废料分子的材料。可替代地，再循环器可通过选择用于处理废料分子的材料来将营养物保留在培养基中，这些材料是惰性的，例如不结合和/或修饰至少一些特定营养物。
110.实施例2：细胞培养基再循环
111.参照图2，描述了细胞培养基再循环过程。在该过程中，在容器202中培养细胞和/或组织，例如细胞204。容器202可以包括细胞培养板、细胞培养瓶或生物反应器。细胞204在容器202内分化成更特异的细胞和/或形成组织，该组织可选地包含特异细胞的混合物。可替代地，容器202中的组织可以包含培养肉。
112.细胞204在容器202内的细胞培养基中被培养和/或分化。细胞培养基可以包含流体和营养物，例如可溶性营养物206。营养物包含蛋白质，例如白蛋白、至少一种生长因子、至少一种维生素、至少一种碳水化合物、至少一种脂质、至少一种激素、至少一种矿物质、至少一种微量元素和/或其它血清成分。
113.细胞培养基还包含废料分子208。废料分子在培养和/或分化容器202中的细胞和/或组织的培养和/或分化过程中产生。废料分子通常是细胞或组织的生长和/或分化的副产物，其干扰细胞和/或组织的所需生长或分化。随着细胞和/或组织生长和/或分化，废料分子在细胞培养基中的浓度随时间增加。废料分子包含至少一种蛋白质、至少一种化学物质或至少一种有机分子。
114.如图1的框102所示，细胞培养基再循环装置(例如再循环器210)，被放置为与容器202中的培养基接触。再循环器210包括过滤器，例如过滤膜，其被配置为允许处理废料208。其中一种处理是失活和/或从培养基中去除所选的分子。在这样做时，再循环器的过滤器被配置为允许基于分子的至少一个特征(包括但不限于大小、重量和电亲和力)来处理所选的分子。
115.仍然参照图2，再循环器210选择性地处理细胞培养基中的至少一些废料分子208，同时将营养物206保留在细胞培养基中。再循环器210还被配置为，当细胞204在悬浮液中培养时，防止细胞204从容器202中的细胞培养基中被去除。
116.实施例3：培养基再循环装置
117.参照图3，描述了培养基再循环装置。这种装置包括容器302，其具有内部空间304和围绕内部空间304的外壳306。外壳306包括一个或多个开口，所述开口的形状和尺寸被设计为允许流体(例如，培养基)进入和离开容器302。
118.容器302在空间304内包括至少一个过滤器，例如2、3、4、5、6、7、10、20、30或任何更少或更多数量的过滤器。如图3所示，过滤器308是包括内腔310的中空过滤器，内腔310的形状和尺寸被设计为允许培养基流过容器302。可替代地，过滤器308包括膜312，膜312被配置为选择性地允许所选分子从过滤器308的内腔310通过膜312流向废料处理材料314和/或进入容器空间304。选择性通过基于分子的至少一个参数，包括但不限于大小、重量和亲和力。作为非限制性示例，膜312允许分子量小于65kda、60kda、或任何中等、更小或更大值的蛋白质通过。
119.膜312的另一个非限制性特征是膜是多孔的，并且包含直径为约10kda、或约20kda、或约30kda、60kda、或任何中等、更小或更大尺寸的最大尺寸或最大孔径的孔。最大孔径高达60kda的过滤膜可防止吸附在固体表面的蛋白质通过。作为非限制性示例，这种蛋白是白蛋白，它是在细胞培养基中发现的载体蛋白质。
120.膜312通常由防止细胞或蛋白质附着到膜上的材料制成或涂覆有防止细胞或蛋白质附着到膜上的材料。孔的孔径小到足以阻止蛋白质通过孔。防止蛋白质附着到膜和/或蛋
白质通过孔是有利的，因为它防止了膜孔被培养基中的细胞堵塞。
121.仍然参照图3，容器302包含废料处理材料314，其位于容器302的隔膜312和外壳306之间。可选地，面向空间304的膜312的外表面涂覆有废料处理材料314。可替代地，废料处理材料314位于相邻过滤器之间的空间304中。废料处理材料314可以至少部分地接触过滤器的外表面，例如膜312的外表面。废料处理材料314可以以胶囊、颗粒或树脂的形式填充。
122.废料处理材料314被配置为从培养基中去除废料分子和/或使通过膜312并与废料处理材料314相互作用的废料分子失活。废料处理材料314从培养基中吸附或吸收废料分子。
