酸樱桃发酵制得的具有良好保健功能的组合物及其在健康领域的应用的制作方法

1.本发明涉及酸樱桃活性成分利用技术领域，尤其涉及酸樱桃发酵制得的具有良好保健功能的组合物及其在健康领域的应用。


背景技术：

2.酸樱桃(pruuus cerasus l,sour cherry,tart cherry)属蔷薇科(rosacesa)李属(prunus l)经济树木，果实为核果，鲜红色至暗红色。酸樱桃起源于亚洲西部及黑海沿岸，属温带植物。根据产地和含酸量的不同，酸樱桃可分为产在北美的含酸量较低的amarelles类群和产在欧洲的含酸量较高的morellos类群目前，研究较多的品种有balaton、montmorency、english morello、msuhybrid、evan和sk carmine jewel等。酸樱桃果实主要用于制造果酱、果脯、酒类、饮料、调味剂等产品其果实营养丰富、均衡，尤其富含花青素、各种花色普、大量的褪黑激素等黄酮类化合物具有调节睡眠、清除自由基、抗氧化作用，能缓解关节炎和痛风的疼痛、抗癌、预防心血管疾病等。酸樱桃果实营养丰富、均衡，低热量(58卡路里)、低糖(14％)、低脂肪(0.3％)，而且，富含石炭酸(480～990mg/kg)、蛋白质(占鲜重的1.2％)，va(20％)等。另外，酸樱桃果实中已报道含有的多酚类物质多大18～22种，例如没食子酸、香豆素、鞣花酸、堪非醇、槲皮素绿原酸，但是这些物质大多含量不超过其果实鲜重的1.5％，因而在实际活性成分提取过程中收率过低，不利于大规模生产，难以实现有效的经济利用。有别于日常食用的甜樱桃，酸樱桃个头小，外表颜色鲜红。因为需要特殊的种植技术和气候条件，在亚洲几乎没有种植，主要产区位于北美和东欧。
3.虽然很少直接食用，酸樱桃却含有比一般甜樱桃高出数倍的花青素，褪黑激素，以及抗氧化功能。酸樱桃具有降低尿酸，缓解痛风，改善睡眠等作用。作为天然食物，对肝肾和其它器官没有任何刺激。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于一种快速提升酸樱桃中相关活性成分的方法，以为快速大规模获得这些活性成分提供帮助，以为充分发挥这些活性成分的产品用途提供保障。通过对酸樱桃发酵，促使其中多酚类物质和多糖类物质含量进行显著提升，可降低尿酸、抑制痛风炎症、延长睡眠、改善心脑血管疾病、延长睡眠、降低胆固醇和三酸甘油酯、促进体内乳酸排泄缓解肌肉疼痛和抗氧化，具有良好的保健效果。
5.第一方面，本发明实施例公开了一种对酸樱桃进行发酵的方法，包括以下步骤：获得溶藻菌菌株，将该溶藻菌接种于含有酸樱桃的培养基中进行培养发酵，收获并提纯发酵液以获得发酵产物，所述发酵产物包含相对于所述酸樱桃或所述酸樱桃处理物中含量产生差异化提升的活性成分，所述活性成分至少包含多酚类物质和/或多糖物质。
6.在本发明实施例中，所述溶藻菌为节杆菌。
7.在本发明实施例中，所述培养基包含0.5wt％酸樱桃处理物、0.15wt％的蛋白胨、
0.1wt％淀粉、0.04wt％(nh4)2hpo4、0.01wt％kcl和0.05wt％mgso4·
7h2o，所述培养基ph值调整为7.0，对节杆菌的培养温度为25
±
0.5℃。
8.在本发明实施例中，所述溶藻菌为不动杆菌。
9.在本发明实施例中，所述培养基包括0.5wt％酸樱桃处理物、0.15wt％的蛋白胨、0.025wt％k2hpo4、0.015wt％(nh4)2so4、0.01wt％kcl和0.05wt％mgso4·
7h2o，所述培养基ph值调整为7.0，对不动杆菌的培养温度为35
±
0.5℃。
10.第二方面，本发明实施例公开了第一方面涉及的方法制备得到的组合物，所述组合物包含多酚类物质和/或多糖类物质。
11.在本发明实施例中，所述多酚类物质包括绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸、矢车菊-3-o-葡萄糖苷、矢车菊-3-芸香糖苷、矢车菊-3-槐糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-芸香糖苷。
12.在本发明实施例中，所述多糖物质包括dt1、dt2和dt3，dt1由半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖和果糖构成，dt2和dt3均有由半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、夫糖、甘露糖和果糖组成。
13.在本发明实施例中，所述dt1分子中含有单糖的摩尔百分比例为半乳糖醛酸29.82％、葡萄糖醛酸39.55％、阿拉伯糖7.5％、葡萄糖1.78％、鼠李糖5.94％和果糖15.41％，所述dt2分子中半乳糖醛酸28.83％、葡萄糖醛酸36.21％、阿拉伯糖9.63％、半乳糖5.11％、葡萄糖3.21％、夫糖2.06％、甘露糖0.89％和果糖14.06％，所述dt2分子中半乳糖醛酸26.96％、葡萄糖醛酸38.05％、阿拉伯糖6.08％、半乳糖4.23％、葡萄糖12.25％、夫糖3.85％、甘露糖0.76％和果糖7.82％。
14.第三方面，本发明实施例公开了第一方面方法制备的发酵产物、或第二方面涉及的组合物在制备降低机体尿酸类制剂和/或痛风发作中的应用。
