用于治疗癌症的方法和组合物与流程

1.本发明总体上涉及通过抑制氧化低密度脂蛋白的生物活性来治疗癌症的组合物和方法。
2.发明背景
3.肥胖被认为增加发展糖尿病和几种类型的癌症的风险。肥胖与各种有害的生理变化有关，包括例如脂肪组织功能障碍、低度和慢性炎症以及脂质代谢和循环激素水平的改变。氧化低密度脂蛋白(oxldl)是由于动脉壁中ldl的氧化修饰而形成的促炎介质。oxldl最常与动脉粥样硬化的发展相关，动脉粥样硬化可具有有害的心血管(cv)结果，包括心肌梗塞、中风和死亡。oxldl通过各种细胞清道夫受体发出信号，所述受体包括a型清道夫受体(sr-a)、分化簇36(cd36)、cd68、粘蛋白和凝集素样oxldl受体-1(lox-1)。
4.lox-1在内皮细胞上表达，但也在巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板上发现。此外，lox-1以可溶性形式分泌。几项研究表明，通过lox-1进行的oxldl信号传导在动脉粥样硬化发展和进展中起主要作用。本发明提供了使用oxldl依赖性机制治疗癌症的方法和组合物。


技术实现要素：

5.在一个方面，本发明提供了用于抑制受试者中巨噬细胞浸润至肿瘤中的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与氧化低密度脂蛋白(oxldl)结合的抗体或其片段(即，抗oxldl抗体或其片段)。
6.在另一个方面，本发明提供了用于抑制受试者中的肿瘤转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与氧化低密度脂蛋白(oxldl)结合的抗体或其片段(即，抗oxldl抗体或其片段)。
7.在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有肿瘤。
8.在一些实施方案中，所述肿瘤是lox-1阳性肿瘤。在其他实施方案中，所述肿瘤对lox-1、sr-a、cd36、cd38和粘蛋白中的一者或多者呈阳性。
9.在一些实施方案中，所述肿瘤选自由以下组成的组：卵巢癌、膀胱尿路上皮癌、肾透明细胞癌、直肠腺癌、结肠腺癌、前列腺腺癌、乳腺上皮细胞肿瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌和食道癌。
10.在一些实施方案中，所述方法降低所述肿瘤的生长速率、所述肿瘤的巨噬细胞浸润和/或所述肿瘤的转移潜力。
11.在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与氧化低密度脂蛋白(oxldl)结合的抗体或其片段。
12.在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
13.(a)治疗有效量的选自由化学疗法、放射疗法和免疫疗法组成的组的初始抗癌疗法，和
14.(b)治疗有效量的与氧化低密度脂蛋白结合的抗体或其片段(oxldl)。
15.在一些实施方案中，所述癌症是lox-1阳性的。在其他实施方案中，所述癌症对lox-1、sr-a、cd36、cd38和粘蛋白中的一者或多者呈阳性。
16.在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、膀胱尿路上皮癌、肾透明细胞癌、直肠腺癌、结肠腺癌、前列腺腺癌、乳腺上皮细胞肿瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌和食道癌。
17.在一些实施方案中，所述癌症是血液癌症，包括例如急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
18.在一些实施方案中，所述抗体或其片段作为所述初始抗癌疗法的佐剂施用。
19.在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有血清高脂血症、2型糖尿病或代谢综合征。
20.在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗oxldl抗体或其片段抑制oxldl与lox-1的结合。在其他实施方案中，所述抗体或其片段抑制oxldl与sr-a、cd36、cd38和粘蛋白中的一者或多者的结合。
21.在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体或其片段以相比于对天然(未氧化)ldl的亲和力至少10倍、50倍、100倍或1,000倍大的亲和力结合于oxldl。
22.在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体、鼠抗体或兔抗体、或它们的片段。
23.在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含与选自由seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10组成的组的lcdr基本上同一的至少一个轻链互补决定区(lcdr)。
24.在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含与选自由seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7组成的组的lcdr基本上同一的至少一个重链互补决定区(hcdr)。
25.在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含与seq id no:11基本上同一的可变重区(vh)、与seq id no:12基本上同一的可变轻区(v
l
)或两者
26.在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含与
27.evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnawmswvrqapgkglewvssisvgghrtyyadsvkgrstisrdnskntlylqmnslraedtavyycarirvgpsggafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:3)基本上同一的重链、与
28.qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsntnigknyvswyqqlpgtapklliyansnrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglrsedeadyycaswdaslngwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs(seq id no:4)基本上同一的轻链或两者。
29.所述重链可由与
30.gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgc
agcctctggattcaccttcagtaacgcctggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaagtattagtgttggtggacataggacatattatgcagattccgtgaagggccggtccaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacactgccgtgtattactgtgcacggatacgggtgggtccgtccggcggggcctttgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(seq id no:1)基本上同一的多核苷酸序列编码，并且所述轻链可由与
31.cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcctgctctggaagcaacaccaacattgggaagaactatgtatcttggtatcagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctatgctaatagcaatcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcgtcatgggatgccagcctgaatggttgggtattcggcggaggaaccaagctgacggtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca(seq id no:2)基本上同一的多核苷酸序列编码。
32.在一些实施方案中，所述抗体是奥替苏单抗(orticumab)。在其他实施方案中，所述抗体片段是奥替苏单抗的片段。
33.在一些实施方案中，所述抗体以至少5mg/kg的初始剂量静脉内施用，随后是各自至少2mg/kg/周、至少2.5mg/kg/两周或至少6mg/kg/月的多个后续剂量。在其他实施方案中，所述抗体以约330mg/月的剂量皮下施用至少三个月。
34.如本文所用的“辅助疗法”是指施用以治疗原发性疾病(即，初始疗法所针对的临床适应症)、需要治疗的继发性疾病以增加/最大化初始疗法的有效性、以减轻治疗或原发性疾病的副作用和/或以防止疾病复发的第二次疗法。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段作为佐剂施用以治疗原发性疾病(例如，癌症或肿瘤)或降低oxldl的血浆浓度。
35.如本文所用的“施用(administering)”和/或“施用(administer)”是指用于将药物组合物递送至患者的任何途径。递送途径可包括非侵入性口服(通过口)、局部(皮肤)、经
粘膜(鼻、颊/舌下、阴道、眼部和直肠)和吸入途径以及胃肠外途径，以及本领域中已知的其它方法。胃肠外是指通常与注射相关的递送途径，包括眼眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊椎内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或悬浮液形式，或作为冻干粉末。
36.如本文所用的术语“有效量”是指药物组合物用于减轻疾病或病症的至少一种或多种症状的量，并且涉及足够量的药物组合物以提供所需的作用。如本文所用的短语“治疗有效量”意指以可适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗病症的足够量的组合物。
37.症状的治疗性或预防性显著减轻是与对照或未治疗的受试者或在施用本文所述的肽之前受试者的状态相比，测量参数的例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。测量的或可测量的参数包括疾病的临床上可检测的标志物，例如生物标志物的水平升高或降低以及与动脉粥样硬化的症状或标志物的临床上接受的量表相关的参数。然而，应理解，如本文公开的组合物和制剂的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。所需的确切量将根据诸如所治疗的疾病的类型、受试者的性别、年龄和体重等因素而变化。
[0038]“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食用动物，如牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等。在某些实施方案中，哺乳动物是人受试者。
[0039]“基本上同一”是指当例如使用下文所述的方法最佳比对时与第二核酸或氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％,或100％序列同一性的核酸或氨基酸序列。“基本同一性”可用于指各种类型和长度的序列，如全长序列、表位或免疫原性肽、功能结构域、编码序列和/或调控序列、外显子、内含子、启动子和基因组序列。两个多肽或核酸序列之间的同一性百分比以本领域技术范围内的各种方式确定，例如，使用诸如以下的公开可用的计算机软件：smith waterman比对(smith,t.f.和m.s.waterman(1981)j mol biol 147:195-7)；“bestfit”(smith和waterman,advances in applied mathematics,482-489(1981))，如并入genematcher plus
tm
,schwarz和dayhof(1979)atlas of protein sequence and structure,dayhof,m.o.,ed第353-358页中；blast程序(基本局部比对搜索工具；(altschul,s.f.,w.gish,等人(1990)j mol biol 215:403-10)、blast-2、blast-p、blast-n、blast-x、wu-blast-2、align、align-2、clustal或megalign(dnastar)软件。此外，本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的长度上实现最大比对所需的任何算法。一般来说，对于蛋白质，比较序列的长度将是至少10个氨基酸，优选20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350或400个氨基酸或更多。对于核酸，比较序列的长度通常将是至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100或1200或更多。应理解，在比较dna序列与rna序列时，为了确定序列同一性，胸腺嘧啶核苷酸
等同于尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。
[0040]
附图描述
[0041]
通过参考以下附图可更好地理解本发明。附图中的组件不必按比例绘制，而将重点放在说明本公开的原理上。在图中，相同参考数字在所有不同视图中指示对应的部分。
[0042]
图1是比较奥替苏单抗与天然(未氧化)ldl和mda-ldl的结合的线图。
[0043]
图2a是示出来自用奥替苏单抗和对照抗体处理的细胞的mcp-1释放的条形图。图2b是示出随时间推移累积的mcp-1释放的条形图。
[0044]
图3是针对iκbα染色的蛋白质印迹的显微照片。
[0045]
图4a-4b是示出用奥替苏单抗或对照抗体处理后动脉粥样硬化鼠模型中的巨噬细胞浸润(图4a)和总斑块负荷(图4b)的图。
具体实施方式
[0046]
