一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺。


背景技术：

2.人源胶原蛋白：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。重组人源胶原蛋白是基于人ⅲ型胶原蛋白α1链胶原gly-x-y(甘氨酸-x-y)的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，通过一系列体外酶切连接，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，转入巴氏毕赤酵母菌，通过高密度发酵和分离、纯化而得，该人源胶原蛋白具有去除皮肤褶皱的功效，包括面部皱纹、眼周皱纹、额头纹、颈纹、手部皱纹、妊娠纹。
3.普鲁多糖：普鲁兰多糖是一种非还原性的高分子物质。其具有无毒性、安全性、溶解性、稳定性、润滑性、粘合性、凝固性、覆膜性、分解性、改善物性等性质广泛应用于食品、医药、轻工、化工和石油等领域。由于普鲁兰多糖有良好的无毒害作用、水溶性、分散性、吸湿性，可以以粘性添加物用于化妆品；在价格方面远远低于透明质酸，但其效果却与透明质酸相差无几。两亲性接枝或嵌段聚合物由于在水溶液中能自组装形成纳米粒或是纳米束，将生物相容性好，可降解以及低毒的普鲁兰多糖与胶原蛋白进行接枝共混进行交联反应。
4.冻干技术：真空冷冻干燥技术是通过在较低的温度下使样品中的水分由冰直接升华，达到干燥的目的，在干燥的过程中不受表面张力的作用，样品不变形，最终使物料脱水。由于真空冷冻干燥技术在低温、低压环境下进行，大多数生物反应停滞，且处理过程无液态水存在，水分以固体状态直接升华，使物料原有结构和形状得到最大程度保护，最终获得外观和内在品质兼备的优质干燥制品，而且由于生物反应停滞，冻干产品中的活性物质(胶原蛋白)能充分的保留活性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺。该冻干粉的主要成分为人源胶原蛋白与普鲁兰多糖的交联产物。交联产物通过低温冻干进行预冻、一次升华、解析干燥三步，获得的冻干粉可保持人源胶原蛋白的活性与稳定性，产品具有外观美观、无刺激性气味、保存期长久，对治疗皮肤褶皱有极好的效果。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：作为优选，冻干粉的组成为：1g冻干粉按重量份包括：10~12份人源胶原蛋白、71~75份普鲁兰多糖、1~2份高碘酸钠、3~4份甘露糖醇、2~3份烟酰胺。
7.作为优选，所述的人源胶原蛋白量为0.25g/100ml蛋白质混合溶液。
8.作为优选，所述的普鲁兰多糖为：不同分子量的普鲁兰多糖混合物，其质量比例为： 100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：2：1。
9.作为优选，所使用的高碘酸钠水溶液浓度为0.5mol/l。
10.作为优选，所使用的甘露糖醇量为1.1g/100ml蛋白质混合溶液。
11.作为优选，所使用的烟酰胺量为0.5g/100ml蛋白质混合溶液。
12.作为优选，所使用预冻时间、温度、压力为:第一阶段导热油温度在5分钟达到-15℃，保持2小时；第二阶段导热油温度在30分钟达到-50℃，保持4小时，保持常压。
13.作为优选，所使用升华时间、温度、压力为：第一阶段导热油温度在0.5小时达到-40℃，真空度极限真空，保持10小时；第二阶段导热油温度在0.5小时达到-20℃，真空度30帕，保持10小时；第三阶段导热油温度在0.5小时达到-5℃，真空度40帕，保持10小时； 第四阶段导热油温度在0.5小时达到3℃，真空度50帕，保持3小时。
14.作为优选，所使用干燥时间、温度、压力为：第一阶段导热油温度在0.5小时达到15℃，真空度50帕，保持4小时；第二阶段导热油温度在0.5小时达到20℃，真空度40帕，保持3小时。
15.综上所述，本发明具有以下有益效果：1、通过人源胶原蛋白与普鲁多糖的交联作用，可以保持人源胶原蛋白的活性以及稳定性，并且通过添加剂（甘露糖醇、烟酰胺）改善产品外观。其反应原理为人源胶原蛋白和普鲁兰多糖交联聚合后再加入高碘酸钠进行进一步的交联反应，首先，人源胶原蛋白的氨基与氧化后的羰基发生希夫碱反应，生成一个新的酰胺键；其次，在高碘酸钠交联后，普鲁兰多糖上的羟基没有来得及发生氧化时，与人源胶原蛋白羧基端发生连接，形成酯键；这个反应过程共有２步；人源胶原蛋白在高碘酸钠交联后，通过接枝共混，普鲁兰多糖的分子链上增加了两条人源胶原蛋白，这一特性增加了交联分子体系的分子链、改变了交联后的空间链段结构、增加了人源胶原蛋白交联体系的抗降解性能，从而影响了人源胶原蛋白交联体系的物理化学性能和生物学相容性。若先将高碘酸钠与普鲁兰多糖混合，会导致普鲁兰多糖的两个相邻的羟基在高碘酸钠氧化过程中，都被氧化生成醛基，无法再与人源胶原蛋白发生交联反应，导致人源胶原蛋白的交联效果明显下降，虽然高分子量的普鲁兰多糖能更好的与人源胶原蛋白进行交联反应，有助于提高人源胶原蛋白的结合率，但是其形成的紧密性，使其交联物中的水结合力更强，导致在随后的冻干反应中让水更难失去，形成不规则块状结构，难形成粉末状。