15.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
16.本发明中涉及本发明实施例实际上利用溶藻菌对酸樱桃进行发酵，通过溶藻菌的代谢促使酸樱桃中具有药理作用的活性成分得以提升，这些活性成分包含多酚类物质和多糖物质，这些物质参与了溶藻菌的生长和代谢过程，实现了从酸樱桃中得到过低含量进行溶出、转变和积累，最终富集在发酵产物中，仅需对发酵产物中的多酚类物质和多糖物质进行简单地提取和收集，即可完成大规模地富集这些活性成分的工作，收获的产率大大提升，并且还能实现这些活性成分的有效药用。
17.本发明实施例通过对酸樱桃发酵，促使其中多酚类物质和多糖类物质含量进行显著提升，并通过动物实验验证了这些活性成分的药效作用，不仅能够达到别嘌呤醇的药效作用，还相对于别嘌呤醇具有极小的副作用，具有发展成为替代别嘌呤醇作为降尿酸和/痛风的新型产品，而且这些制备方式为生物合成法，环境友好，成本低廉，具有大规模发展的应用前景。
附图说明
18.图1为本发明实施例1提供的发酵产物的hplc-esi-ms/ms的结果图。
19.图2为本发明实施例1提供的发酵产物的hplc-esi-ms/ms的结果图。
20.图3为本发明对比例1提供的发酵产物的hplc-esi-ms/ms的结果图。
21.图4为本发明对比例2提供的乙醇提取物的hplc-esi-ms/ms的结果图。
22.图5为本发明对比例3提供的初始提取物的hplc-esi-ms/ms的结果图。
23.图6为本发明实施例提供的dt1的gpc分析结果图。
24.图7为本发明实施例提供的dt2的gpc分析结果图。
25.图8为本发明实施例提供的dt3的gpc分析结果图。
26.图9为本发明实施例提供的dt1、dt2和dt3的红外光谱图。
27.图10为本发明实施例提供的dt1的完全水解产物的单糖hplc结果图。
28.图11为本发明实施例提供的dt2的完全水解产物的单糖hplc结果图。
29.图12为本发明实施例提供的dt3的完全水解产物的单糖hplc结果图。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
31.本发明实施例公开了一种对酸樱桃进行发酵的方法，包括以下步骤：获得一株溶藻菌，将该溶藻菌接种于含有酸樱桃的培养基中进行培养发酵，收获并提纯发酵液以获得发酵产物，所述发酵产物包含相对于所述酸樱桃或所述酸樱桃处理物中含量产生差异化提升的活性成分，所述活性成分至少包含多酚类物质和多糖物质。
32.尽管，酸樱桃中含有大量具有药理作用的活性成分，但是在天然的酸樱桃中其含量过低，现有技术中公开了有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、酸化乙醇提取法、酶提取法、浸渍提取法、碱提取法、超临界co2萃取法、微波提取法等等，但是这些方法在提取时产率交底。例如，利用70％乙醇提取酸樱桃中黄酮类物质，其提取时间需要5天，温度控制序列70℃，而最终提取的产率仅为2.0046％。再例如，利用超临界co2萃取法提取樱桃液中总黄酮，需要控制压力为20mpa，最终提取率仅为0.9％。由此可见，这些提取的产率均过低，远远不能满足大规模生产的需求。
33.而本发明实施例公开的利用溶藻菌对酸樱桃进行发酵的方法，能够促使酸樱桃中的活性成分发生差异化变化，这些活性成分包含多酚类物质和多糖物质，这些物质参与了溶藻菌的生长和代谢过程，实现了从酸樱桃中得到过低含量进行溶出、转变和积累，最终富集在发酵产物中。因而，仅需对发酵产物中的多酚类物质和多糖物质进行简单地提取和收集，即可完成大规模地富集这些活性成分的工作，收获的产率大大提升，并且还能实现这些活性成分的有效药用。
34.一种实施方式中，该溶藻菌为节杆菌。当利用节杆菌进行发酵时，培养基包含0.5wt％酸樱桃处理物、0.15wt％的蛋白胨、0.1wt％淀粉、0.04wt％(nh4)2hpo4、0.01wt％kcl和0.05wt％mgso4·
7h2o，所述培养基ph值调整为7.0～7.2，对节杆菌的培养温度为30
±
0.5℃，如此能够实现对酸樱桃处理物中活性成分的差异化提升的作用。
35.一种实施方式中，该溶藻菌为不动杆菌。当利用不动杆菌进行发酵时，培养基包括0.5wt％酸樱桃处理物、0.15wt％的蛋白胨、0.025wt％k2hpo4、0.015wt％(nh4)2so4、0.01wt％kcl和0.05wt％mgso4·
7h2o，所述培养基ph值调整为7.0～7.2，对不动杆菌的培养温度为35
±
0.5℃。
36.在本发明实施例中，多酚类物质包括绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸、矢车菊-3-o-葡萄糖苷、矢车菊-3-芸香糖苷、矢车菊-3-槐糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-芸香糖苷中的至少一种；多糖物质质包括胁迫防御蛋白、能量蛋白、代谢蛋白、成熟衰老蛋白、解毒蛋白和细胞命运蛋白中的至少一种。也即，利用溶藻菌进行发酵后，这些多酚类物质和/或者多糖物质的含量增加，也具体可以为上述列举的其中一种成分或者多个成分的含量提升。
37.为具体说明本发明实施例公开的方法，下方将结合实施例具体进行说明的。
38.实施例1、节杆菌发酵
39.1、材料
