一种中药组合物、汤药和药物组合物及其制备方法和用途

1.本技术涉及医药技术领域，特别是涉及一种中药组合物、汤药和药物组合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.慢性心力衰竭(以下简称心衰)在传统医学上归于“心痹”、“心水”、“心胀”等范畴，病位在心，主要涉及肺、脾、肾三脏。现代医学认为慢性心力衰竭是因心肌病变或心脏负荷过度等因素引起心脏结构或功能受损，从而导致心室充盈和/或射血能力下降的一种慢性临床综合征。该病是各种心血管疾病发展的终末阶段，已成为21世纪心血管领域的三大疾病之一，具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点，严重危害人类的身体健康，影响人们的生活质量，并且对全世界的医疗保健系统造成显著的经济负担。其主要病因包括心肌梗死、高血压和肺动脉高压等。其中心肌梗死和高血压可导致左心衰竭，肺动脉高压会导致右心衰竭。
3.心肌梗死是冠状动脉缺血缺氧所引起的心肌坏死，是冠心病的严重后果。目前针对心肌梗死的治疗多为再灌注或者直接冠状动脉介入治疗，但是再灌注或介入治疗需要有经验的医生进行操作，既存在一定的手术风险，也会给患者带来很大的经济压力。心肌梗死的西药治疗多为β受体阻滞剂、钙阻滞剂以及硝酸甘油等，但是这些药物都有一定的局限性，用时需要注意有关的禁忌症和不适人群。
4.高血压是最常见的慢性病，目前没有可以治疗高血压的手术方法，临床有5类降压药可以选择使用，但是一般需要终生服用。此外，治疗高血压的降压药均可在初期使用，但需要医生针对人群类型以及合并症来选择药物进行个性化治疗，这需要医生具有很高的专业水平。
5.肺动脉高压的西医治疗方案常为抗感染、强心、利尿、扩血管等，采用的药物成本较高，患者用药频率高、依赖性较强、依从性差，并有一定的副作用，如心率失常、酸、碱电解质紊乱等。而肺移植等手术，难度高，也会给患者带来较大的痛苦及经济负担。
6.目前治疗慢性心力衰竭相关疾病的中药复方较为缺乏，不同医生对同一患者用药的配伍重心不尽相同，临床用药对医生的临床经验依赖性强，存在用药杂乱等问题。


技术实现要素：

7.本技术以中医的辨证论治为基础，通过临床经验结合临床前科学研究的验证，提供了一种可用于预防和/或治疗慢性心力衰竭相关疾病的中药组合物、药物组合物和汤药。本技术还提供了所述药物组合物的制备方法，以及所述药物组合物在制备预防和/或治疗慢性心力衰竭相关疾病的药物中的用途。
8.本技术的第一方面提供一种中药组合物，包含或由以下组成：炙黄芪4-60重量份、汉防己1-9重量份、南葶苈子1-15重量份、夏枯草3-20重量份、丹参3-15重量份、麸炒白术1-9重量份、甘草1-9重量份。
9.本技术的第二方面提供一种汤药，通过用水煎煮本技术的中药组合物并过滤而得到。
10.本技术的第三方面提供一种药物组合物，包含或由下列配比的原料制成的药剂：炙黄芪4-60重量份、汉防己1-9重量份、南葶苈子1-15重量份、夏枯草3-20重量份、丹参3-15重量份、麸炒白术1-9重量份、甘草1-9重量份。
11.本技术的第四方面提供一种本技术的药物组合物的制备方法，包括使所述原料经历用溶剂加热回流、过滤及浓缩滤液的步骤。
12.本技术的第五方面提供本技术第一方面的中药组合物或第二方面的汤药或第三方面的药物组合物在制备用于预防和/或治疗慢性心力衰竭相关疾病的药物中的用途。
13.采用本技术的中药组合物制备的汤药、药物组合物，在心肌梗死或高血压引起的慢性心力衰竭模型中展现出了升高左室射血分数、升高短轴缩短率、改善心脏结构、改善心脏功能的作用，在肺动脉高压引起的慢性心力衰竭模型中展现出了减轻右心肥厚、改善右心室功能的作用，说明本技术的中药组合物、汤药和药物组合物可用于预防和/或治疗慢性心力衰竭相关疾病，进而用于制备预防和/或治疗慢性心力衰竭相关疾病的药物。
14.本技术的中药组合物、汤药或药物组合物，具有成本较低、来源可靠、药效良好、市场前景好等特点，而且前期研究工作基础扎实，药物疗效确切，降低了后续开发的风险。
附图说明
15.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
16.图1为高效液相色谱图，a图为混合对照品溶液的色谱图，b图为供试品为药物组合物a的溶液的色谱图；其中，1是槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙单双糖苷，2是毛蕊异黄酮苷，3是迷迭香酸，4是丹酚酸b，5是甘草酸。
17.图2为lad诱导心衰模型中，空白组、假手术组和lad手术组的超声心动图和射血分数结果；a图为空白组的超声心动图，b图为假手术组的超声心动图，c图为lad手术组的超声心动图，d图为空白组、假手术组和lad手术组的射血分数结果。
18.图3为lad诱导心衰模型中，给药6周后各组大鼠的心脏结构的超声检测结果。
19.图4为lad诱导心衰模型中，给药6周后各组大鼠的心脏功能各评价指标结果。
20.图5为lad诱导心衰模型中，给药6周后各组大鼠的各脏器指数结果。