为了同时满足普鲁兰多糖与人源胶原蛋白的结合率，并使其交联产物更易形成粉状结构，结晶更均匀，所以采用不同分子量的普鲁兰多糖混合物；2、真空干燥通常分为升华和干燥两部分，升华干燥主要针对物料中的自由水；解析干燥主要是去除与固体结合较强的吸附水。干燥过程中的真空度、温度直接影响着干燥的进程和产品的最终水分，而水分又影响着胶原蛋白的生物活性。本发明选择合理的预冻和升华温度以及真空度，优化冻干曲线，提高产品性状的同时，产品稳定性增强，胶原蛋白的生物活性保持在较高水平，与传统的干冷冻干燥相比，温度变化更为缓和，一方面能减少冻干粉的含水率，另一方面能得到形貌较好的粉状结构。
附图说明
16.图1是一种含有人源胶原蛋白的冻干粉制备工艺流程图。
具体实施方式
17.实施例1本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:
1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：2：1）、0.25g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
18.按上述配方制备样品，具体包括以下步骤：（1）1g普鲁兰多糖粉末 （100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：2：1）溶解于100ml、2℃去离子水中搅拌均匀，在4℃温度下放置24h使普鲁兰多糖溶液充分溶解，配置成溶液a；（2）将0.25ｇ人源胶原蛋白溶液溶解于100ml、10℃ 去离子水中配制人源胶原蛋白溶液b；（3）将1.1g的甘露糖醇与0.5g的烟酰胺加入（2）所描述的溶液b中，搅拌溶解，制得溶液c；（4）将0.1g的高碘酸钠溶解在1 ml去离子水中，配置成溶液d；（5）将溶液a与溶液c混合，搅拌20 min后，加入溶液c，继续搅拌20 min，将溶解后的溶液放于37 ℃热水浴避光反应12 h。然后将反应生成物放于透析袋（md50(8000)）中透析12 h以除去反应中残留的高碘酸钠；（6）将（5）中透析后的交联物置于冻干设备中经过预冻、升华、解析干燥，具体步骤如下；预冻:第一阶段导热油温度在5分钟达到-15℃，保持2小时；第二阶段导热油温度在30分钟达到-30℃，保持4小时；升华:第一阶段导热油温度在0.5小时达到-40℃，真空度极限真空，保持10小时；第二阶段导热油温度在0.5小时达到-20℃，真空度30帕，保持10小时；第三阶段导热油温度在0.5小时达到-5℃，真空度40帕，保持10小时；第四阶段导热油温度在0.5小时达到3℃，真空度50帕，保持3小时；解析干燥:第一阶段导热油温度在0.5小时达到15℃，真空度50帕，保持4小时；第二阶段导热油温度在0.5小时达到20℃，真空度40帕，保持3小时；冷冻干燥后的固体经过轻微挤压呈均匀粉末状。
19.实施例2本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：1：1）、0.25g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
20.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
21.实施例3本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=1：2：1）、0.25g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
22.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
23.实施例4本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:
1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=1：1：1）、0.25g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
24.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
25.实施例5本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=1：1：2）、0.25g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
26.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