40.菌种：arthxobacter sp.(美国atcc，保藏编号atcc 21749)，铜绿微囊藻(micrncystis aeruginosa)来源于中国科学院水生物研究所。
41.arthxobacter sp.平板培养基：牛肉膏培养基，琼脂含量1.5wt％；
42.arthxobacter sp.液体培养基：0.5wt％酸樱桃处理物、0.15wt％蛋白胨、0.04wt％(nh4)2hpo4、0.01wt％kcl和0.05wt％mgso4·
7h2o，调节ph值调整为7.0；其中，酸樱桃处理物为樱桃去核后烘干樱桃果肉，称取果肉，将其捣碎成流动膏状物，将该膏状物作为液体培养基的成分。
43.蓝藻固体培养基：2.02g kno3，0.25g mgso4·
7h2o、0.34g k2hpo4、0.29g kcl、0.5mg cacl2、0.34g nacl、4mg feso4·
7h2o、2.86mg h3bo3、1.81mg mncl2·
4h2o、0.222mg znso4·
7h2o、7.4mg cuso4·
5h2o、1.5mg mno3，1.5g琼脂，溶于1l水，高压灭菌后冷却形成。
44.2、菌种活化和制种
45.将arthxobacter sp.接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，培养至平板上呈现黄色圆形菌落，中心凸起即可，即实现活化。再将活化种子转接至含有500ml液体培养基的摇瓶中培养1天后，即可得到发酵种子。
46.对于该节杆菌的活化和制种过程中，可通过固体溶藻试验进行验证对该菌的活化和制种效果。固体溶藻试验：先取2ml藻液(铜绿微囊藻)用蓝藻固体培养基培养，当藻生长均匀呈淡绿时，按不同的浓度梯度(104～10
10
ml)在藻平板表而上接种溶藻细菌。藻平板上出现明显的溶藻斑，即可表明菌种活化或制种成功。
47.3、发酵
48.将具有溶藻性能的该节杆菌的种子液转接至更容量的培养罐中，接种量为5～8wt％，培养温度为30
±
0.5℃，发酵44～56h，即可收集发酵液。
49.4、发酵产物
50.去发酵液，加入3％过氧化氢对溶藻菌进行灭活，离心去上清，加入70％的乙醇，再次离心，收集上清液，浓缩，干燥，即可得到包含活性成分的发酵产物。
51.实施例2、不动杆菌发酵
52.1、材料
53.菌种：acinetobacter ssal-8(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.6196)，水华鱼腥藻(anabaena flos-aquae)来源于中国科学院水生物研究所，采用水生111号无氮培养基培养。
54.acinetobacter ssal-8平板培养基使用lb固体培养基。
55.acinetobacter ssal-8液体培养基，0.5wt％酸樱桃处理物、0.15wt％的蛋白胨、0.025wt％k2hpo4、0.015wt％(nh4)2so4、0.01wt％kcl和0.05wt％mgso4·
7h2o，ph值调整为7.0；其中，酸樱桃处理物为樱桃去核后烘干樱桃果肉，称取果肉，将其捣碎成流动膏状物，将该膏状物作为液体培养基的成分。
56.水华鱼腥藻固体培养基：0.075g k2hpo4、0.125g mgso4·
7h2o、0.1g caco3)、0.5ml柠檬酸铁(1％水溶液)、0.5ml柠檬酸((1％水溶液)、1ml钼酸((1％水溶液)，1.5g琼脂，溶于1l水，高压灭菌后冷却形成。
57.2、菌种活化和制种
58.将acinetobacter ssal-8接种于lb固体培养基上，培养至平板上呈现乳白色圆形菌落，即实现活化。再将活化种子转接至含有500ml液体培养基的摇瓶中培养1天后，即可得到发酵种子。
59.对于该不动杆菌的活化和制种过程中，可通过固体溶藻试验进行验证对该菌的活化和制种效果。固体溶藻试验：先取2ml藻液(水华鱼腥藻藻)用水华鱼腥藻固体培养基培养，当藻生长均匀呈深绿时，按不同的浓度梯度(104～1010ml)在藻平板表而上接种溶藻细菌。藻平板上出现明显的溶藻斑，即可表明菌种活化或制种成功。
60.3、发酵
61.将具有溶藻性能的该不动杆菌的种子液转接至更容量的培养罐中，接种量为5～8wt％，培养温度为35
±
0.5℃，发酵20～30h，即可收集发酵液。
62.4、发酵产物
63.去发酵液，加入3％过氧化氢对溶藻菌进行灭活，离心去上清，加入70％的乙醇，再次离心，收集上清液，浓缩，干燥，即可得到包含活性成分的发酵产物。
64.对比例1、保加利亚乳杆菌发酵
65.1、材料
66.菌种：lactobacillus bulgaricus(中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cgmcc12717)
67.lactobacillus bulgaricus平板培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基
68.lactobacillus bulgaricus液体培养基：0.5wt％酸樱桃处理物、0.3wt％牛肉膏、0.5wt％蛋白胨、氯化钠0.5wt％，ph值为7.2。
69.2、菌种活化、制种及发酵