21.图6为lad诱导心衰模型中，给药6周后各组大鼠心脏的he染色结果；其中，a图为空白组，b图为假手术组，c图为模型组，d图为沙库巴曲缬沙坦组，e图为低剂量组，f图为中剂量组，g图为高剂量组，各图中上方图片为40倍镜下结果，标记为40
×
，下方图为400倍镜下结果，标记为400
×
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22.图7为lad诱导心衰模型中，给药6周后各组大鼠心脏的masson染色结果；a图为空白组，b图为假手术组，c图为模型组，d图为沙库巴曲缬沙坦组，e图为低剂量组，f图为中剂量组，g图为高剂量组，各图中上方图片为40倍镜下结果，标记为40
×
，下方图为400倍镜下结果，标记为400
×
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23.图8为tac诱导心衰模型中，给药4周后各组小鼠的心脏结构的超声检测结果。
24.图9为tac诱导心衰模型中，给药4周后各组小鼠的心脏功能各评价指标结果。
25.图10为tac诱导心衰模型中，给药4周后各组小鼠的各脏器重量及指数结果。
26.图11为tac诱导心衰模型中，给药4周后各组小鼠心脏的he染色结果。
27.图12为tac诱导心衰模型中，给药4周后各组小鼠心脏的天狼星红染色结果。
28.图13为野百合碱诱导心衰模型中，给药3周后各组大鼠的右心室收缩压和平均肺动脉压结果。
29.图14为野百合碱诱导心衰模型中，给药3周后各组大鼠的右心室功能各评价指标结果。
30.图15为野百合碱诱导心衰模型中，给药3周后各组大鼠的各脏器指数结果。
31.图16为野百合碱诱导心衰模型中，给药3周后各组大鼠右心室游离壁的he染色结果。
具体实施方式
32.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
33.本技术的第一方面提供一种中药组合物，包含或由以下组成：炙黄芪4-60重量份、汉防己1-9重量份、南葶苈子1-15重量份、夏枯草3-20重量份、丹参3-15重量份、麸炒白术1-9重量份、甘草1-9重量份。
34.发明人在研究中发现，本技术的中药组合物，炙黄芪、丹参为君药，炙黄芪扶正益气，配伍丹参活血化瘀，二者益气活血，可用于慢性心力衰竭的气虚血瘀证；汉防己、南葶苈子为臣药，汉防己性善下行，为疗风水要药，与善通利水道、泻肺平喘的南葶苈子共为臣药，增强利水消肿之力；麸炒白术、夏枯草共为佐药，麸炒白术补气健脾祛湿，既助南葶苈子、汉防己利水消肿之力，又增炙黄芪益气固表之功，而夏枯草消肿散结，既助臣药利水消肿之力，又增君药丹参活血消瘀之功；甘草作为使药，调和诸药。上述诸药君臣佐使配伍，共奏益气活血、利水消肿之功，可用于慢性心力衰竭的气虚血瘀、水饮内停证，临床可见胸闷、憋气或喘、下肢肿胀等症。
35.在本技术第一方面的一些实施方式中，所述中药组合物包含或由以下组成：炙黄芪8-50重量份、汉防己2-8重量份、南葶苈子3-12重量份、夏枯草5-15重量份、丹参4-12重量份、麸炒白术3-9重量份、甘草2-8重量份。
36.在施用前，本技术的中药组合物可以利用本领域已知的方法进行水煎，施用时服用水煎本技术的中药组合物后获得的汤药。
37.本技术的第二方面提供一种汤药，通过用水煎煮本技术的中药组合物并过滤而得到。
38.本技术的第三方面提供一种药物组合物，包含或由下列配比的原料制成的药剂：炙黄芪4-60重量份、汉防己1-9重量份、南葶苈子1-15重量份、夏枯草3-20重量份、丹参3-15重量份、麸炒白术1-9重量份、甘草1-9重量份。
39.在本技术第三方面的一些实施方式中，所述原料是或包含：炙黄芪8-50重量份、汉防己2-8重量份、南葶苈子3-12重量份、夏枯草5-15重量份、丹参4-12重量份、麸炒白术3-9重量份、甘草2-8重量份。
40.在本技术第三方面的一些实施方式中，所述药剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、溶液、混悬剂或乳剂。
41.在本技术第三方面的一些实施方式中，所述药物组合物可以通过使所述原料经历用溶剂加热回流、过滤及浓缩滤液的步骤而获得。
42.在本技术第三方面的一些实施方式中，所述药物组合物可以通过使所述原料经历以下步骤而获得：将所述原料用溶剂加热回流2次，溶剂量是原料量的6-10倍，第1次2-3h，第2次1-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液。
43.本技术的第四方面提供一种本技术的药物组合物的制备方法，包括使所述原料经历用溶剂加热回流、过滤及浓缩滤液的步骤。
44.在本技术第四方面的一些实施方式中，所述制备方法包括使所述原料经历以下步骤：将所述原料用溶剂加热回流2次，溶剂体积与原料质量比为(6-10)：1，第1次2-3h，第2次1-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液。
45.本技术对制备方法中所用的溶剂不做限定，只要能够实现本技术的目的即可，例如可以是水、乙醇水溶液或乙醇，在回流提取后为了去除部分无效成分可以进一步采用乙醇沉淀的方法进行处理。
