一种制备EGCG-3”-Me的方法

一种制备egcg-3
”‑
me的方法
技术领域
1.本发明属于物质制备技术领域，尤其涉及一种制备egcg-3
”‑
me的方法。


背景技术：

2.茶叶是全球公认的健康饮料。近年来有研究表明，茶叶中的甲基化儿茶素类成分，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)的甲基化衍生物，尤其是(-)-表没食子儿茶素3-o(3-o-甲基)没食子酸酯(egcg-3
”‑
me)具有显著的抗过敏功效，特别是对预防和抑制花粉导致的过敏症状尤为显著。因此，egcg-3
”‑
me的抗过敏功能是近年来茶叶生物活性功能的研究热点。
3.富含egcg-3
”‑
me的产品受到了消费者的广泛欢迎，目前已初具市场规模。在食品和生物医药领域对egcg-3
”‑
me的需求量也日渐增加，所以，egcg-3
”‑
me合成的研究具有十分重要的意义。
4.已有的研究结果表明，除少数茶树资源中含有相对较高的egcg-3
”‑
me，其他茶树品种中egcg-3
”‑
me含量极低。egcg-3
”‑
me已有的合成方法主要包括化学合成法和生物酶法。化学合成法中反应条件苛刻，副产物多且分离提纯难度较大，同时大量有机溶剂和基团保护剂的使用，使得该方法合成的egcg-3
”‑
me很难应用于食品领域。体外酶法合成具有酶促合成反应共有的特点，反应条件温和相对较为安全、专一性强且产物单纯，在反应液中egcg-3
”‑
me分离简便。但是目前已有的体外酶法合成研究结果表明，实验室条件下，体外表达的茶树egcg-o-甲基转移酶合成egcg-3
”‑
me实验中egcg转化率较低，底物损失大，产率低，成本高，并不适合用于egcg-3
”‑
me的大量生产。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备egcg-3
”‑
me的方法，采用本发明的方法产率高，适合大规模生产。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种制备egcg-3
”‑
me的方法，包括以下步骤：
8.1)将茶树egcg-o-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
9.所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/l，氯化镁的浓度为2mmol/l，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/l；
10.所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
11.所述茶树egcg-o-甲基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；
12.所述茶树egcg-o-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/ml；
13.所述茶树egcg-o-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
14.2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到egcg-3
”‑
me。
15.优选的，当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度为
0.4mmol/l。
16.优选的，当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/l。
17.优选的，当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/l。
18.优选的，所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；
19.当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/ml，橘皮素的浓度为0.16mg/ml，陈皮甙的浓度为1.40mg/ml；
20.当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/ml，橘皮素的浓度为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度为1.47mg/ml；
21.当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/ml，橘皮素的浓度为0.45mg/ml，陈皮甙的浓度为1.51mg/ml；
22.当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/ml，橘皮素的浓度为0.04mg/ml，陈皮甙的浓度为1.47mg/ml；
23.当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/ml，橘皮素的浓度为0.16mg/ml，陈皮甙的浓度为1.56mg/ml。
24.优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/ml，橘皮素的浓度为0.03mg/ml，陈皮甙的浓度为1.14mg/ml。
25.优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/ml，橘皮素的浓度为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度为1.50mg/ml。
26.优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.01mg/ml，橘皮素的浓度为0.03mg/ml，陈皮甙的浓度为1.54mg/ml。
27.优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/ml，橘皮素的浓度为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度为0.07mg/ml。
28.优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/ml，橘皮素的浓度为0.14mg/ml，陈皮甙的浓度为1.12mg/ml。
29.本发明制备egcg-3
”‑
me的机理为：
30.在一定条件下，茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和多甲氧基黄酮为底物，催化合成egcg-3
”‑
me。
附图说明
31.图1为陈皮甙反应结果hplc图；
32.图2为橘皮素反应结果hplc图；
33.图3为川陈皮素反应结果hplc图；
34.图4为柑橘果实多甲氧基黄酮反应结果hplc图。
具体实施方式
35.本发明提供了一种制备egcg-3
”‑
me的方法，包括以下步骤：
36.1)将茶树egcg-o-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
37.所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/l，氯化镁的浓度为2mmol/l，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/l；
38.所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
39.所述茶树egcg-o-甲基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；
40.所述茶树egcg-o-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/ml；
41.所述茶树egcg-o-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
42.2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到egcg-3
”‑
me。
43.在本发明中，所述egcg-o-甲基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
44.matngegeqnlrhqevghksllqsdalyqyiletsvyprepeamkelrevtakhpwnimttsadegqflnmllklinakntmeigvytgysllatalalpddgkilamdinrdnfeiglpiiekagvahkidfregpalpaldkmiedgkhhgsfdfifvdadkdnyinyhkrlidlvkvggligydntlwngsvvappdapmrkyvryyrdfvlelnkalaadprieicmlpvgdgitlcrrvc。
45.本发明对所述egcg-o-甲基转移酶的制备方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规制备方法即可，在本发明具体实施方式中，采用咖啡酰辅酶ao-甲基转移酶基因(genbank accession no.dd361102)，通过大肠杆菌表达体系制备茶树egcg-o-甲基转移酶。
46.本发明将得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到egcg-3
”‑
me。在本发明中，所述反应后还优选加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，得到egcg-3
”‑
me。
47.在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度优选为0.4mmol/l。在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度优选为0.4mmol/l。在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.4mmol/l。
48.在本发明中，所述多甲氧基黄酮优选来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.12mg/ml，橘皮素的浓度优选为0.16mg/ml，陈皮甙的浓度优选为1.40mg/ml；当所述多甲氧基黄酮优选来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.24mg/ml，橘皮素的浓度优选为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度优选为1.47mg/ml；当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.28mg/ml，橘皮素的浓度优选为0.45mg/ml，陈皮甙的浓度优选为1.51mg/ml；当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.05mg/ml，橘皮素的浓度优选为0.04mg/ml，陈皮甙的浓度优选为1.47mg/ml；当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/ml，橘皮素的浓度优选为0.16mg/ml，陈皮甙的浓度优选为1.56mg/ml。
49.在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.02mg/ml，橘皮素的浓度优选为0.03mg/ml，陈皮甙的浓度优选为1.14mg/ml。
50.在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓
1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为278.34μg/ml，egcg转化率为71.20％。
64.实施例3
65.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和陈皮甙为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
66.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15ml陈皮甙反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.4mmol/l陈皮甙、0.3mmol/l egcg、100mmol/l tri-hcl ph＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为305.14μg/ml egcg转化率为97.15％。
67.实施例4
68.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和茶枝柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