70.将lactobacillus bulgaricus接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，培养至形成乳白色菌落，转接于500ml液体培养基的摇瓶中发酵6～10h即可得到发酵种子，将发酵种子转接于大量的液体培养基中充分发酵，接种比例为6wt％，培养温度为35
±
0.5℃，发酵20～30h，即可收集发酵液。
71.3、发酵产物
72.去发酵液，加入3％过氧化氢对溶藻菌进行灭活，离心去上清，加入70％的乙醇，再次离心，收集上清液，浓缩，干燥，即可得到包含活性成分的发酵产物。
73.对比例2、有机溶剂提取酸樱桃
74.酸樱桃去核后烘干樱桃果肉，称取果肉50.00g，捣碎成膏状物加入至体积分数为70％的乙醇溶液，料液比为1:15(g/ml)中浸泡提取，提取温度为60℃，提取时间为3h，重复
提取2次，每一次最后10min进行超声，将3次的提取液合并、旋转蒸发，最后烘干，得到樱桃果肉的乙醇提取物。
75.对比例3、酸樱桃果实
76.将酸樱桃果实，去核，充分捣碎，过滤后，留样，作为测量其中活性成分的初始提取物。本发明实施例使用的酸樱桃品种为montmorency。
77.上述实施例1、实施例2、对比例1、对比例2和对比例3分别对樱桃果实进行了多酚类物质和多糖物质的提升，为各自提升的效果进行表征，需要对其中具体的多酚类物质和多糖物质进行测量，下方将结合具体的测量方法进行说明。
78.多酚类物质的含量测定
79.多酚类物质中的酚酸类物质，具体是指绿原酸(简称为5-cqa)、隐绿原酸(简称为4-cqa)、新绿原酸(简称为3-cqa)、异绿原酸(简称为3.5-dicqa)为酚酸结构类物质，多酚类物质中的花色苷类物质，具体是指矢车菊-3-o-葡萄糖苷(简称为cyglu)、矢车菊-3-芸香糖苷(简称为cyrut)、矢车菊-3-槐糖苷(简称为cysoph)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(简称为pelglu)和芍药素-3-芸香糖苷(简称为pnrut)。
80.对于这几种物质含量的测定采用超高效液质联用方法以下方法进行。
81.1、方法：
82.(1)色谱条件：色谱柱：acquity uplc beh c18柱(2.0
×
100mm，1.7μm)，保护柱：acquity uplc beh c18保护柱(2.1
×
5mm，1.7μm)；柱温：25℃，以峰面积外标法定量。流动相a为甲醇，流动相b为0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～20min，a为5％～15％；20～25min，a为15％～10％、25～30min，a为10％～5％。流速：0.25ml/min；进样量：10μl。
83.(2)质谱条件:质谱采用电喷雾离子源(esi-)负离子模式离子扫描范围：50～1000m/z；干燥气(nz)温度：350℃；离子源温度：100℃；esi电离电压-3.20kv；脱溶剂气(n2)流速：540l/h；锥孔气(n2)流速：50l/h。
84.购买市售5-cqa、4-cqa、3-cqa、3.5-dicqa、cyglu、cyrut、cysoph、pelglu和pnrut分别作为各自含量测定的标准品(默克sigma-aldrich)，分别称取此四种酚酸10.0mg，用甲醇溶解并转移至10ml容量瓶中，用甲醇定容、封口，作为标准贮备液，在-18℃保存备用。根据实验需要将此标准贮备液用甲醇稀释至适宜含量，配制标准工作液和混合标准工作液。表1为这些上述这些标准名对应在上述条件下的hplc-esi-ms/ms鉴定结果图。
85.表1hplc-esi-ms/ms鉴定
[0086][0087]
(3)数据分析：采用spss17.0统计分析软件对上述色谱分析结果进行相关数据统计，并进行显著性差异分析。
[0088]
2、结果
[0089]
表2(mg/kg，n＝5)
[0090]
活性成分实施例1实施例2对比例1对比例2对比例35-cqa635.6
±
52.3a725.1
±
44.2a159.2
±
15.1c135.2
±
12.8c59.3
±
5.6d4-cqa1562.3
±
33.6a1263.4
±
29.1a151.1
±
12.4d635.6
±
52.3c88.5
±
4.3e3-cqa212.56
±
14.3b825.6
±
42.1a70.3
±
5.3c64.7
±
9.4d65.4
±
3.4d3.5-dicqa2315.1
±
32.4a1852.6
±
16.2a123.2
±
15.3b103
±
4.6b96.2
±
2.1bcyglu8215.3
±
163.2a6254.2
±
213.5a482.0
±
49.6b196.6
±
24.3c153.6
±
14.7ccyrut6935.6
±
293.5a9125.4
±
143.6a545.7
±
64.2b473.5
±
34.2b436.5
±
36.5bcysoph5412.6
±
126.1a1964.3
±
153.4b227.2
±
26.9cd263.6
±
18.5c213.3
±
26.1cpelglu935.4
±
64.3a428.4
±
163.2a0.152
±
0.04bndndpnrut1836.3
±
29.5a2315.4
±
23.7a18.3
±
2.8c31.6
±
2.4b26.2
±
12.3bc
[0091]