27.实施例6考察实施例1-5中生产出冻干粉的形貌以及其含水率，考察不同分子量以及比例的普鲁兰多糖对冻干粉的影响。含水率测试方法：冻干粉在40摄氏度温度下加热烘干24h，称量烘干前后的粉末质量：计算公式：（烘干前质量-烘干后质量）/烘干前质量。
28.胶原蛋白检测方法为woessner法：虽然高分子量的普鲁兰多糖能更好的与人源胶原蛋白进行交联反应，但是其紧密性，不但让交联物中的水含量降低，而且在随后的冻干反应中让水更难失去，难形成粉末状。
29.实施例7本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：2：1）、0.2g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
30.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
31.实施例8本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：2：1）、0.3g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
32.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
33.实施例9本实施例提供一种含有人源胶原蛋白的冻干粉及其制备工艺，配方:1g普鲁兰多糖（100,000g/mol：170,000g/mol：530,000g/mol=2：2：1）、0.35g人源胶原蛋白溶液溶、0.1g高碘酸钠、1.1g的甘露糖醇、0.5g的烟酰胺。
34.本实施例中冻干粉的生产工艺与实施例1相同。
35.实施例10
考察实施例1与7、8、9中生产出冻干粉的形貌，以及胶原蛋白含量。
36.通过改变胶原蛋白的加入量，通过woessner法检测其胶原蛋白的含量可知，虽然加入过量的胶原蛋白会使冻干粉中的胶原蛋白含量上升，但上升趋势并不明显，多余的胶原蛋白会在透析时损失。
37.实施例11在本实施例中，冻干粉的配方与生产工艺与实施例1相同。
38.取不同冷冻干燥阶段的样品测试其含水率，考察真空冷冻干燥过程中水分的挥发情况，以上实验数据可以看出：水份主要在升华第一阶段失去。
39.对比例1在本对比例中，冻干粉的配方与生产工艺与实施例1相同。
40.冷冻干燥过程中不进行预冻。
41.对比例2在本对比例中，冻干粉的配方与生产工艺与实施例1相同。
42.升华为：第一阶段导热油温度在0.5小时达到-35℃，真空度极限真空，保持10小时；第二阶段导热油温度在0.5小时达到-20℃，真空度30帕，保持10小时；第三阶段导热油温度在0.5小时达到-5℃，真空度40帕，保持10小时；第四阶段导热油温度在0.5小时达到3℃，真空度50帕，保持3小时；对比例3在本对比例中，冻干粉的配方与生产工艺与实施例1相同。
43.升华为：第一阶段导热油温度在0.5小时达到-45℃，真空度极限真空，保持10小时；第二阶段导热油温度在0.5小时达到-20℃，真空度30帕，保持10小时；第三阶段导热油温度在0.5小时达到-5℃，真空度40帕，保持10小时；第四阶段导热油温度在0.5小时达到3℃，真空度50帕，保持3小时；对比例4在本对比例中，冻干粉的配方与生产工艺与实施例1相同。采用直接冷冻干燥升华：导热油温度在1小时达到-40℃，真空度极限真空，保持40小时。后在1小时达到25℃。
44.实施例12考察实施例1与对比例1、2、3中生产出冻干粉的形貌，以及其含水率；以上实验数据可以看出：不仅过预冻而进行直接升华的冻干粉呈现不规则块状，含水率为15%；若直接降温干燥，因为温度差的变化急速，水分失去过快，导致结块，无法形成粉状结构。
45.（1）考察冻干粉对人体毒性的测试采用mtt（商品名噻唑蓝）比色法，是一种检测细胞相对存活率的方法。选用的仪器是酶联免疫检测仪，测的波长选在490ran处，光吸收值可间接反映活细胞数量。因为外源性mtt被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶可以还原为甲瓒，可以通过甲瓒所反映的光吸收值来判断材料浸提液的毒性。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量越多，则存活的小鼠细胞数越多。首先制备浸提液和细胞悬液，在96孔板中种入细胞培养液，放入37℃的培养箱培养１天后，移去培养基，加入材料浸提液以及对照样，分别在1，3，5天后，移去加入上述的液体，加入pbs冲洗1次后，加入10ul的mtt，等2h后孔板底部出现紫色结晶，加入100ul二甲基亚砜溶解紫色的结晶，测吸光值。空白组od值调为0。实验组od1与对照组od2的值比较得到实验组的细胞相对存活率。
46.存活率=（od1
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od2）/ od1表1 冻干粉对人体毒性的测试
所用的胶原蛋白与普鲁兰多糖对小鼠细胞无危害作用。
47.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。