123.进一步如图3所示，容器302包括至少一个流路适配器316，可选地位于其外壳306的一个或多个开口中。适配器316被配置为将容器302连接到使细胞培养容器和容器互连的培养基流动路径。这种配置包括，但不限于，将容器(其可选地为一次性容器)连接至交替切向流(atf)系统、切向流过滤(tff)系统或分批补料培养系统。作为非限制性示例，适配器316被配置为将容器连接到血液灌注系统，其中毒性分子被失活和/或从血液中去除。作为非限制性示例，毒性分子被废料处理材料314吸附。
124.实施例4：使用中空过滤器的细胞培养基再循环
125.在图4a和4b中描绘了培养基再循环过程的非限制性示例，其使用图3的再循环装置。在该过程中，细胞204在细胞培养容器202中培养。细胞204在培养基中悬浮培养，或者可替代地，细胞附着在容器202的内壁上。
126.容器202经由至少一个管与至少一个培养基再循环装置的内腔310流体连接。容器202和再循环装置可以是交替切向流atf系统、tff系统或分批补料培养系统的一部分。可替代地，再循环装置的内腔310与血液灌注系统的存储器流体连接。
127.包含培养基或血液的流体流入再循环装置的容器302的内腔310。在内腔310中流动的流体包含营养物206和废料分子208(图4a)。当通过内腔310时，流体被推向膜312，膜312被配置为允许分子从内腔310选择性地通过膜312，然后进入容器302的内部空间304(图4b)。选择性通过基于分子的至少一个参数，例如大小、形状、重量和/或亲和力。亲和力参数的非限制性示例是电亲和力。
128.作为非限制性示例，膜312包括多个孔，并且经由所述孔通过选择性。膜312允许分子量高达10kda、或高达60kda、或高达70kda的分子，或任何中等、更小或更大分子量的分子选择性地通过孔。选择性通过允许重量轻于白蛋白或小于白蛋白的分子通过膜312的孔。
129.如图4b所示，废料分子208通过膜312的孔进入容器302的内部空间304。作为非限制性示例，内部空间304填充有废料处理材料314，所述废料处理材料314被配置为使废料分子失活、吸附废料分子和/或从进入内部空间304的培养基中吸附废料分子。
130.作为非限制性示例，废料处理材料314选择性地失活、选择性地吸附和/或选择性地吸附来自流体的分子，例如废料分子208。废料分子的选择性处理可以基于选择性相互作用部分，例如共价结合至废料处理材料的外表面的选择性结合分子。这种选择性结合是基于废料分子的亲和力，这是不可逆的。
131.还如图4b所示，废料处理材料314从通过容器302的内腔310的流体中去除废料分子208。废料分子208的选择性去除是基于选择性通过膜312和/或选择性相互作用，例如与
废料处理材料314的结合、吸附和/或吸收。
132.进一步如图4b所示，与进入再循环装置的流体相比，离开再循环装置的流体包含更少的废料分子，而与进入再循环装置的流体中的营养物含量相比，离开再循环装置的流体中的营养物水平可能更低。作为非限制性示例，营养物含量的减少可以高达5％、高达2％、高达1％、高达0.5％、高达0.1％或任何中等、更小或更大的百分比。应当注意，当通过再循环装置时，流体中的营养物含量在很大程度上保持稳定。
133.离开再循环装置的流体可以返回到容器202(图4b)。可替代地，当循环装置是血液灌注系统的一部分时，流体被转移到系统的储存器和/或受试者的身体。
134.实施例5：含有中空纤维的再循环装置
135.图5描述了包含一种或多种中空纤维的流体再循环装置。流体再循环装置502包括容器504，该容器504具有由容器壁围绕的内部空间506。装置502包括在容器内部空间506中的中空纤维508、510和512。装置502还包括在中空纤维之间以及中空纤维和容器壁之间的内部空间506中的废料处理材料514。
136.中空纤维的外表面可至少部分地涂覆有废料处理材料层514。可替代地，或附加地，废料处理材料514在内部空间506中成形为小球、颗粒、胶囊或树脂的形式。可选地，废料处理材料514与中空纤维508、510和512直接接触。