众所周知，富含脂肪的饮食和脂质相关疾病增加某些类型的癌症(包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌)的发病率。血浆脂质一直与几种类型的癌症相关。特别地，发现在一些乳腺癌患者中总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)和ldl显著更高。
[0047]
高脂肪饮食可诱导向支持癌细胞发育和生长的有利微环境转变。所述转变由激素环境或细胞膜性质的变化(细胞膜性质的变化是由于脂质组成的改变)或通过调节对肿瘤细胞的免疫反应引起。并且与其他脂质相关的代谢疾病(例如肥胖和nash)一样，氧化应激导致ldl氧化为oxldl，从而引起大量促诱变和促癌作用。各种临床研究强调了oxldl在致癌过程中的作用，并且已经针对胰腺癌、结肠癌、乳腺癌以及食道癌报告了血清oxldl浓度升高与癌症风险之间的正相关。此外，在结肠直肠癌(crc)患者的临床研究中，将由于氧化应激导致的脂质氧化产物(包括oxldl)作为crc发展的潜在标志物进行了研究。虽然这项研究没有观察到crc患者与健康对照之间oxldl血清水平的显著差异，但与患有晚期原发性肿瘤进展的患者相比，在患有早期原发性肿瘤患者中oxldl的水平显著更高(diakowska等人,gastroenterol.res.pract.2015:146819(2015))。
[0048]
通过lox-1进行的oxldl介导的信号传导导致粘附蛋白、其他促炎介质和促血管生成因子的上调，所有这些在癌症中都是致病性的。在这些致病性信号传导分子中，有单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)和核因子-κb(nfκb)。mcp-1是驱动巨噬细胞募集至炎症区域并且其表达与肿瘤相关巨噬细胞(tam)浸润的程度相关的趋化因子。nfκb是充当促炎性基因表达的主要调控因子的转录因子。nfκb活性在包括癌症在内的炎症性疾患中上调，其中它促成正常细胞转化为肿瘤细胞、肿瘤细胞存活和癌症中持续存在的炎症循环。重要的是，oxldl-lox-1介导的信号传导一直与mcp-1上调和nfκb活性两者有关。
[0049]
本发明部分地基于抗oxldl抗体的抗癌性质的表征。直接干扰oxldl可抑制lox-1介导的肿瘤发生和/或进展。本发明还基于以下发现，即相对于天然/未氧化ldl，奥替苏单抗特异性地结合氧化形式的ldl(即oxldl)。奥替苏单抗是对oxldl具有约8
±
6nm的亲和力的完全人重组单克隆igg1抗体。
[0050]
抗oxldl抗体
[0051]
如本文所论述的，本发明结合了抗oxldl抗体。一种特别有用的抗oxldl抗体是奥替苏单抗。奥替苏单抗的合成和表征在wo2009/08205中进行了描述并且在其中被称为抗体2d03。wo2009/08205特此以引用的方式整体并入。
[0052]
wo 2009/08205的图2描述了2d03重链和2d03轻链的氨基酸序列，互补决定区(cdr)加下划线。
[0053]
wo 2007/025781(其特此以引用的方式整体并入)描述其发明还包括选择性地结合至被抗体2d03(即奥替苏单抗)选择性结合的氧化ldl表位的抗体，并且还包括包含至少一个、两个、三个、四个、五个或所有六个具有抗体2d03的相应cdr的氨基酸序列的互补决定区(cdr)的抗体。(参见例如，第16、29和30页。)此外，具有三个或四个具有对应于2d03抗体cdr的序列的cdr的抗体优选具有所有三个重链或所有三个轻链cdr，所述cdr具有抗体2d03的相应cdr的序列；因此本发明的这个方面包括包含具有抗体2d03的相应三个轻链cdr的序列的三个轻链cdr或具有抗体2d03的相应三个重链cdr的序列的三个重链cdr的抗体；还更优选地，所述抗体包含三个轻链cdr和三个重链cdr，所述cdr具有抗体2d03的相应cdr的序列；如果所述抗体不包含具有抗体2d03的相应cdr序列的所有六个cdr，则优选1、2、3、4或5个“不同”cdr中的一些或全部包含抗体2d03的相应cdr的序列的变体，(关于“变体”，wo 2007/025781包括变体与相应cdr的序列具有至少50％序列同一性的含义，更优选至少70％、还更优选至少80％或至少90％或至少95％；最优选地，变体与抗体2d03的相应cdr的序列具有96％或97％或98％或99％序列同一性；通常，“变体”cdr序列与抗体2d03的相应cdr序列具有5个或4个或3个或2个或仅1个氨基酸残基差异)；并且本发明的这个方面包括抗体2d03。
[0054]
重链互补决定区(hcdr)1(hcdr1)、2(hcdr2)和3(hcdr3)分别在seq id no:5、6和7中列出；并且轻链互补决定区(lcdr)1(lcdr1)、2(lcdr2)和3(lcdr3)分别在seq id no:8、9和10中列出。奥替苏单抗含有seq id no:11的可变重区(vh)氨基酸序列和seq id no:12的可变轻区(vl)氨基酸序列。奥替苏单抗含有seq id no:3的重链氨基酸序列、seq id no:4的轻链氨基酸序列。
[0055]
hcdr1是fsnawmswvrqapg(seq id no:5)。
[0056]
hcdr2是ssisvgghrtyyadsvkgr(seq id no:6)。
[0057]
hcdr3是arirvgpsggafdy(seq id no:7)。
[0058]
lcdr1是csgsntnigknyvs(seq id no:8)。
[0059]
lcdr2是ansnrps(seq id no:9)。
[0060]
lcdr3是caswdaslngwv(seq id no:10)。
[0061]
可变重区(vh)是：
[0062]
evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs nawmswvr qa pgkglewvss isvgghrtyy adsvkgrsti srdnskntly lqmnslraed tavyycarir vgpsggafdy wgqgtlvtvs(seq id no:11)。
[0063]
可变轻区(v
l
)是：
[0064]
qsvltqppsa sgtpgqrvti scsgsntnig knyvswyqql pgtapklliy ansnrpsgvp drfsgsksgt saslaisglr sed eadyyca swdaslngwv fgggtkltvl(seq id no:12)。
[0065]
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含在seq id no:1和/或2中列出的序