如图1-5依次为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2和对比例3对应的hplc-esi-ms/ms的结果图，由图可知不同实施例和对比例的样品在色谱图中，各活性成分均能够实现单独分离，能够清晰检测各活性成分的含量比例，在不同的实施例和对比例之间存在差别。
[0092]
具体的，如表2所示，将每一种活性成分在不同实施例和对比例之间进行显著性差异分析并进行标记，表1中“nd”表示未检出。表2中，实施例1和实施例2的活性成分均显著高于对比例1-3，这表明，通过本发明实施例提供对酸樱桃进行发酵的方法，能够显著提升酸樱桃中这类多酚物质的含量，促使其进行差异化积累，十分有利于大规模生产这些具有独特生理功能的活性成分。
[0093]
具体的，对于5-cqa和4-cqa，实施例1和2相对于对比例3均显著提升；对比例2为常规有机溶剂法提取，虽然其含量有所提升，但是仍然显著低于实施例1和2；对比例1虽然利用了保加利亚乳杆菌进行发酵，其发酵产物中5-cqa和4-cqa虽然显著高于对比例3(基本酸樱桃初始状态)，但是仍然限制低于实施例1和实施例2得，这表明本发明实施例提供的节杆菌发酵和不动杆菌发酵能够极显著地提升这两种酚酸的含量，这可能与这两种细菌发酵利用酸樱桃中相关活性成分进入其代谢途径而实现这些酚酸的积累有关。对于3-cqa，实施例1和实施例2表现出相同的趋势，仅仅在于实施例1对于3-cqa的提升不及实施例1显著。
[0094]
多糖类物质含量的测定
[0095]
由于酸樱桃中存在大量的多糖类物质，但是具有抗氧化、降尿酸等发挥生理功能的活性糖分含量降低，因此，需要对上述实施例和对比例发酵的产物进行分级、纯化和鉴定，以获得所需的具有活性的成分。
[0096]
一、测定方法
[0097]
1、离子交换层析分级
[0098]
将不同实施例1-2及对比例1-3分别得到的干燥物溶于1ml ddh2o(若有不溶物，进行过滤处理)，上样于deaf-sepharose fast flow层析柱(1.25
×
85cm)，依次用ddh2o，0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mol/l nacl洗脱(每个梯度洗3个柱体积)，流速为0.5ml/min，收集8ml/管。用苯酚硫酸法检测每管的糖含量，酶标仪280nm检测蛋白质含量。合并主要的含糖管，45℃减压旋转蒸馏浓缩，加入透析袋中(2.2kda)ddh2o透析48h，真空冷冻干燥，保存于-20℃备用。
[0099]
2、分子筛层析分级
[0100]
将离子交换纯化得到的各组分用0.2mol/l nacl溶液配成10mg/ml，上样于hiprep 26160sephacryl 5200hr层析柱，用0.2mol/l nacl洗脱，流速为1ml/min，收集5ml/管。用苯酚硫酸法检测每管的糖含量，酶标仪280nm检测蛋白质含量。收集主要的含糖管，45℃减压旋转浓缩，加入透析袋中((5.6kda)ddh2o透析48h，真空冷冻干燥，保存于-20℃备用。
[0101]
3、总糖、总酚、蛋白含量测定
[0102]
采用苯酚硫酸法测定各实施例和对比例的糖含量，糖含量测定方法：将5％苯酚溶液与98％浓硫酸按照1:5(v/v)混合，置于冰水浴中冷却；取60μl用ddh2o稀释至合适浓度的样品或标准品溶液，与180μl上述苯酚硫酸溶液混合，100℃保温30min后用synergy h1酶标仪(biotek，美国)测定490nm处的吸光值。以10、20、30、40、50、60、70和80μg/ml葡萄糖溶液做标准曲线。样品中糖含量以μg葡萄糖/g表示。每个样品测定设置3个重复。
[0103]
按照bradford蛋白浓度测定试剂盒(sigma-aldrich公司)的说明测定各组分总蛋白含量。
[0104]
按照上方的检测多酚类含量的方法对经过离子交换层析及分子筛层析的样品中含量进行测量。
[0105]
4、紫外-可见光谱扫描
[0106]
将离子交换层析及分子筛层析中收集到的含糖分高的组分溶于ddh2o配成1mg/ml溶液，加入石英比色皿中，用分光光度计进行200～800nm全波长扫描，以ddh2o进行基线校准，记录扫描谱图。
[0107]
5、红外光谱(ir)分析
[0108]
将离子交换层析及分子筛层析中收集到的含糖分高的组分进行冻干处理，得到干燥的多糖样品，以kbr压片，在4000～400-1
cm，的范围内进行红外光谱扫描，记录红外光谱图。
[0109]
6、分子量测定
[0110]
将多糖样品用ddh2o配成10mg/ml溶液，用凝胶渗透色谱(gpc)测定分子量。waters 515凝胶色谱仪，2410示差折光检测器(waters，美国)；biosepg4000swxl色谱柱(tosoh，日本)；洗脱液为0.1molll硝酸钠溶液；进样量60μl；柱温40℃。以平均分子量76900da,
43500da,21400da和10500da的葡聚糖作为标样。标准曲线方程：log mol wt＝10.63e-4.06e-1
t，r2＝0.996。
[0111]
7、单糖组成分析
[0112]
采用柱前衍生高效液相色谱方法(pmp-hplc法)分析单糖组成。
[0113]