46.本技术的第五方面提供本技术第一方面的中药组合物或第二方面的汤药或第三方面的药物组合物在制备用于预防和/或治疗慢性心力衰竭相关疾病的药物中的用途。
47.本技术中的慢性心力衰竭相关疾病，是包括慢性心力衰竭以及能够引起慢性心力衰竭的心血管疾病，例如冠心病、肺心病、心肌梗死、肺动脉高压等。
48.在本技术第五方面的一些实施方式中，所述慢性心力衰竭相关疾病选自冠心病、心肌梗死、肺动脉高压、肺动脉高压引起的并发症中的至少一种。
49.在本技术第五方面的一些实施方式中，所述肺动脉高压引起的并发症选自慢性阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病、左心衰竭、右心衰竭和肝功能损伤中的至少一种。
50.本文所用的术语，如未明确说明或定义，则它们具有本领域技术人员公知的一般含义。
51.如本文使用的，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患慢性心力衰竭或者对慢性心力衰竭具有罹患风险的动物个体采用本技术的药物进行处理，以期对该病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患慢性心力衰竭或者对慢性心力衰竭具有罹患风险的动物个体采用本技术的药物进行处理，以期对该病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。
52.如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义，并且在本文中可以指本技术的原料即原植物药材的组合物、或者是所述原料即原植物药材的提取物组合物、或者是前述提取物进一步加工而成的制剂，例如药物制剂。此外，本技术的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段，得到本技术药物组合物的原料
的有效成分，任选地与一种或更多种药学上可接受的赋形剂混合，然后制成所需的剂型，来制备本技术的药物组合物。
53.本技术药物组合物中可用的“药学上可接受的赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂，特定赋形剂的选择取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的赋形剂，包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
54.本技术的药物组合物可以是适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物制剂。本技术的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。
55.上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本技术的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂、缓释片剂、控释片剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
56.当本技术的药物组合物或者药物组合物作为药物施用于受试个体人或动物时，它们可以以其本身给予，即不加任何的上述药学上可接受的赋形剂，将本技术的药物组合物或者药物组合物以原形直接施用于患者；或者可以是以含有例如1-99％(更优选例如10-90％)的药物组合物(该药物组合物可以是本技术原料药材的提取物的形式)或者药物组合物(该药物组合物可以是本技术原料药材的提取物的形式)与药学上可接受的赋形剂组合后给予人或动物。
57.在本技术的药物组合物或药物组合物中的活性成分，其实际的剂量水平和施用的时程可以适应性改变，以便对于特定的受试个体、组合物和施用方法而言，活性成分的量可以有效地获得期望的治疗应答，而对受试个体无毒性。
58.如本文使用的，术语“个体”或者“动物个体”具有其一般含义，并且在本文中可以指罹患或可能罹患慢性心力衰竭的动物个体，还可以指为了某种目的例如为了科学研究目的而使用的动物个体。具体地说，所述的个体例如是动物个体，特别是哺乳动物个体，例如人、猪、狗、猫、牛、羊、马、大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、猴等。更具体地说，本技术所述的个体是大鼠、小鼠。
59.下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。
60.制备例1本技术的中药组合物
61.按下述配比称取原料：炙黄芪300g、汉防己75g、南葶苈子125g、夏枯草150g、丹参200g、麸炒白术150g、甘草50g，得到中药组合物。
62.制备例2本技术汤药