id no:8中列出的lcdr1和如seq id no:10中列出的lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有如seq id no:9中列出的lcdr2和如seq id no:10中列出的lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-7中列出的hcdr1、hcdr2和hcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6和8中列出的hcdr1、hcdr2和lcdr1。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6和9中列出的hcdr1、hcdr2和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6和10中列出的hcdr1、hcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7和8中列出的hcdr1、hcdr3和lcdr1。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7和9中列出的hcdr1、hcdr3和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7和10中列出的hcdr1、hcdr3和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、9和10中列出的hcdr1、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、8和10中列出的hcdr1、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、9和10中列出的hcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、7和8中列出的hcdr2、hcdr3和lcdr1。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、7和9中列出的hcdr2、hcdr3和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、7和10中列出的hcdr2、hcdr3和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、8和10中列出的hcdr2、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、8和10中列出的hcdr2、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、9和10中列出的hcdr2、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:7、8和9中列出的hcdr3、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:7、8和10中列出的hcdr3、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:7、9和10中列出的hcdr3、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:8-10中列出的lcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-8中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3和lcdr1。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-7和10中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-7和10中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6、8和9中列出的hcdr1、hcdr2、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6、8和10中列出的hcdr1、hcdr2、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6、9和10中列出的hcdr1、hcdr2、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7、8和9中列出的hcdr1、hcdr3、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7、8和10中列出的hcdr1、hcdr3、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7、9和10中列出的hcdr1、hcdr3、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、8、9和10中列出的hcdr1、lcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6-9中列出的hcdr2、hcdr3、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6-8和10中列出的hcdr2、hcdr3、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、7、9和10中列出的hcdr2、hcdr3、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6、8、9和10中列出的hcdr2、lcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:7-10中列出的hcdr3、lcdr1、
lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-9中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1和lcdr2。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-8和10中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-7、9和10中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、6、8-10中列出的hcdr1、hcdr2、lcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5、7-10中列出的hcdr1、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:6-10中列出的hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。另一个方面提供了所述抗体含有分别如seq id no.:5-10中列出的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0070]
当制备和使用本文提供的任何多肽序列(例如，cdr)的变体时，应理解给定氨基酸可被具有类似生理化学特征的残基代替，例如，用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基(诸如用ile、val、leu或ala取代另一个)，或用一个极性残基取代另一个极性残基(诸如在lys与arg；glu与asp；或gln与asn之间)。其它此类保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代或具有相似侧链体积的残基的取代是众所周知的。包含保守氨基酸取代的分离的抗体可在本文所述的任何一种测定中进行测试，以确认所需的活性，如通过本文别处所述的测定所确定。