137.如图5所示，来自容器518的细胞培养基，或来自储存器或受试者的身体的血液，主动地流过中空纤维的内腔516。围绕内腔516的中空纤维的膜被配置为允许流体和分子从内腔516流向容器504的内部空间506中的废料处理材料514选择性地通过。
138.作为非限制性示例，在中空纤维的外表面上涂覆一层废料处理材料514。中空纤维膜是多孔的，包括多个孔。分子的选择性通过基于孔的大小和/或形状，并且中空纤维膜和/或孔不会阻碍或干扰流体通过膜的双向通过。作为非限制性示例，中空纤维膜被配置为允许分子量小于10kda、小于20kda、小于40kda、小于60kda、小于70kda或任何中等、更小或更大重量的分子选择性地通过，流向废料处理材料。
139.通过中空纤维膜的分子与废料处理材料514相互作用。分子被废料处理材料514吸附和/或失活。当分子被废料处理材料失活时，它们以失活的形式返回中空纤维的内腔516。可替代地，失活的分子保持与废料处理材料514结合。
140.当流体通过再循环装置，例如通过中空纤维508、510和516的内腔时，对流体中废料分子进行处理。离开再循环装置502的流体返回容器518(图5)。在血液灌注系统中，离开再循环装置的血液返回到血液灌注系统的储存器或受试者的身体。
141.实施例6：再循环系统
142.图3和图5所示的再循环装置可以连接到再循环系统，例如atf系统、tff系统或分批补料培养系统。再循环系统可以是闭环系统，其中基于来自至少一个传感器的信号自动控制流动和/或再循环过程。图6描绘了这样的再循环系统。
143.循环系统602包括流体储存器604。作为非限制性示例，流体储存器可以是体液储存器，例如血液储存器、细胞培养容器(包括细胞培养板、细胞培养瓶或生物反应器)。生物反应器可用于培养细胞、组织和/或培养肉。
144.再循环系统602还包括再循环装置606，其类似于图3中所示的再循环装置302或图2中所示的再循环装置502。再循环装置606可以以从系统602拆卸这样的方式被配置。可选
地，再循环装置606是一次性的。
145.再循环装置606通过至少一个管(例如管608)与储存器604流体连接，所述管被配置为将流体从储存器输送到再循环装置606，并从再循环装置606输送回储存器604。作为非限制性示例，再循环系统602包括至少一个连接到管608的泵610。该至少一个泵610被配置为在管608中产生流体的主动流动。所述至少一个泵可被配置为产生在再循环装置606的入口中测量的压力。作为非限制性示例，再循环系统包括单个泵，从而可以为使用具有最少数量的元件再循环流体的简单系统。
146.再循环系统602可以被配置成通过去除和/或失活一种以上类型的废料分子来进行处理。作为非限制性示例，所述系统被配置为处理流体中存在的至少两种类型的废料分子。废料分子包括但不限于氨和乳酸盐。可选地，装置606可以被分成不同的部分，每个部分包含针对不同类型废料分子的不同的废料处理材料。可替代地，装置606可以包含具有废料处理材料的混合物的单个部分，用于处理不同类型的废料分子的混合物。通过使用具有单组活化参数的单个再循环元件，使用单个再循环装置来处理几种废料分子类型可以增加系统的简单性。
147.可替代地，再循环系统可以包括至少一个附加的再循环装置，例如附加的过滤器，用于处理与装置606不同类型的废料分子。附加过滤器612包括与装置606中的废料处理材料不同的废料处理材料，并且流体地连接到管608。附加过滤器612并联或成行地流体连接到装置606。至少一个泵610主动产生流入装置606和附加过滤器612的流体。这种系统对于处理具有不同结合亲和力和/或需要用不同方法处理的不同类型的废料分子是有用的，并且可以提高再循环效率。
148.再循环系统602还包括至少一个控制器614，其功能性地连接到至少一个泵610。作为非限制性示例，控制器614电连接到泵610。控制器614被配置为连续地或间歇地启动泵610。系统602还包括电连接到控制器614的存储器616。控制器614被配置为根据存储在存储器616中的至少一个启动协议(activation protocol)或其参数或指示来启动泵610。