63.按下述配比称取原料：炙黄芪300g、汉防己75g、南葶苈子125g、夏枯草150g、丹参200g、麸炒白术150g、甘草50g，用凉水浸泡2小时，放入砂锅加水将中药没过，用火熬开后，文火煎熬30-60分钟，然后用纱布过滤，过滤得到的滤液即为本技术的汤药。
64.制备例3本技术一种药物组合物
65.取炙黄芪300g、汉防己75g、南葶苈子125g、夏枯草150g、丹参200g、麸炒白术150g、甘草50g，加入8400ml水，加热回流2.5h，用纱布过滤，得到一次滤液，然后再加入8400ml水，
加热回流1.5h，用纱布过滤，得到二次滤液，合并滤液，减压浓缩滤液，即得本技术药物组合物a，1213.9g。
66.制备例4本技术的另一种药物组合物
67.取炙黄芪40g、汉防己60g、南葶苈子80g、夏枯草110g、丹参120g、麸炒白术60g、甘草70g，加入3600ml水，加热回流2.5h，用纱布过滤，得到一次滤液，然后再加入3600ml水，加热回流1.5h，用纱布过滤，得到二次滤液，合并滤液，减压浓缩滤液，即得本技术药物组合物b，586.5g。
68.制备例5本技术的另一种药物组合物
69.取炙黄芪250g、汉防己40g、南葶苈子55g、夏枯草65g、丹参70g、麸炒白术35g、甘草40g，加入4800ml水，加热回流2h，用纱布过滤，得到一次滤液，然后再加入4800ml水，加热回流2h，用纱布过滤，得到二次滤液，合并滤液，减压浓缩滤液，即得本技术药物组合物c，636.4g。
70.实施例1、本技术的药物组合物中指定成分的含量测定
71.采用高效液相色谱法(hplc)测定本技术的药物组合物中槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙单双糖苷、毛蕊异黄酮苷、迷迭香酸、丹酚酸b、甘草酸的含量。
72.色谱条件：高效液相色谱仪：岛津lc－20a(日本岛津)高效液相色谱仪(spd－m20a检测器，lc－20at泵，sil－20acht自动进样器，cto－20ac柱温箱，lc solution工作站)；色谱柱：c
18
(4.6mm
×
150mm，5μm)；流速：1.0ml/min；流动相a为0.1％甲酸水溶液(v/v)，流动相b为甲醇，梯度洗脱程序为：0
–
10min 3
–
19％b，10
–
15min 19
–
23％b，15
–
30min 23
–
43％b，30
–
50min 43
–
97％b；柱温：40℃；进样量：20μl；pda检测波长：254nm。
73.取对照品槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙单双糖苷2540μg、毛蕊异黄酮苷4970μg、迷迭香酸4970μg、丹酚酸b 2960μg、甘草酸4990μg，精密称定，加甲醇溶解并用50％甲醇定容5ml，制成槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙单双糖苷6μg/ml、毛蕊异黄酮苷2μg/ml、迷迭香酸7μg/ml、丹酚酸b 100μg/ml、甘草酸5μg/ml的混合对照品溶液。取制备例3所得的药物组合物a 0.4g，精密称定，置于50ml锥形瓶中，加25ml 50％甲醇，超声处理30min，取出，放至室温，离心10min，取上清液，即得供试品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，采用上述色谱条件进行测定。
74.检测得到的高效液相色谱图如图1所示，其中，混合对照品溶液的色谱图如图1的a图所示，供试品为药物组合物a的溶液的色谱图如图1的b图所示，根据外标法计算得到含量结果：药物组合物a中槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙单双糖苷含量为0.06％，毛蕊异黄酮苷含量为0.03％，迷迭香酸含量为0.16％，丹酚酸b含量为1.67％，甘草酸含量为0.08％。
75.实施例2、本技术的药物组合物在lad诱导的慢性心力衰竭动物模型中的作用
76.材料：小动物超声仪：加拿大visual sonics公司，vevo2100型号；沙库巴曲缬沙坦钠：北京诺华制药有限公司，sdh395；he染色试剂盒：武汉赛维尔生物科技有限公司，g1005；masson染色试剂盒：武汉赛维尔生物科技有限公司，g1006。实验动物：sprague-dawely(sd)健康成年雄性大鼠200只，体重230-250g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号为1100111911049930。
77.冠状动脉左前降支结扎术(lad)是复制心肌梗死最有效的造模方法。大鼠适应性
饲养一周后，随机分为空白组(9只)、假手术组(9只)和lad手术组(42只)，其中，空白组不进行手术，假手术组进行假手术操作，lad手术组进行lad手术。手术6周后对各组大鼠进行超声心动图和左室射血分数(ef)检测，结果如图2所示。
78.从图2的a图、b图和c图可以看出，手术6周后，lad手术组大鼠(c图)与空白组(a图)、假手术组(b图)大鼠相比，左心室上室壁明显变薄，室壁运动减弱，心室腔变大；从d图中可以看出，lad手术组大鼠射血分数降至40％(