[0071]
氨基酸可根据其侧链的性质的相似性进行分组(在a.l.lehninger,in biochemistry,第二版,第73-75页,worth publishers,new york(1975)中)：(1)非极性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)；(2)不带电极性：gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)；(3)酸性：asp(d)、glu(e)；(4)碱性：lys(k)、arg(r)、his(h)。可替代地，天然存在的残基可基于共同侧链性质分为几组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile、phe、trp；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln、ala、tyr、his、pro、gly；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe、pro、his或羟基脯氨酸。非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。
[0072]
用于本文所述变体的特别优选的保守取代是如下：ala取代为gly或ser；arg取代为lys；asn取代为gln或his；asp取代为glu或asn；cys取代为ser；gln取代为asn；glu取代为asp；gly取代为ala或pro；his取代为asn或gln；ile取代为leu或val；leu取代为ile或val；lys取代为arg、gln或glu；met取代为leu、tyr或ile；phe取代为met、leu或tyr；ser取代为thr；thr取代为ser；trp取代为tyr或phe；tyr取代为phe或trp；和/或phe取代为val、tyr、ile或leu。通常，保守取代涵盖与具有类似物理化学性质的残基的残基交换(即用疏水性残基取代另一个疏水性氨基酸)。
[0073]
不参与维持如本文所述的分离的肽的适当构象的任何半胱氨酸残基还可被(通常用丝氨酸)取代以便改进分子的氧化稳定性并且预防异常交联。相反，半胱氨酸键可如本文所述添加至分离的肽以改进其稳定性或促进多聚化。
[0074]
在一些实施方案中，如本文所述的抗体可包含通常存在于由活生物体产生的多肽和/或蛋白质中的天然存在的氨基酸，例如ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)、gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)、asp(d)、glu(e)、lys(k)、arg(r)和his(h)。在一些实施方案中，所述抗体可包含替代氨基酸。替代氨基
酸的非限制性实例包括d-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺(3-巯基-d-缬氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和叔丁基甘氨酸)、二氨基丁酸、7-羟基-四氢异喹啉羧酸、萘基丙氨酸、联苯基丙氨酸、环己基丙氨酸、氨基-异丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、四氢异喹啉羧酸、哌可酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、环己基甘氨酸、脱氢亮氨酸、2,2-二乙基甘氨酸、1-氨基-1-环戊烷羧酸、1-氨基-1-环己烷羧酸、氨基-苯甲酸、氨基-萘甲酸、γ-氨基丁酸、二氟苯丙氨酸、哌啶甲酸、α-氨基丁酸、噻吩基-丙氨酸、叔丁基甘氨酸、三氟缬氨酸、六氟亮氨酸、氟化类似物、叠氮化物修饰的氨基酸、炔烃修饰的氨基酸、氰基修饰的氨基酸以及它们的衍生物。
[0075]
在一些实施方案中，可修饰抗体，例如可将部分添加至一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述抗体可包含一个或多个部分分子，例如每个肽1个或更多个部分分子、每个肽2个或更多个部分分子、每个肽5个或更多个部分分子、每个抗体10个或更多个部分分子、或每个抗体更多个部分分子。在一些实施方案中，如本文所述的抗体可包含一种或多种类型的修饰和/或部分，例如1种类型的修饰、2种类型的修饰、3种类型的修饰或更多种类型的修饰。修饰和/或部分的非限制性实例包括peg化；糖基化；hes化；elp化；脂化；乙酰化；酰胺化；封端修饰；氰基；磷酸化；以及环化。在一些实施方案中，封端修饰可包括n-末端的乙酰化、n-末端酰化和n-末端甲酰化。在一些实施方案中，封端修饰可包括c-末端的酰胺化、引入c-末端醇、醛、酯和硫酯部分。
[0076]
治疗方法
[0077]
本发明还提供了通过向受试者施用治疗有效量的特异性地结合至oxldl的抗体或抗体片段来治疗或预防癌症的方法。本发明还提供了通过向受试者施用治疗有效量的特异性地结合至oxldl的抗体或抗体片段来预防被诊断为患有癌症的受试者中的转移的方法。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的结合抑制或阻断oxldl的至少一种生物学功能。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、包括直肠腺癌和结肠腺癌的结肠直肠癌、卵巢癌、膀胱尿路上皮癌、肾透明细胞癌、前列腺癌(前列腺腺癌)，在一些实施方案中，癌细胞表达和/或被鉴定为表达lox-1。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制、减少或阻断oxldl与lox-1的结合。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制、减少或阻断oxldl与sr-a、cd36、cd38和/或粘蛋白的结合。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是奥替苏单抗、奥替苏单抗的片段、奥替苏单抗的衍生物、或本文所述的任何抗oxldl抗体或抗体片段。
[0078]
在各种实施方案中，在所公开的方法中待施用的组合物被配制用于通过任何施用途径递送。例如，所述方法包括通过气雾剂、经鼻、经口、经粘膜、经皮、胃肠外或肠内途径施用。“胃肠外”是指通常与包括眼眶内、输注、动脉内、囊内、心脏内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、经粘膜或经气管的注射有关的施用途径。通过胃肠外途径，组合物可以是用于输注或注射的溶液或悬浮液形式，或作为冻干粉末。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或悬浮液形式。通过肠内途径，药物组合物可呈允许受控释放的片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒剂、乳剂、微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡形式。通常，通过注射施用