149.再循环系统还可以包括至少一个传感器，例如流入传感器618和流出传感器620，这两个传感器都电连接到控制器614。所述至少一个传感器被配置为记录与流体再循环过程相关的至少一个参数的值，例如是管608中的流体流量、管608中的压力、再循环装置606中的压力、储存器604中的压力和流体含量。所述至少一个传感器可以是流动传感器、光学传感器、压力传感器、温度传感器、ph传感器和电传感器中的至少一个。
150.流入传感器618记录与进入再循环装置606的流体相关的至少一个参数的值。该至少一个参数包括但不限于流体温度、流体ph、流速和压力、进入再循环装置606的流体中废料分子和/或营养物的浓度或量中的至少一个。作为非限制性示例，流入传感器618被配置为记录进入再循环装置606的流体中所选类型的分子(例如氨分子和乳酸盐分子)的浓度或量。
151.流出传感器620记录与流出再循环装置606的流体相关的至少一个参数的值。该至少一个参数包括但不限于流体温度、流体ph、流速和压力、排出再循环装置606的流体中废料分子和/或营养物的浓度或量中的至少一个。作为非限制性示例，流出传感器620被配置为记录离开再循环装置606的流体中所选类型的分子(例如氨分子和乳酸盐分子)的浓度或量。
152.控制器614被配置为基于由流入传感器618和/或流出传感器620记录的信号来确定通过再循环装置606的再循环过程的效率。可选地，控制器614计算再循环效率的分数，并因此使用存储在存储器616中的至少一种算法或查找表来确定再循环效率。
153.再循环系统602还包括电连接到控制器614的用户接口622。用户接口622被配置为接收来自用户的输入和/或向再循环系统602的用户传递指示，例如人类可检测的指示。如果再循环效率低于预定值，则控制器614向用户界面622发送信号以产生人类可检测的指示，例如警报信号。
154.作为非限制性示例，如果离开再循环装置606的流体的压力和/或流速比进入再循环装置606的流体的压力和/或流速或存储在存储器616中的预定值低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或任何中等、更小或更大的百分比，则控制器614向用户接口622发出信号以产生人类可检测的指示。
155.作为非限制性示例，如果离开再循环装置606的流体中的至少一种类型的废料分子的浓度或水平是比进入再循环装置606的流体中的废料分子类型的浓度或水平高至少5％、至少10％、至少25％、至少30％、至少50％或任何中等、更小或更大的百分比，则控制器614向用户接口622发送信号以产生人类可检测的指示。
156.作为非限制性示例，如果需要更换再循环装置606，则控制器614向用户接口622发送信号以产生人类可检测的指示。
157.在图6描述的再循环系统中，在存储器604中培养的培养肉、细胞或组织接受来自外部营养源624和/或外部缓冲源626的营养物和/或缓冲液。控制器614根据向容器604输送的新鲜营养物和缓冲液，通过再循环装置606控制存储器604中的细胞培养基的再循环。
158.可以使用图3和图5中所示的装置在开环过程中再循环流体，例如细胞培养基、血液和另一种类型的体液，也就是说，不接收关于再循环效率和/或再循环过程的反馈。在开环再循环过程中，从再循环装置的过滤膜和/或废料处理材料首先暴露于空气和/或流体的时间起，在预定的时间段之后，更换再循环装置。作为非限制性示例，在从第一次暴露起的一周、一个月、三个月、六个月，或任何中等、更短或更长的时间段之后，更换再循环装置。
159.在开环再循环过程中，再循环装置可选地连接到不具有传感器的系统或包括传感器，但不基于来自传感器的信号通过再循环装置改变循环参数的系统。此外，在开环再循环系统中，系统的用户不通过再循环装置接收再循环效率变化的指示。
160.实施例7：闭环流体再循环方法
161.图7中描绘了闭环流体再循环过程。在框702处，通过各种方式，例如通过控制器(例如，图6中所示的控制器614)启动泵。可以根据存储在存储器(例如，图6中所示的存储器616)中的程序或至少一个启动参数或其指示连续地或间歇地启动泵。