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p《0.001,与空白组比；###p《0.001,与假手术组比)。由此可见，经lad手术6周后心肌梗死大鼠发展为心力衰竭，说明造模成功。
79.将lad手术组大鼠随机分组为5组，根据给药的不同分别命名为模型组、沙库巴曲缬沙坦组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，模型组有10只，其余每组各8只。
80.各实验组大鼠在造模成功后开始给药，每日1次，连续灌胃给药6周。其中，沙库巴曲缬沙坦组，给予3.75mg/ml的沙库巴曲缬沙坦钠水溶液，给药量为0.5ml/100g；低剂量组，给予69.93mg/ml的本技术的药物组合物a的水溶液，给药量为0.5ml/100g；中剂量组，给予139.86mg/ml的本技术的药物组合物a的水溶液，给药量为0.5ml/100g；高剂量组，给予279.72mg/ml的本技术的药物组合物a的水溶液，给药量为0.5ml/100g；空白组、假手术组和模型组，每日按照体重给予0.5ml/100g的生理盐水。其中，沙库巴曲缬沙坦钠现有的治疗心力衰竭的常用药物，在本技术中作为阳性对照。
81.给药结束后检测大鼠的心脏结构、心脏功能、各脏器指数以及心室重塑情况，评价本技术药物组合物对心肌梗死后慢性心力衰竭的治疗作用。
82.(1)心脏结构检测：末次给药后利用小动物超声仪检测各组大鼠的心脏结构变化情况，结果如图3所示，从图3中可以看出，模型组大鼠与空白组、假手术组相比，上室壁明显变薄、变平，室壁运动明显减弱，出现明显的左室扩张，说明模型组大鼠发生了心脏结构的变化，出现了心力衰竭症状；而各给药组(低剂量组、中剂量组和高剂量组)中，大鼠室壁变薄程度显著减轻，室壁运动增强；说明本技术的药物组合物与阳性对照药物均能够改善心力衰竭造成的心脏结构的改变。
83.(2)心脏功能检测：通过小动物超声仪检测各组大鼠的左室射血分数、短轴缩短率、舒张末期左室容积、收缩末期左室容积、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度、舒张末期左室内径、收缩末期左室内径，结果如图4所示，可以看出，模型组大鼠与空白组、假手术组相比，左室射血分数、短轴缩短率、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度显著降低，舒张末期左室容积、收缩末期左室容积、舒张末期左室内径、收缩末期左室内径显著增加(n＝5,
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p《0.001,与空白组比；###p《0.001,与假手术组比)，说明模型组大鼠的心脏功能明显受损。采用阳性药物和本技术的药物组合物处理后，各给药组大鼠的左室射血分数和短轴缩短率相比于模型组都有显著的增加(n＝5,**p《0.01,***p《0.001,与模型组比)；低剂量组大鼠与模型组相比，舒张末期左室容积、收缩末期左室容积、舒张末期左室内径、收缩末期左室内径有显著的改善(n＝5,*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,与模型组比)；中剂量组大鼠与模型组相比，舒张末期左室容积、收缩末期左室容积、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度、舒张末期左室内径、收缩末期左室内径均有显著的改善(n＝5,**p《0.01,***p《0.001,与模型组比)；高剂量组大鼠与模型组相比，收缩末期左室容积、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度、舒张末期左室内径、收缩末期左室内径有显著的改善(n＝5,*p《0.05,***p《0.001,与模型组比)；表明各给药组的大鼠室壁运动明显增
强，左室射血分数显著升高，短轴缩短率显著增加，从而提高了心肌收缩力，保证了心脏供血，说明本技术的药物组合物具有改善心脏功能的作用。
84.(3)脏器指数检测：
85.经小动物超声仪检测后，各组大鼠禁食过夜，隔日处死取材。剖开大鼠腹腔，进行腹主动脉取血，室温静置45分钟，离心后取上清液。剪开大鼠腹腔胸腔，用眼科剪小心分离并剪下肺、心、肝、脾、肾，用生理盐水洗净残余血液后，用滤纸将多余液体吸干，称量各脏器重量，与体重相比计算各脏器指数。测量心脏重量后，分离左心室和剩余部分，称量左心室重量，计算左心室与体重的重量比值。结果如图5所示。
86.从图5中可以看出，假手术组大鼠的心脏指数较空白组有显著降低(n＝5,##p《0.01,与空白组比)；假手术组大鼠的心脏指数与模型组相比具有显著性差异(n＝5,
△△
p《0.01,与模型组比)，即模型组大鼠的心脏指数较假手术组有显著增加，表明模型组大鼠出现了心脏肥大，其余脏器无显著变化；给药后各给药组对心脏指数有改善作用，且对其他脏器没有明显的毒副作用。
87.(4)心室重塑结果检测：