组合物。
[0079]
通常，本文公开的方法中有效量的抗oxldl在受试者中产生至少4μg/ml、最优选至少12μg/ml的血浆浓度。
[0080]
本发明的方法可包括以约330mg/月向所述受试者皮下施用上文公开的抗体或抗体片段持续约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长时间，并且所述受试者是成人。其他实施方案提供以不少于2mg/kg/周(对于平均83kg的人患者为166mg)；最优选，约4mg/kg/周(对于平均83kg的人患者为332mg)每周施用所述抗体或抗体片段。在另一个方面，抗oxldl抗体的组合物以》2.5mg/kg/两周(例如，对于平均83kg的人患者为208mg)每两周施用一次。在另一个方面，抗oxldl抗体的组合物以约6mg/kg/月(例如，对于平均83kg的人患者为约498mg)每月施用一次。例如，每月给药可进行12个月或3个月。其他实施方案提供以800-900mg、900-1000mg、1000-1100mg、1100-1200mg、1200-1300mg、1300-1400mg、1400-1500mg或1500-1600mg的初始剂量向受试者施用抗体或抗体片段。在一些方面，本文所述的方法中的有效量包括大约1000-1500mg的奥替苏单抗的初始剂量，随后是以700-900mg每周施用持续2、3、4或5周和/或甚至每月施用持续1、2或3个月的抗体的后续剂量。
[0081]
其他实施方案提供施用逐步递增剂量的抗oxldl抗体或片段。在此实施方案中，针对oxldl的抗体(例如，奥替苏单抗)的单剂量施用的示例性(起始)剂量介于0.005与0.01mg/kg之间(例如，静脉内)；并且在单剂量施用中待施用的其他示例性剂量水平介于0.01与0.15mg/kg之间、介于0.15与0.75mg/kg之间、介于0.75与2.5mg/kg之间、介于2.5与7.5mg/kg之间和介于7.5与30mg/kg之间(例如，静脉内)。例如，单剂量静脉内施用的奥替苏单抗的起始剂量是0.007mg/kg；并且在随后的单剂量静脉内施用中其他示例性剂量可以是0.05、0.25、1.25、5.0或15.0mg/kg。在另一个实施方案中，抗体的单剂量皮下施用介于0.5与5mg/kg之间，并且多剂量皮下施用也介于0.5与5mg/kg之间。例如，皮下施用1.25mg/kg的抗体。在各种实施方案中，剂量在每次施用中在每天的特定小时范围内施用，并且多剂量治疗(例如，4个剂量、3个剂量、5个剂量或6个剂量)中的每个剂量以
±
1天的时间窗口以每周间隔施用。在另一个实例中，抗体(例如，奥替苏单抗)以介于300mg与450mg之间(例如，360mg)施用于人受试者，任选地随后向所述人受试者施用介于300mg与450mg之间(例如，360mg)的另一个剂量，其中第二剂量与第一剂量相隔至少70天(最多91天)。抗体可以100-170mg/ml(例如，150mg/ml)的浓度配制且用于皮下施用，而无需进一步稀释或稀释至用于静脉内输注的大体积。
[0082]
其他实施方案包括向受试者施用在约10-50μg/周期、50-100μg/周期、100-150μg/周期、150-200μg/周期、100-200μg/周期、200-300μg/周期、300-400μg/周期、400-500μg/周期、500-600μg/周期、600-700μg/周期、700-800μg/周期、800-900μg/周期、900-1000μg/周期、1000-1100μg/周期、1100-1200μg/周期、1200-1300μg/周期、1300-1400μg/周期、1400-1500μg/周期、1500-1600μg/周期、1600-1700μg/周期、1700-1800μg/周期、1800-1900μg/周期、1900-2000μg/周期、2000-2100μg/周期、2100-2200μg/周期、2200-2300μg/周期、2300-2400μg/周期、2400-2500μg/周期、2500-2600μg/周期、2600-2700μg/周期、2700-2800μg/周期、2800-2900μg/周期或2900-3000μg/周期范围内的有效量的抗体。周期是一天、一周、一个月或其他时间长度。一个方面是抗体(例如，奥替苏单抗)以每周期任何上述剂量的每周、每两周或每月频率施用。
[0083]
在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗oxldl抗体(例如，奥替苏单抗)持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。例如，所述抗体以3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个剂量施用于受试者，每个剂量相隔至少3天、5天、1周、2周、1个月、2个月或它们的组合。在其他实施方案中，第二剂量在第一剂量后约2-3周或约3周施用，并且第三剂量在第一剂量后约5-6周或约6周施用等。在另一个实施方案中，第二剂量在第一剂量后约2-3个月、约2个月、约3个月或约4个月施用，并且第三剂量在第一剂量后约4-6个月、约5-6个月、约5个月或约6个月施用。
[0084]
药物组合物和药物
[0085]
在各种实施方案中，本发明提供了用于所述方法中的药物组合物。所述药物组合物包含抗oxldl抗体或其片段和药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，其参与携带或转运目标化合物从一个组织、器官或身体的一部分到另一个组织、器官或身体的一部分。举例而言，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的组合。赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、着色剂、剥离剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、增塑剂、胶凝剂、增稠剂、硬化剂、定型剂、悬浮剂、表面活性剂、湿润剂、载体、稳定剂以及它们的组合。一般来说，载体的各组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适用于与它可能与之接触的任何组织或器官接触，这意味着它必须不携有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过度超过其治疗益处的任何其它并发症的风险。
[0086]
根据本发明，药物组合物可以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是将在给定受试者中就治疗功效而言产生最有效结果的组合物的量。这个量将取决于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药物动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验，例如通过监测受试者对施用化合物的反应以及相应地调整剂量来确定治疗有效量。对于其它的指导，参见remington:the science and practice of pharmacy(gennaro编,第20版,williams&wilkins pa,usa)(2000)。