多糖的完全水解：准确称取1mg多糖样品，加入1ml 28％盐酸甲醇，80℃水解16h，,30℃离心旋转蒸发去除溶剂，残渣用1ml 2mol/l三氟乙酸(tfa)溶液溶解，120℃密闭水解反应2h，水解产物30℃旋转蒸干后，再反复用甲醇溶解、蒸干，以除去多余的tfa。将蒸干后样品溶于100μl水中制成10mg/ml样品溶液用于衍生化分析。每个样品设3个重复。
[0114]
衍生化：取样品及标准品溶液各100μl，加入0.5mol/lpmp(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)溶液120μl，0.3mol/l的naoh溶液100μl，70℃水浴反应1h，冷却至室温后加入100μl，浓度为0.3mol/l的hcl溶液中和，二氯甲烷萃取，10000rpm离心5min，取上层水相，即得衍生样品及标准品，用于hplc分析。
[0115]
hplc条件：water 2695-2996液相色谱系统(waters，美国)；sunfire c18色谱柱(waters，美国)；柱温25℃；流动相为naoh-kh2po4缓冲液(ph6.7)(a相)和乙睛(b相)；洗脱程序：0～30min、15％b；30～60min,15～32％b；60～65min,32～20％b；上样量10μl；流速1ml/min；检测波长245nm。各标准品的保留时间如表3所示，色谱图如10-12所示。
[0116]
表3
[0117][0118][0119]
8、统计学分析
[0120]
数据的统计学分析采用spss 20.0软件进行。实验数据以平均值
±
标准差表示。组间数据的多重比较采用turkey显著性检验方法进行分析。对节杆菌的培养温度为25
±
0.5℃。
[0121]
二、检测结果
[0122]
1、层析分级
[0123]
离子交换层析分级表明，水溶性多糖中含有少量中性糖(水洗脱组分)，绝大部分为酸性多糖，大部分酸性多糖集中于0.2mo1/l nacl溶液和0.3mol/lnacl溶液洗脱的部分。合并此两个组分进一步进行分子筛层析分级，得到三个组分(分别命名为dt1、dt2和dt3)，此三个组分的gpc分析结果依次如图6、7和8所示，相对分子量分别为86kda、125kda和
180kda。另外，进一步用超高效液质联用方法未检测出酚类物质，进而表明通过上述的离子交换层析和分子筛层析得到的样品中不含有上述多酚类物质或含有极低量的多酚类物质。
[0124]
2、dt1、dt2和dt3的结构特征鉴定
[0125]
如图9所示，dt1、dt2和dt3具有相似的红外光谱图，从中可以找出o-h伸缩振动(3397cm-1
)，c-h伸缩振动(2923cm-1
)，c-h变角振动(1411cm-1
)，酯羧基c＝o伸缩振动(1740cm-1
)、非醋c＝o伸缩振动(1614cm-1
)，c-o伸缩振动(1238cm-1
)等位移，832cm-1
峰表明α-糖苷键的存在(图9)。
[0126]
dt1、dt2和dt3完全水解产物的hplc结果如图10、11和12所示。其中，dt1由半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖和果糖组成，dt2和dt3均有由半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、夫糖、甘露糖和果糖组成。
[0127]
将dt1、dt2和dt3完全水解的单糖含量(摩尔比例，也就单个多糖分子中含有各种单糖的摩尔百分比例)列入表4，可见dt1结构中不包含甘露糖、半乳糖和夫糖结构，dt2结构中不包含鼠李糖结构，dt3结构中不包含鼠李糖结构，三种多糖结构中含有大量的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸结构。
[0128]
表4(％)
[0129]
单糖组成dt1dt2dt3甘露糖－0.890.76鼠李糖5.94－－葡萄糖醛酸39.5536.2138.05半乳糖醛酸29.8228.8326.96葡萄糖1.783.2112.25半乳糖－5.114.23阿拉伯糖7.59.636.08夫糖－2.063.85果糖15.4114.067.82
[0130]
3、不同实施例和对比例2多糖类物质含量
[0131]
表5(μg glu/g，n＝5)
[0132]
实施例dt1dt2dt3实施例1156.32
±
12.03a58.65
±
8.06a69.53
±
8.25a实施例2236.18
±
48.56a74.79
±
5.73a72.48
±
3.64a对比例126.11
±
0.85b16.85
±
0.77b8.49
±
1.03b对比例2nd0.15
±
0.06c1.23
±
0.82c对比例3ndndnd
[0133]
表5中，“nd”表示未检测出该成分。由表5可知，实施例1和实施例2所得的发酵产物均含有dt1、dt2和dt3，三者的检测含量均分别显著高于对比例1、2和3，并且，对比例2中未检测到dt1，对比例3中三种多糖均未检测到。
[0134]
动物实验
[0135]
一、材料与方法
[0136]
1.1、材料
[0137]
试验品：实施例1、实施例2、对比例1、对比例2和对比例3分别得到包含有活性成分的发酵产物；并且另外再设置两个实施例，实施例3为实施例1发酵产物进行上述的离子交换层析和分子筛选得到的样品，其中未检测出多酚类物质；实施例3为实施例2发酵产物进行上述的离子交换层析和分子筛选得到的样品，其中未检测出多酚类物质。