88.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称he染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。本技术采用he染色法对心脏进行染色。masson染色，用于显示组织中纤维的染色方法之一，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。
89.取大鼠心脏，用生理盐水将余血冲洗干净，用4％的多聚甲醛固定，进行he染色和masson染色，显微镜下观察图像，评价心室重塑情况。结果如图6和图7所示。
90.图6为he染色结果，其中a图为空白组，b图为假手术组，c图为模型组，d图为沙库巴曲缬沙坦组，e图为低剂量组，f图为中剂量组，g图为高剂量组，从图中可以看出，与空白组(a图)、假手术组(b图)相比，模型组(c图)左室壁明显变薄，可见片状坏死灶(如c图40
×
中箭头所示)，心肌细胞大小不一(如c图400
×
中箭头所示)，排列紊乱。而各给药组(d-g图)均能不同程度地明显改善以上症状，说明本技术的药物组合物能够缩小梗死面积，改善心肌梗死。
91.masson染色结果如图7所示，其中a图为空白组，b图为假手术组，c图为模型组，d图为沙库巴曲缬沙坦组，e图为低剂量组，f图为中剂量组，g图为高剂量组，从图中可以看出，与空白组(a图)、假手术组(b图)相比，模型组(c图)肌纤维减少，出现大面积的胶原纤维。给药后，各给药组(d-g图)大鼠心肌胶原纤维增生与模型组相比明显减少，说明本技术的药物组合物可使心肌梗死面积缩小，改善心肌纤维化，进而抑制心室重塑。
92.由上述结果可知，本技术药物组合物在心肌梗死导致的慢性心力衰竭模型中，能够升高左室射血分数和短轴缩短率，改善心脏结构和功能，改善心肌纤维化，抑制心室重塑，进而预防和/或治疗慢性心力衰竭。
93.实施例3、本技术的药物组合物在tac诱导的慢性心力衰竭动物模型中的作用
94.材料：小动物超声仪、沙库巴曲缬沙坦钠、he染色试剂盒同实施例2；天狼星红染色试剂盒：武汉赛维尔生物科技有限公司，g1018。动物选择：6-8周龄雄性c56bl/6小鼠160只，体重20
±
2g，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。
95.横主动脉缩窄(tac)可引起左室后负荷加重，模拟临床高血压引起的慢性心力衰竭。小鼠适应性饲养一周后，随机分为空白组(15只)、假手术组(15只)和tac手术组(130只)，其中，空白组不进行手术，假手术组进行假手术操作，tac手术组进行tac手术。手术4周后根据左室射血分数(ef)验证模型，tac手术组小鼠ef在30％-50％，由此可见，经tac手术4周后小鼠出现了心力衰竭，说明造模成功。
96.将tac手术组小鼠随机分组为5组，根据给药的不同分别命名为模型组、沙库巴曲缬沙坦组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各12只。
97.各实验组小鼠在造模结束后开始给药，每日1次，连续灌胃给药4周。其中，沙库巴曲缬沙坦组，给予1.3mg/ml的沙库巴曲缬沙坦钠水溶液，给药量为0.1ml/10g；低剂量组，给予136.5mg/ml的本技术的药物组合物b的水溶液，给药量为0.1ml/10g；中剂量组，给予273mg/ml的本技术的药物组合物b的水溶液，给药量为0.1ml/10g；高剂量组，给予546mg/ml的本技术的药物组合物b的水溶液，给药量为0.1ml/10g；空白组、假手术组和模型组，每日按照体重给予0.1ml/10g的生理盐水。其中，沙库巴曲缬沙坦钠是现有的治疗心力衰竭的常用药物，在本技术中作为阳性对照。
98.给药结束后检测小鼠的心脏结构、心脏功能、各脏器指数以及心室重塑情况，评价本技术药物组合物对高血压后慢性心力衰竭的治疗作用。
99.(1)心脏结构检测：末次给药后利用小动物超声仪检测各组小鼠的心脏结构变化情况，结果如图8所示，从图8中可以看出，模型组小鼠与空白组、假手术组相比，上室壁明显变薄、变平，室壁运动明显减弱，出现明显的左室扩张，说明模型组小鼠发生了心脏结构的变化，出现了心力衰竭症状；而各给药组中，小鼠室壁变薄程度显著减轻，室壁运动增强；说明本技术的药物组合物与阳性对照药物均能够改善心力衰竭造成的心脏结构的改变。
100.(2)心脏功能检测：通过小动物超声仪检测各组小鼠的左室射血分数、短轴缩短率、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度、舒张时左室内径、收缩时左室内径、舒张末期左室后壁厚度、收缩末期左室后壁厚度、舒张时左室容积、收缩时左室容积，结果如图9所示，可以看出，模型组小鼠与假手术组相比，左室射血分数、短轴缩短率显著降低，收缩时左室内径、舒张末期左室后壁厚度、收缩末期左室后壁厚度显著增加(n＝5,#p《0.05,与假手术组比)，舒张末期室间隔厚度、舒张时左室内径、舒张时左室容积、收缩时左室容积均有增加的趋势，表明模型组小鼠出现了心肌肥厚和心室扩张。采用阳性药物和本技术的药物组合物处理后，与模型组相比，低剂量组小鼠的左室射血分数有显著改善，沙库巴曲缬沙坦组、低剂量组和中剂量组小鼠的短轴缩短率都有显著的改善(n＝5,*p《0.05,与模型组比)；低剂量组和高剂量组小鼠与模型组相比，收缩时左室内径有显著的改善，舒张时左室容积、收缩时左室容积都有改善的趋势(n＝5,*p《0.05,与模型组比)；说明本技术的药物组合物能够显著改善小鼠的心肌肥厚和心室扩张，表明本技术的药物组合物具有改善心脏功能的作用。