[0087]
抗体制备
[0088]
本发明部分地基于抗oxldl抗体、片段和结合蛋白的使用。现代重组文库技术用于制备针对oxldl的治疗性抗体。虽然鼠杂交瘤细胞产生大量相同的抗体，但这些非人抗体被人体识别为外来，并且因此，除了引发过敏反应外，它们的功效和血浆半衰期也会降低。为了解决这个问题，一种方法是制备嵌合抗体，其中抗体的鼠可变结构域被转移至人恒定区，从而产生主要是人的抗体。这种方法的进一步改进是开发人源化抗体，其中与抗原接触的鼠抗体区域，即互补决定区(cdr)被转移至人抗体框架，从而产生人源化抗体。另一种方法是使用重组技术生产完全人抗体，所述技术不依赖于动物免疫来产生特异性抗体。相反，重组文库包含大量预先制备的抗体变体，并且文库很可能具有至少一种对任何抗原具有特异性的抗体。可使用噬菌体展示系统，其中抗体片段被表达、展示为与丝状噬菌体颗粒表面上的噬菌体外壳蛋白的融合物，而噬菌体展示系统同时携带编码所展示分子的遗传信息。可通过与所讨论的抗原结合来选择对特定抗原具有特异性的噬菌体展示抗体片段。然后可扩
增分离的噬菌体，并且可任选地将编码所选抗体可变结构域的基因转移至其他抗体形式，例如全长免疫球蛋白，并使用本领域熟知的适当载体和宿主细胞大量表达。噬菌体颗粒上展示的抗体特异性的形式可能不同。最常用的形式是fab和单链(scfv)，两者均含有抗体的可变抗原结合结构域。单链形式由通过柔性接头连接至可变轻结构域(vl)的可变重结构域(vh)组成。在用作分析试剂或治疗剂之前，将所展示的抗体特异性转化为可溶形式，例如fab或scfv，并如此进行分析。在随后的步骤中，可将被鉴定为具有合乎需要的特征的抗体片段转移至其他形式，如全长抗体中。
[0089]
来自杂交瘤的抗体产生
[0090]
细胞融合通过免疫学领域的技术人员熟知的标准程序完成。用于融合和选择杂交瘤以及筛选mab的融合配偶体细胞系和方法是本领域众所周知的。参见例如，ausubel,harlow和colligan，所述参考文献的内容以引用的方式完全并入本文。
[0091]
可通过以下方式大量产生抗oxldl抗体：将分泌抗体的杂交瘤或转染瘤细胞注射到小鼠腹腔内，在适当时间后，收获含有高滴度mab的腹水，并且从所述腹水中分离所述mab。对于使用非鼠类杂交瘤(例如，大鼠或人)的mab的这种体内产生，杂交瘤细胞优选在经照射或无胸腺的裸鼠中生长。可替代地，抗体可通过在体外培养杂交瘤或转染瘤细胞并从细胞培养基中分离分泌的mab或在真核或原核细胞中重组来产生。
[0092]
抗体的重组表达
[0093]
可根据本发明使用基于本文提供的教导的已知技术提供抑制氧化ldl的重组鼠或嵌合鼠-人或人-人抗体。参见例如，ausubel等人，编current protocols in molecular biology,wiley interscience,n.y.(1987,1992,1993)；和sambrook等人molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press(1989)。
[0094]
编码抗oxldl抗体的dna可以是编码重链恒定区(hc)、重链可变区(hc)、轻链可变区(lv)和轻链恒定区(lc)中的至少一者的基因组dna或cdna。使用染色体基因片段作为编码鼠v区抗原结合区段的dna来源的方便的替代方案是使用cdna构建嵌合免疫球蛋白基因，例如，如由liu等人(proc.natl.acad.sci.,usa 84:3439(1987)和j.immunology 139:3521(1987)所报告。使用cdna需要将适合宿主细胞的基因表达元件与基因组合以实现所需蛋白质的合成。使用cdna序列相对于基因组序列(其含有内含子)是有利的，在于cdna序列可在细菌或其他缺乏适当rna剪接系统的宿主中表达。
[0095]
实施例
[0096]
以下实施例并不意图将权利要求书的范围限于本发明，而是意图成为某些实施方案的示例。技术人员想到的所举例方法的任何变型意图落入本发明的范围内。
[0097]
实施例1：奥替苏单抗特异性地结合至oxldl
[0098]
研究了奥替苏单抗对各种形式的ldl的结合特异性。在此实验中，跨不同浓度的奥替苏单抗测量了奥替苏单抗与天然(未氧化)ldl和丙二醛修饰的ldl(mda-ldl)的结合，并计算了解离常数(kd)。选择mda-ldl用于此实验是因为它是内源性ldl种类，据信它反映了oxldl的天然存在水平。
[0099]
在elisa测定中测试了奥替苏单抗与从献血者的血清制备的丙二醛(mda)修饰的和天然人ldl的结合。将ldl样品固定在板上并滴定抗体浓度。多孔板每孔涂有50μl mda-ldl或天然ldl并用pbs 1mm edta稀释至2ug/ml。将板在4℃下孵育过夜。将纯化的抗体稀
释，在elisa封闭缓冲液(0.2％脱脂乳粉)中滴定，然后施加。将板在室温下孵育1小时。用辣根过氧化物酶(hrp)缀合的兔抗人igg抗体(p0214 dako)检测结合的抗体。
[0100]
图1提供奥替苏单抗(0.01
–
50μg/ml)对天然ldl和mda-ldl的示例性结合曲线。奥替苏单抗对天然ldl缺乏任何显著亲和力，但表现出与mda-ldl的稳健和特异性结合，kd为约8
±
6nm。
[0101]
实施例2：奥替苏单抗阻断oxldl诱导的巨噬细胞释放mcp-1
[0102]
测量了奥替苏单抗对oxldl诱导的巨噬细胞释放mcp-1的影响，以评估潜在抗炎作用。mcp-1是由炎症区域中的活化巨噬细胞分泌且用于增强炎症反应的巨噬细胞化学引诱物。mcp-1表达与肿瘤相关的巨噬细胞浸润有关。
[0103]
用0.1ng/ml脂多糖(lps)预活化新鲜分离的cd14 巨噬细胞以产生促炎性m1巨噬细胞。在预活化20小时后，添加奥替苏单抗、fitc-8或等体积的培养基至最终浓度40nm，并将细胞再培养24小时。收集培养物上清液并使用细胞计数珠阵列(cba；bd bioscience,franklin lakes,nj,usa)分析mcp-1水平。图2a示出在一式三份进行处理的两个不同实验中从两个不同供体获得的平均值( /-sd)或汇集的和归一化的数据。针对未接受抗体处理的样品的平均mcp-1值对值进行归一化。通过anova进行统计分析，然后使用graphpad instat 3软件进行tukey-kramer的多重比较测试(***p《0.001)。(存储数据；报告bi 209-68)结果表明，相对于用对照抗体(fitc-8)和媒介物对照(“无ab”)处理，奥替苏单抗处理显著降低ox-ldl刺激的巨噬细胞中的mcp-1分泌。
[0104]
在另一个实验中，使人单核细胞来源的巨噬细胞在含有oxldl的人血清存在下生长14天。然后将这些细胞用对照igg(fitc-8)或奥替苏单抗处理指定的时间段。每天取出上清液并分析mcp-1水平。图2b说明，在奥替苏单抗存在下，mcp-1水平不随时间推移增加，如在用对照抗体处理的培养物中所观察到的，从而表明奥替苏单抗有效地阻断了mcp-1分泌。例如，在4天(96小时)后，与用对照igg处理的细胞相比，奥替苏单抗阻断了mcp-1的增加，使巨噬细胞mcp-1释放降低高达60％。
[0105]