69.取10.0g茶枝柑，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茶枝柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到茶枝柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.12mg/ml，橘皮素的浓度为0.16mg/ml，陈皮甙的浓度为1.40mg/ml)，备用。
70.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml茶枝柑多甲氧基黄酮反应液中(即：含有2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg的茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液15ml)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为10.50μg/ml。
71.实施例5
72.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和柠檬多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
73.取10.0g柠檬，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g柠檬，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到柠檬多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即柠檬多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.02mg/ml，橘皮素的浓度为0.03mg/ml，陈皮甙的浓度为1.14mg/ml)，备用。
74.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml柠檬多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml柠檬多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲
醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为8.50μg/ml。
75.实施例6
76.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和甜橙多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
77.取10.0g甜橙，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g甜橙，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到甜橙多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即甜橙多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/ml，橘皮素的浓度为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度为1.50mg/ml)，备用。
78.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml甜橙多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml甜橙多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为11.25μg/ml。
79.实施例7
80.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和温州蜜柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
81.取10.0g温州蜜柑，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g温州蜜柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到温州蜜柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.24mg/ml，橘皮素的浓度为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度为1.47mg/ml)，备用。
82.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml温州蜜柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为11.09μg/ml。
83.实施例8
84.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和椪柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
85.取10.0g椪柑，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g椪柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到椪柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即椪柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.28mg/ml，橘皮素的浓度为0.45mg/ml，陈皮甙的浓度为1.51mg/ml)，备用。
86.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml椪柑多甲氧
基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml椪柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为10.32μg/ml。
87.实施例9
88.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和无核蜜桔多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
89.取10.0g无核蜜桔，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g无核蜜桔，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到无核蜜桔多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.001mg/ml，橘皮素的浓度为0.03mg/ml，陈皮甙的浓度为1.54mg/ml)，备用。
90.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml无核蜜桔多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为10.21μg/ml。
91.实施例10
92.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和沙田柚多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
93.取10.0g沙田柚，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沙田柚，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到沙田柚多甲氧基黄酮干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即沙田柚多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.03mg/ml，橘皮素的浓度为0.02mg/ml，陈皮甙的浓度为0.07mg/ml)，备用。
94.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml沙田柚多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml沙田柚多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为2.08μg/ml。
95.实施例11
96.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和砂糖橘多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
97.取10.0g砂糖橘，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g砂糖橘，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到砂糖橘多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即砂糖橘多
甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.04mg/ml，橘皮素的浓度为0.14mg/ml，陈皮甙的浓度为1.12mg/ml)，备用。
98.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml砂糖橘多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为8.06μg/ml。
99.实施例12
100.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和沃柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
101.取10.0g沃柑，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沃柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到沃柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即沃柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.05mg/ml，橘皮素的浓度为0.04mg/ml，陈皮甙的浓度为1.47mg/ml)，备用。
102.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml沃柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml沃柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为11.23μg/ml。
103.实施例13
104.茶树egcg-o-甲基转移酶以egcg和茂谷柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素egcg-3
”‑
me：
105.取10.0g茂谷柑，80℃条件下加入30ml 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茂谷柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到茂谷柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/ml，橘皮素的浓度为0.16mg/ml，陈皮甙的浓度为1.56mg/ml)，备用。
106.取1ml茶树egcg-o-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15ml茂谷柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/l mgcl2、2mmol/l二硫苏糖醇、0.3mmol/l egcg溶解于15ml茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2ml 1.0mol/l盐酸终止反应，加入25ml乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0ml纯甲醇复溶，hplc检测egcg-3
”‑
me生成量为12.46μg/ml。
107.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。