101.(3)脏器重量和指数检测：
102.经小动物超声仪检测后取材，各组小鼠麻醉后摘眼球取血，并取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、左心室，剥离脏器周围组织称重，与体重相比计算各脏器指数，各脏器指数为各脏器重量与体重的比值。取小鼠右侧后肢胫骨，并用游标卡尺测量长度，计算心脏重量与胫骨长度比。结果如图10所示。
103.从图10中可以看出，模型组小鼠的心脏重量、左心室重量、心脏/体重比、左心室/体重比与假手术组相比有显著增加，心脏重量/胫骨长度比有增加的趋势(n＝5,#p《0.05,与假手术组比)，即模型组小鼠出现了心肌肥大，其余脏器无显著变化；给药后低剂量组和高剂量组小鼠的心脏重量、左心室重量有降低的趋势，心脏/体重比、左心室/体重比、心脏重量/胫骨长度比也有相应的降低，表明本技术的药物组合物可一定程度的改善心力衰竭小鼠的心肌肥大，且对其他脏器没有明显的毒副作用。
104.(4)心室重塑结果检测：
105.天狼星红染色，用于显示组织中纤维的染色方法之一，胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色。本研究取小鼠心脏，进行he染色和天狼星红染色，评价心室重塑情况。结果如图11和图12所示。
106.图11为he染色结果，其中，各组中右图为左图的局部放大图；从各组左图(视野1mm)中可以看出，与空白组、假手术组相比，模型组小鼠的心脏明显增大，室壁(如左图中细箭头所示)及室间隔(如左图中粗箭头所示)明显增厚，心腔扩大，表现为明显的心肌肥厚；从各组右图(视野50μm)中可以看出，空白组和假手术组小鼠心肌正常、心肌细胞排列整齐，模型组小鼠心肌细胞(如右图中箭头所示)出现紊乱、坏死、正常结构丧失等病理表型；给药后各给药组心力衰竭小鼠的病例表型被排列整齐的心肌细胞取代，心脏体积缩小，心肌肥厚得到改善。
107.图12为天狼星红染色结果，从图中可以看出，与空白组、假手术组相比，模型组小鼠的心脏胶原纤维明显增多(如图中箭头所示)，表现为心肌纤维化。给药后，各给药组小鼠的心脏胶原纤维与模型组相比明显减少，说明本技术的药物组合物可使心脏胶原纤维减少，改善心肌纤维化，进而抑制心室重塑。
108.由上述结果可知，本技术药物组合物在高血压导致的慢性心力衰竭模型中，能够升高左室射血分数和短轴缩短率，改善心脏结构和功能，改善心肌肥厚和心室扩张，改善心肌纤维化，抑制心室重塑，进而预防和/或治疗慢性心力衰竭。
109.实施例4、本技术的药物组合物在野百合碱诱导的慢性心力衰竭动物模型中的作用
110.材料：millar压力传感器导管：ad instruments公司；小动物超声仪、he染色试剂盒同实施例2。动物选择：sprague-dawely(sd)健康成年雄性大鼠60只，体重230-250g，来源：中国食品药品检定研究院。
111.野百合碱是从野百合种子中提取的一种吡咯烷生物碱，它在大鼠体内被肝脏的混合功能氧化酶转化为野百合吡咯，野百合吡咯损伤肺血管内皮细胞，从而引起肺动脉平滑肌细胞进行性增殖，导致肺动脉压进行性增高，进而导致右心室压力超负荷，造成大鼠右心室肥大，建立右心衰竭模型。
112.50只大鼠适应性饲养一周后，随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组各10只。其中，除空白组外其它各组单次腹腔注射质量分数为2％的野百合碱60mg/kg(野百合碱溶于生理盐水-乙醇溶液(生理盐水：无水乙醇＝8:2))，饲养3周诱导右心衰竭模型，空白组按照体重给予0.3ml/100g的生理盐水-乙醇溶液(生理盐水：无水乙醇＝8:2)。
113.各实验组大鼠在造模3周后开始给药，每日1次，连续灌胃给药3周。其中，低剂量
组，给予55.125mg/ml的本技术的药物组合物c的水溶液，给药量为6ml/kg；中剂量组，给予110.25mg/ml的本技术的药物组合物c的水溶液，给药量为6ml/kg；高剂量组，给予220.5mg/ml的本技术的药物组合物c的水溶液，给药量为6ml/kg；空白组和模型组，每日按照体重给予6ml/kg的生理盐水。
114.从第一天开始每天监测各组大鼠体重变化，绘制体重曲线，第42天统计各组死亡情况。给药结束后检测大鼠的右心室收缩压、平均肺动脉压、右心室功能、各脏器指数以及心肌肥大情况，评价本技术药物组合物对肺动脉高压后慢性心力衰竭的治疗作用。