162.在框704处，在启动泵时，从至少一个流出传感器接收信号。流出传感器(例如，图6中所示的流出传感器620)位于离开流体再循环装置(例如，图6中所示的装置606)的流动路径处。流出传感器记录流体再循环装置下游的流速、流体压力和流体含量中的至少一个。作为非限制性示例，流出传感器记录滤液中所选分子(例如废料分子和/或营养物分子)的水平和/或浓度。废料分子包括但不限于氨和乳酸盐分子。
163.可选地，在框706，从至少一个流入传感器接收信号。流入传感器(例如，图6中所示的流入传感器618)记录流体再循环装置上游的流速、流体压力和流体含量中的至少一个。
作为非限制性示例，流入传感器记录进入流体再循环装置的流体中所选分子(例如废料分子和/或营养物分子)的水平和/或浓度。废料分子包括但不限于氨和乳酸盐分子。
164.可选地，在框708处，基于从流出传感器接收的信号计算离开流体再循环装置606的滤液的含量。作为非限制性示例，在框708处计算滤液中所选分子(例如废料分子和/或营养物分子)的水平和/或浓度。废料分子包括但不限于氨和乳酸盐分子。
165.基于在框704处从流出传感器接收的信号和/或在框708处计算的滤液含量，在框710处确定流体再循环效率。作为非限制性示例，基于滤液含量(即，离开再循环装置的流体含量)与进入再循环装置的流体含量之间的差值来确定流体再循环效率。可替代地，或附加地，基于进入再循环装置的流体和离开再循环装置的流体之间的流速和/或压力的变化来确定流体再循环效率。
166.在框710处确定流体再循环效率时，如果与未使用再循环装置的流体再循环效率相比，流体再循环效率降低高达50％，例如高达30％、高达20％、高达10％、高达5％或任何中等、更小或更大的百分比，则泵启动在框712处继续，而不改变泵启动参数。如果与未使用再循环装置的再循环效率相比，流体再循环效率降低超过50％，例如超过60％、超过70％、超过80％或任何中等、更小或更大的百分比，则在框714处修改泵启动。作为非限制性示例，泵被启动以产生流体压力的增加和/或进入再循环装置的流体流量的增加。如果在框716处停止泵启动，则在框718处，向用户传送指示，例如警报信号。
167.实施例8：再循环装置
168.不同的再循环装置可以用于再循环过程。图8a描绘了可拆卸组装的再循环装置。细胞培养物再循环装置被配置为处理流体(例如培养基)中的废料分子，同时保留培养基中的营养物。如图8a所示，与图3所示的装置302类似的再循环装置802被放置在细胞培养容器804内。可替代地，再循环装置被配置为通过装置的至少一个连接适配器可拆卸地连接到细胞培养容器的壁上。当再循环装置连接到容器上时，在容器和装置之间形成流体路径，这允许培养基流入和流出再循环装置。
169.可拆卸组装的流体再循环装置在预定时间段之后被更换。可选地，所述再循环装置包括指示器，例如比色指示器，其被配置为传递关于所述再循环过程效率的指示。作为非限制性示例，再循环效率由再循环装置中废料处理材料的结合饱和水平来指示。再循环装置802的至少一个壁包括过滤膜或涂有过滤膜(例如，图3中所示的过滤膜312)，以允许分子(例如，废料分子)选择性地向填充在再循环装置的内腔803中的废料处理材料渗透/通过。
170.图8b描述了一个整体的或不可拆卸的再循环装置。流体再循环装置806与细胞培养容器808集成。容器808和装置806之间的壁810包括一个或多个开口，所述开口的形状和大小被设计为，允许培养基朝向装置806的内腔811内填充的废料处理材料渗透到装置806中。壁810包括过滤膜(例如，图3中所示的过滤膜312)或至少部分地涂覆有过滤膜(例如，图3中所示的过滤膜312)，其允许分子(例如，废料分子)选择性地渗透到内腔811中。
171.实施例9：氨分子的去除
172.氨是细胞生长和/或分化的副产物，不受任何理论的束缚，高浓度时可能对培养的细胞有毒。图9a示出了氨分子随着时间在细胞培养基中积累，从氨浓度随时间的增加中可以看出。
173.图9b示出了从用naoh溶液洗涤的填充的中空纤维中主动地去除氨。在该研究中，
氨以约11mm的浓度溶解在磷酸盐缓冲盐水中，并以4ml/min的流速通过表面积为140cm2和10kda孔的中空纤维(xampler
tm