实施例3：奥替苏单抗通过增加iκbα表达而抑制nfκb信号传导
[0106]
nfκb是对大多数细胞类型中的应力刺激作出反应并通常上调免疫反应和参与炎症的基因的众所周知的转录调控因子。在未刺激的细胞中，nfκb主要存在于细胞质中，并被包括iκb在内的抑制剂螯合，所述抑制剂掩蔽其核定位信号。在细胞刺激下，iκb通过iκb激酶(“ikk”)快速磷酸化，并且随后泛素化且降解。一旦摆脱iκb抑制，nfκb就迅速易位至细胞核。
[0107]
在nfκb途径中研究了奥替苏单抗对oxldl信号传导的影响。在oxldl存在下用脂多糖(lps)刺激巨噬细胞，并用奥替苏单抗或对oxldl和/或天然ldl缺乏显著亲和力的突变型奥替苏单抗样抗体进行处理。从健康受试者中分离单核细胞并在不存在或存在0.3ng/ml脂多糖(lps)的情况下孵育。将细胞同时用对照抗体、奥替苏单抗或突变型奥替苏单抗进行处理。然后收获细胞并进行免疫印迹以获得总iκbα或对照蛋白(肌动蛋白)的总量。用ripa缓冲液(150mm nacl、1.0％igepal ca-630、0.5％v/v脱氧胆酸钠、0.1％w/v sds和50mm tris-氯化物，ph 8.0)提取来自原代人单核细胞的全细胞裂解物。在离心以除去细胞碎片后，将20,000g上清液的等分试样进行10％sds/page，之后将蛋白质转移至hybond-c额外硝酸纤维素过滤器(amersham biosciences,piscataway,nj)。将所述过滤器在室温下与一级
抗体一起孵育。使用与辣根过氧化物酶缀合的驴抗兔igg或驴抗小鼠igg(jackson immunoresearch,west grove,pa)的1:5000稀释液将结合的抗体通过化学发光(super signal substrate；thermo fisher scientific,waltham,ma)可视化。将过滤器在室温下暴露于柯达x-omat bluexb-1胶片1-60秒。
[0108]
如图3所示，发现奥替苏单抗处理诱导lps刺激的巨噬细胞和对照巨噬细胞中iκbα的表达。这些结果表明，奥替苏单抗通过经由增加iκbα表达来抑制nfκb而在oxldl刺激的巨噬细胞中具有抗炎活性。
[0109]
实施例4：奥替苏单抗抑制巨噬细胞浸润
[0110]
基于上述生物化学证据，研究了奥替苏单抗对oxldl诱导的巨噬细胞浸润的最终影响。使用了充分表征的动脉粥样硬化小鼠模型。将来自jackson laboratories(bar harbor,maine)的具有c57bl/6背景的apobec-1-/-/ldlr-/-小鼠(所述小鼠在其ldl颗粒中表达全长apob-100并且具有与ldlr-/-小鼠相比高3倍的血浆apob-100水平)从4周龄开始喂食随意提供的高胆固醇饮食(15％胆固醇，21％脂肪；lactamin ab,kimstad sweden)。在第一次处理前一周(24周龄)，将饮食改为正常食物。一周后(25周龄)，处死一组小鼠作为基线对照(基线25w)。剩余动物未经处理(对照29w)或通过腹膜内(ip)注射施用1mg(0.5ml)对照igg抗体(异硫氰酸荧光素-8(fitc-8)或奥替苏单抗。以每周间隔重复注射，总计3个剂量次，并且在最后一次注射后2周(29周龄)处死小鼠。
[0111]
使用两个终点评估奥替苏单抗对于限制巨噬细胞浸润的功效。图4a表明相对于未处理或施用了对照igg的对照，斑块形成后奥替苏单抗处理4周显著减少了观察到的浸润巨噬细胞数量。这种抑制导致经处理受试者中的有益生理变化。通过moma2单克隆抗体染色评估无名动脉中的巨噬细胞浸润(*对fitc-8相比，p《0.05)。图4b说明相对于处理前条件和各种对照，奥替苏单抗处理显著降低了斑块负荷。通过油红o染色评估降主动脉中的斑块负荷，并计算每降主动脉总面积的总斑块面积百分比。相对于异硫氰酸荧光素-8(fitc-8)计算p值(***与fitc-8相比，p《0.001)。
[0112]
本文引用的所有参考文献都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。allen等人,remington:the science and practice of pharmacy第22版,pharmaceutical press(2012年9月15日)；hornyak等人,introduction to nanoscience and nanotechnology,crc press(2008)；singleton和sainsbury,dictionary of microbiology and molecular biology第3版，修订版,j.wiley&sons(new york,n.y.2006)；smith,march'sadvanced organic chemistry reactions,mechanisms and structure第7版,j.wiley&sons(new york,n.y.2013)；singleton,dictionary of dna and genome technology第3版,wiley-blackwell(2012年11月28日)；以及green和sambrook,molecular cloning:a laboratory manual第4版,cold spring harbor laboratory press(cold spring harbor,n.y.2012)为本领域的技术人员提供对本技术中使用的许多术语的一般指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见greenfield,antibodies a laboratory manual第2版,cold spring harbor press(cold spring harbor n.y.,2013)；和milstein,derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,eur.j.immunol.1976年7月6(7):511-9；
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[0113]
前述描述在若干实施方案中阐述了本发明和使用方法。本领域的普通技术人员可能能够对本文描述的内容进行改变和修改而不背离其精神和范围。虽然本发明可以有不同形式的不同实施方案，但在附图中示出并将在本文中详细描述本发明的优选实施方案，应了解，应将本公开视为本发明原理的例示，并且不意图将本发明的广泛方面限于所说明的实施方案。除非另有说明，否则关于本文提供的任何实施方案描述的所有特征、要素、组分、功能和步骤意图与来自任何其他实施方案的那些特征、要素、组分、功能和步骤自由组合和替换。因此，应理解，所说明的内容仅出于示例的目的阐述，并且不应被视为对本发明范围的限制。
[0114]
本发明已在本文中进行了广泛性和一般性的描述。落在一般性公开范围内的每个较狭义的物种和亚属群也是所述方法的形成部分。这包括具有附带条件或否定限制的所述方法的一般性描述，以从类属中除去任何主题而不管删除的材料在本文中是否进行了具体叙述。
[0115]
其他实施方案在以下权利要求内。此外，根据markush组描述了所述方法的特征或方面，本领域技术人员将认识到本发明还因此根据markush组的任何个别成员或成员亚组进行了描述。