[0138]
实验动物：采用三周龄的雄性昆明小鼠，体重15-22g，卫生级别为spf级，由河北省实验动物中心提供。
[0139]
实验试剂：
[0140]
氧嗓酸钾购自sigma公司，次黄嚓吟购于索莱宝生物公司，别嘌呤醇片(all)购自世贸天阶制药有限公司)，生理盐水，梭甲基纤维素钠购自sigma公司，尿酸(ua)测定试剂盒购自国药集团化学试剂有限公司，黄嚓吟氧化酶(xo)活性测定试剂盒，肌酐(cr)测定试剂盒、尿酸氮(bun)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
[0141]
磷酸缓冲液(ph7.4)的配制：0.478g磷酸二氢钾，3.343g三水合磷酸氢二钾，9.31mg edta-2na溶于250ml超纯水。
[0142]
500mg/kg次黄嚓吟注射溶液的配制：称取一定样品溶于生理盐水，至最终浓度。
[0143]
100mg/kg氧嗓酸钾溶液的配制：称取一定样品溶于少量0.5％梭甲基纤维素钠，超声后，以生理盐水调至最终浓度。
[0144]
1.2、构建小鼠高尿酸血症模型
[0145]
取昆明种小鼠最初5d喂养基础饲料，使小鼠适应实验室环境，实验开始前称量并记录体重，给小鼠随机分组，每组15只，分别为：
[0146]
空白对照组：0.9％生理盐水，灌胃；
[0147]
模型组：氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0148]
阳性对照组：别嘌呤醇45mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0149]
给药组分为实施例1组、实施例2组、对比例1组、对比例2组和对比例3组。
[0150]
实施例1组：实施例1制备的发酵产物62.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0151]
实施例2组：实施例2制备的发酵产物62.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0152]
实施例3组：实施例3制备的发酵产物62.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0153]
实施例4组：实施例4制备的发酵产物62.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0154]
对比例1组：对比例1制备的发酵产物125.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0155]
对比例2组：对比例2制备的乙醇提取物125.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·
d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0156]
对比例3组：对比例2制备的初始样品185.5mg/kg
·
d灌胃 氧嗓酸钾300mg/kg
·d腹腔注射 次黄嚓吟250mg/kg
·
d灌胃 乙胺丁醇250mg/kg
·
d灌胃；
[0157]
按照以上剂量及给药方式，实验持续15d，期间每隔5天记录一次小鼠体重变化。
[0158]
1.3、小鼠样本的收集
[0159]
第16天，眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖内脏，称取肝肾脾重量，收集样品并记录备用。将收集的血液置于ep管中，静止30min，以3500rpm/min转速，4℃离心10min，取上清淡黄色澄清液即血清，-20℃冻存，供小鼠血液生化指标检测使用。
[0160]
眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖内脏，于冰浴上将肝脏迅速取出，以生理盐水冲洗，滤纸吸水，称取肝肾脾重量，收集样品并记录备用，冻于-20℃。
[0161]
1.4、血清ua、xo、bun和cr的测定
[0162]
均严格依照ua、xo、bun和cr对应的试剂盒操作。
[0163]
1.5、数据处理
[0164]
实验数据以均数
±
标准差表示，组间比较，统计方法采用单因素方差分析(one way anova)；组间比较，统计方法采用t检验。p《0.05认为有显著性差异，p《0.01认为有极显著性差异，结果用spss17.0统计软件分析。
[0165]
二、结果
[0166]
通过上述动物实验处理，将各组对小鼠高尿酸血症模型的尿酸、尿酸氮、肌酐以及黄嚓吟氧化酶活性水平的影响结果列入表6中，并对各种列进行显著性标记。
[0167]
由表6可知，与空白对照组相比，模型组的小鼠血清中尿酸水平显著增加，模型组的小鼠血清中黄嚓吟氧化酶活性显著增加，模型组的小鼠肝脏中黄嚓吟氧化酶活性显著增加，模型组的小鼠血清中肌酐水平并未显著增加，模型组的小鼠血清中尿酸氮并未显著增加。这表明，通过上述造模方法，小鼠高尿酸血症模型建立成功，并且对小鼠的肾脏损伤较小。
[0168]