型ufp-10-c-3ma)。将三(3)克斜发沸石(沸石)填充到中空纤维的壳体积中。注意到再循环过程在几分钟内将氨浓度从约11mm降低到约5mm。斜发沸石在连续灌注20分钟后变得饱和，然后在30分钟内被净化，此时每克沸石结合9mg氨。
174.实施例10：细胞存活率
175.检测通过中空纤维的细胞的存活率。如下表1a和1b所示，将自发永生化的鸡细胞在含有10％胎牛血清的dmem培养基中培养，并以4ml/min的流速(表1a)和8ml/min的流速(表1b)引入树脂填充的中空纤维中。在这两种情况下，细胞在离开中空纤维时表现出很高的生存力(viability)，并且显然不受剪切速率的影响。
176.表1a
[0177][0178]
表1b
[0179][0180]
实施例11：氨汽提
[0181]
将fmt-scf2鸡细胞系以0.3百万细胞/ml的密度悬浮在基线培养基或添加有8mm氨的培养基中。使含有氨的细胞悬浮液通过具有10kda孔径的中空纤维，所述中空纤维的壳装载有9g斜发沸石(沸石)。如下表2所示，含有8mm氨的未处理细胞悬浮液在24小时内显示出71％的生存力。相反，沸石填充的中空纤维从悬浮液中去除了氨，这将悬浮液中氨的浓度从约8.1mm降低到约5.2mm，因此允许细胞在24小时内以90％的生存力存活。
[0182]
表2
[0183] 基线对照中空纤维细胞密度[百万/毫升]0.390.530.44过程存活率[9％]97％95％96％葡萄糖[g/l]3.93.63.8氨[mm]0.68.15.2长期生存力[％]97％71％90％
[0184]
图10描绘了从培养基中去除有毒浓度的氨。黑色柱代表处理前所有条件的初始细胞生存力。黄色柱和绿色柱代表在处理后24小时测量的细胞生存力。在不存在氨的情况下培养的细胞(“对照”)在培养摇瓶(黄色柱)，或者在通过树脂填充的中空纤维筒(绿色柱)之后，保持大于90％的生存力。在8mm氨(“ammonia”)存在下，培养的细胞显示出不同的行为，因为未处理的细胞的生存力在24小时内下降至约71％(黄色柱)，而通过树脂填充的中空纤
维筒的细胞保持了大于90％的生存力。
[0185]
实施例12：乳酸去除
[0186]
树脂通过离子交换机理吸附乳酸盐。在该研究中，检测了不同树脂，例如阴离子树脂ira-67、ira-96、ir-120和ira-400的乳酸盐吸附容量。将浓度为约50mm的乳酸钠溶解在含高葡萄糖的dmem培养基中。将含有乳酸盐的培养基与2克树脂在50ml锥形管中混合60分钟。使用flix2生物分析仪(flix2 bioanalyzer)(nova biomedical公司)测量分析值(表3)。
[0187]
如下表3和图11所示。阴离子树脂ira-67、ira-96、ir-120和ira-400在60分钟内结合10％的乳酸盐(每50毫升2克)，而不影响培养基的葡萄糖水平、ph水平(ir-120除外)或矿物盐(ir-120除外)组成。
[0188]
表3
[0189][0190]
用聚阳离子右旋糖酐(polycations dextran)(dex)和聚赖氨酸(pll)涂覆ira-400树脂，以改善与乳酸盐的结合效率。将100mm的乳酸盐加入到含有4.5g/l葡萄糖的细胞培养基中。将细胞培养基与涂覆的树脂一起培育24小时。在ph为7.4时，测量最佳的乳酸盐结合，再右旋糖酐和聚赖氨酸涂层中均达到初始乳酸盐浓度的约25％，而没有葡萄糖的残余结合(图12)。
[0191]
预计在本技术专利有效期内，将会开发出许多相关的中空纤维和废料处理材料；术语中空纤维和废料处理材料的范围旨在包括所有这些先验的新技术。
[0192]
尽管已经详细描述了本发明及其优点，但是应当理解，在不脱离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在此进行各种改变、替换和变更。
[0193]
本领域的技术人员将容易理解，本发明非常适于实现所述目的并获得所述目的和优点，以及其中固有的那些。本发明的实施例以及本文所述的方法目前是优选实施方式的代表，是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。本领域的技术人员将会想到其中的变化和其他用途，这些变化和用途包括在由权利要求的范围所限定的本发明的精神内。