115.(1)右心室收缩压、平均肺动脉压检测：用3mg/kg水合氯醛麻醉各组大鼠。首先沿大鼠颈部右侧1cm处剪开皮肤，暴露右颈静脉。然后钝性分离，仔细分离出右颈静脉，结扎远心端后做v形切口，使用millar压力传感器导管以肝素钠溶液充满的聚乙烯导管(pe-50)插入静脉中，用缝合线将导管与血管稍作固定以减少出血。将导管缓慢推进，沿上腔静脉插入至右心室中，调整导管头部角度，当出现稳定的右心室收缩压波形后观察并记录右心室收缩压，使用powerlab数据采集系统记录和分析数据；旋转调整导管角度进一步进入肺动脉，记录各组大鼠平均肺动脉压。结果如图13所示。
116.从图13中可以看出，模型组大鼠的右心室收缩压和平均肺动脉压较空白组均有显著增加(n＝6,####p《0.0001,与空白组比)；给药后低剂量组大鼠的右心室收缩压和平均肺动脉压与模型组相比均有显著的改善(n＝6,*p《0.05,**p《0.01,与模型组比)，中剂量组大鼠的平均肺动脉压与模型组相比有显著的改善(n＝6,*p《0.05,与模型组比)，说明本技术的药物组合物能够显著降低心力衰竭大鼠的右心室收缩压和平均肺动脉压。
117.(2)右心室功能检测：通过小动物超声仪检测各组大鼠的肺动脉加速时间、肺动脉加速时间/肺动脉射血时间、肺动脉压力峰值及三尖瓣瓣环位移，以评估大鼠右心室功能。结果如图14所示。图14结果显示，模型组大鼠的肺动脉加速时间、肺动脉加速时间/肺动脉射血时间、肺动脉压力峰值、三尖瓣瓣环位移较空白组均有显著降低(n＝6,####p《0.0001,与空白组比)，给药后，中剂量组大鼠与模型组相比，肺动脉加速时间/肺动脉射血时间、肺动脉压力峰值、三尖瓣瓣环位移有显著的改善(n＝6,*p《0.05,与模型组比)；与模型组相比，低剂量组和高剂量组的三尖瓣瓣环位移均有显著改善(n＝6,*p《0.05,***p《0.001,与模型组比)，低剂量组和高剂量组的肺动脉加速时间、肺动脉加速时间/肺动脉射血时间、肺动脉压力峰值均有改善的趋势。表明模型组大鼠的右心功能出现衰竭，给药后本技术的药物组合物对大鼠的右心功能有显著的改善作用。
118.(3)脏器指数检测：待压力检测完毕后，开大鼠腹腔，进行腹主动脉取血，然后开大鼠腹腔胸腔，分离并取肺、心、肝、脾、肾，称重，与体重相比计算各脏器指数，结果如图15所示，结果显示，模型组大鼠的肺脏指数、肝脏指数、脾脏指数较空白组均有显著增加(n＝6,###p《0.001,####p《0.0001,与空白组比)，表明模型组大鼠出现了肺脏、肝脏和脾脏水肿。给药后，高剂量组大鼠与模型组相比，肝脏指数有显著的改善(n＝6,*p《0.05,与模型组比)，低剂量组大鼠的肺脏指数和脾脏指数有改善的趋势，肾脏无显著变化；表明本技术的药物组合物对大鼠的肝脏水肿有显著的改善作用，对肺脏水肿和脾脏水肿有一定的改善作用，对肾脏没有明显的毒副作用。
119.沿鼠心耳下缘将整个心房部分剪下，留下心室。沿室间隔边缘将右心室游离壁剪下，称量右心室游离壁重量，与左心室和室间隔的重量相比计算右心肥厚指数，以此评价右
心室肥厚程度。各组大鼠的心脏指数及右心肥厚指数结果如图15所示，可以看出，模型组大鼠的心脏指数和右心肥厚指数较空白组显著增加(n＝6,####p《0.0001,与空白组比)，即模型组大鼠出现了明显的右心肥厚；给药后，中剂量组大鼠的心脏指数较模型组相比有显著的改善(n＝6,*p《0.05,与模型组比)，中剂量组和高剂量组大鼠的右心肥厚指数较模型组相比有显著的改善(n＝6,**p《0.01,***p《0.001,与模型组比)，表明本技术的药物组合物能够显著减轻右心肥厚，从而显著改善心脏功能。
120.(4)心肌肥大情况检测：
121.取大鼠右心室游离壁，用生理盐水将余血冲洗干净，用4％的多聚甲醛固定，进行he染色，显微镜下观察图像，分析心肌细胞的肥大情况。结果如图16所示，可见模型组大鼠出现了心肌纹理紊乱及心肌细胞肥大情况；给予本技术的药物组合物后，以上症状得到明显改善，说明本技术的药物组合物能够明显改善心肌肥大，抑制心力衰竭的发展。
122.由上述结果可知，本技术药物组合物在肺动脉高压导致的右心室心力衰竭模型中，可以降低右心室收缩压、降低平均肺动脉压、改善右心室功能、减轻肝脏水肿、改善肺脏水肿和脾脏水肿、减轻右心肥厚、改善心肌肥大，进而预防和/或治疗慢性心力衰竭。
123.综上所述，本技术的药物组合物在心肌梗死或高血压引起的慢性心力衰竭模型中具有升高左室射血分数、升高短轴缩短率、改善心脏结构、改善心脏功能、改善心肌肥厚和心室扩张、改善心肌纤维化、抑制心室重塑的作用，在肺动脉高压引起的慢性心力衰竭模型中具有减轻右心肥厚、改善右心室功能的作用，可见本技术的药物组合物能够用于预防和/或治疗慢性心力衰竭。此外在lad诱导的动物模型中，本技术的药物组合物能够改善心肌肥厚和心室扩张、改善心肌纤维化；在野百合碱诱导的右心衰竭动物模型中，本技术的药物组合物能够降低右心室收缩压、降低平均肺动脉压、减轻肝脏水肿、改善肺脏水肿和脾脏水肿；可见本技术的药物组合物还能够用于治疗心肌梗死、肺动脉高压及肺动脉高压引起的并发症。
124.以上所述仅为本技术的较佳实施例，并非用于限定本技术的保护范围。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的保护范围内。