由表6可知，与空白对照组相比，阳性对照组的小鼠血清中尿酸水平显著降低，阳性对照组的小鼠血清中黄嚓吟氧化酶活性并未显著增加，阳性对照组的小鼠肝脏中黄嚓吟氧化酶活性显著增加，阳性对照组的小鼠血清中尿酸氮显著增加，阳性对照组的小鼠血清中肌酐水平显著增加。这表明，阳性对照组的给药产品，虽然能够降低小鼠血清中尿酸水平，但是对于小鼠的肾脏产生了损伤。
[0169]
由表6可知，与空白对照组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组和实施例4组对应的小鼠血清中尿酸水平均显著降低，而对比例1组、对比例2组和对比例3组对应的小鼠血清中尿酸水平则显著升高。这表明本发明实施例提供的发酵产物具有显著降低小鼠血清中尿酸水平的作用。与模型组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组和实施例4组对应的小鼠血清中xo活性均显著降低至于空白对照组相当的水平，表明二者能够恢复或者抑制小鼠血清中xo活性，避免对于小鼠的损伤，通过对小鼠肝脏中xo活性的检测表明处相同的趋势，这表明本发明实施例1和实施例2制备的发酵产物不仅能够降低小鼠血清中尿酸水平，还能避免对小鼠肝脏产生损伤。同样地，对小鼠血清中bun和cr含量的检测发现，实施例1组和实施例2组表现出相同的趋势。
[0170]
另外，由表6可知，实施例3组和实施例4组分别相对于实施例1组和实施例2组减少了其中多酚类物质，仅仅包含有多糖类物质，其不仅相对于空白组，显著降低了小鼠血清中
尿酸水平，而且还对于小鼠血清中xo活性、bun和cr水平均未显著提升，这表明实施例3组和实施例4组提供的产品能显著减低小鼠血清尿酸水平的同时还能减少对小鼠肝脏和肾脏的损伤。也即，本发明实施例3和4即使仅仅包含多糖类物质，其亦能发挥降低小鼠血清尿酸水平的作用，这也表明在本发明实施例提供的发酵产物中发挥降低尿酸水平的活性成为不仅仅为多酚类物质，也有多糖类物质的作用。
[0171]
这些结果表明，本发明实施例制备的发酵产物不仅能够降低小鼠血清中尿酸水平，还能避免对小鼠肝脏产生损伤，降低对于小鼠肾脏的损伤，这都与本发明实施例制备的发酵产物中活性成分有关。根据表2和表5的结果表明，实施例1、实施例2、实施例3和实施例4相对于对比例1-3中的多酚类活性成分，以及多糖类成分的含量差别显著，进而决定了它们作为将尿酸产品产生了不同的效果，具体而言是实施例1和实施例2相对于对比例1-3显著提升了这些多酚类物质及多糖糖类物质的含量，从而使得其作为产品不仅能显著降低小鼠血清中尿酸水平，与阳性产品别嘌呤醇的降尿酸效果相当，降尿酸作用显著优于对比例1-3；但是其并未对小鼠的肝脏和肾脏产生损伤，副作用小，这一点亦显著优于阳性产品以及对比例1-3。
[0172]
表6，n=5
[0173][0174][0175]
综上所述，本发明实施例实际上利用溶藻菌对酸樱桃进行发酵，通过溶藻菌的代谢促使酸樱桃中具有药理作用的活性成分得以提升，这些活性成分包含多酚类物质和多糖物质，这些物质参与了溶藻菌的生长和代谢过程，实现了从酸樱桃中得到过低含量进行溶出、转变和积累，最终富集在发酵产物中，仅需对发酵产物中的多酚类物质和多糖物质进行简单地提取和收集，即可完成大规模地富集这些活性成分的工作，收获的产率大大提升，并
且还能实现这些活性成分的有效药用。
[0176]
另外，本发明实施例通过实验检测了这些多酚类物质包含绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸、矢车菊-3-o-葡萄糖苷、矢车菊-3-芸香糖苷、矢车菊-3-槐糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-芸香糖苷；多糖类物质包含dt1、dt2和dt3，通过对此三种多糖物质的分析发现dt1由半乳糖醛酸(gala)、葡萄糖醛酸(glua)、阿拉伯糖(ara)、葡萄糖(glu)、鼠李糖(rha)和果糖(fru)组成，dt2和dt3均有由半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖(gal)、葡萄糖、夫糖(fuc)、甘露糖(man)和果糖组成。由此，本发明实施例还提供的一种利用上述发酵的方法制备的组合物，该组合物包含这些多酚类物质和多糖类物质，而这些多酚类物质和多糖类物质通过动物实验验证了其具有降低小鼠血清中尿酸含量的作用，并且对于小鼠的肝脏和肾脏的毒副作用小。
[0177]
而高尿酸血症是痛风发作的中心危险因素，并且大多数能引起痛风的危险因素也是尿酸盐浓度升高的危险引物，参与尿酸生成的代谢反应是次黄嚓吟或黄嚓吟在黄嚓吟氧化酶作用下生成尿酸。影响尿酸生成水平的主要因素可以分为嚓吟底物的量以及黄嚓吟氧化酶活性的变化。而基于此思路的黄嚓吟氧化酶抑制剂-别嘌呤吟醇和非布索坦是目前临床上主要产品。别嚓醇降尿酸效果良好，但副作用严重限制了其应用。非布索坦降尿酸效果优于别嘌呤醇，副作用小于别嘌呤醇，但价格昂贵。
[0178]
而本发明实施例通过对酸樱桃发酵，促使其中多酚类物质和多糖类物质含量进行显著提升，并通过动物实验验证了这些活性成分的药效作用，不仅能够达到别嘌呤醇的药效作用，还相对于别嘌呤醇具有极小的副作用，具有发展成为替代别嘌呤醇作为降尿酸和/痛风的新型产品，而且这些制备方式为生物合成法，环境友好，成本低廉，具有大规模发展的应用前景。
[0179]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。