桑白皮提取物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的用途

1.本发明属于药物领域。具体地，本发明涉及桑白皮提取物，特别是桑辛素m或其药学上可接受的盐，在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的用途。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，covid-19)属于中医"疫病"范畴，湿毒疫疠之气，自口鼻而入，郁肺困脾，临床可见发热、咳嗽、乏力、大便溏泻或不爽，甚者气促。部分患者湿从热化，壅闭于肺而出现高热、喘憋等重症状态，终至正虚邪陷、内闭外脱之危候。恢复期可见气阴两虚，肺肾不足，瘀血阻络等证。新冠肺炎患者的临床表现从无症状感染、轻型、普通型、重型到危重型不等，其中重型和危重型患者多会出现其他器官衰竭，包括脑血管意外(cva)、心肌损伤和血栓事件。尤其是心肌损伤，有研究报道新冠病毒引发的心肌损伤患者的住院死亡率高达51.2％，相比之下，那些没有心肌损伤的患者死亡率只有4.5％。目前，临床上可以有效治疗新冠病毒肺炎的上市药物寥寥无几，且价格比较昂贵。所以，临床上急需有效治疗重型和危重型新冠病毒肺炎患者的廉价药物。
3.dna羟甲基化是重要的表观遗传修饰形式，在哺乳动物中，主要指胞嘧啶(cytosine，c)在特定位点5位碳原子上羟甲基化生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。dna中的5hmc是动态可逆的，由5mc通过tet酶(ten-eleven translocation enzymes)氧化形成5hmc，经tet酶进一步氧化成5-醛基胞嘧啶(5fc)等。值得注意的是，5hmc已被证明不仅仅是5mc去甲基化的中间产物，它是人类基因组中稳定的表观遗传标记，与基因转录水平正相关，在细胞发育，分化，成熟和自我更新中起着至关重要的作用。5hmc作为一种很有前景的生物标志物，与人类多种疾病的发生及发展密切相关。目前，尚未公开任何可作为新型冠状病毒肺炎药物治疗靶点的5hmc差异性标志物。
4.桑白皮(cortexmori)是桑科桑属植物桑(morusalbal)的除去栓皮的干燥根皮，性甘微苦、寒，归肺经，其功效为泻肺平喘，利水消肿。主治肺热喘咳，水饮停肺，胀满喘急，水肿，脚气，小便不利。在北京市新型冠状病毒肺炎中医药防治方案(试行第五版)中，桑白皮作为重要组分之一，出现在儿童确诊病例中医药治疗方案的疫毒蕴肺证中，用量为10g；在恢复期治疗方案的气阴两虚证中，用量为15g；在天津市新型冠状病毒感染的肺炎中医药预防方案中，桑白皮为新冠肺炎成人预防处方的重要组分之一，用量15g。但是桑白皮中治疗新冠肺炎的物质基础和具体的药理机制还尚未阐明。桑辛素m(moracin m)是桑科植物桑白皮内中的一种酚类成分，可从桑白皮中提取或人工合成获得。已有研究表明桑辛素m是磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase-4,pde4)抑制剂，抑制pde4的2种亚基pde4d与pde4b的ic
50
值分别为2.9μm与4.5μm，并具有抗炎、治疗哮喘、抗肿瘤、镇痛与抗hiv活性等功能。
5.桑白皮在已公布的新型冠状病毒肺炎的治疗方案中均以复方中的组分形式出现，桑白皮中的化学成分多达几百种，结构类型复杂多样，尚未阐明其治疗新型冠状病毒感染的有效成分的化学结构类型和作用靶点。此外，尚无研究证实桑白皮提取物可用于治疗新型冠状病毒肺炎，也无研究证实桑辛素m可用于新冠肺炎治疗。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，实现采用现代药物研究方法对天然产物进行开发利用，结合大量药效学实验筛选，提供桑白皮提取物，特别是桑辛素m或其药学上可接受的盐，在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的用途。
7.为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：
8.在第一个方面中，本发明提供了桑白皮提取物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的用途，所述药物的作用靶点是磷酸二酯酶4d(pde4d)蛋白，所述药物降低pde4d表达和/或抑制其活性。
9.作为可选方式，在上述用途中，所述新型冠状病毒肺炎为轻型和/或普通型和/或重型和/或危重型新型冠状病毒肺炎，或者所述新型冠状病毒肺炎还伴有心肌损伤、脑血管意外和/或血栓。
10.作为可选方式，在上述用途中，所述桑白皮提取物是桑白皮的醇提物、桑白皮的水提物或桑白皮的水/醇提物。
11.优选地，所述桑白皮提取物中包含桑辛素m或其药学上可接受的盐。
12.作为可选方式，在上述用途中，所述桑白皮提取物是桑辛素m或其药学上可接受的盐。
13.优选地，所述药学上可接受的盐为钾盐、钠盐、铁盐、锌盐或钙盐。
14.作为可选方式，在上述用途中，所述药物还包含其他治疗新型冠状病毒肺炎的药物。
15.优选地，所述其他治疗新型冠状病毒肺炎的药物选自
ɑ-干扰素、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔、托珠单抗、免疫球蛋白、康复者恢复期血浆或糖皮质激素中的一种或多种。
16.作为可选方式，在上述用途中，所述药物包含桑白皮提取物和药学上可接受的载体。
17.作为可选方式，在上述用途中，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂或吸入剂。
18.在第二个方面中，本发明提供了磷酸二酯酶4d(pde4d)作为治疗新型冠状病毒肺炎的药物靶点的用途。
19.作为可选方式，在上述用途中，所述新型冠状病毒肺炎为轻型和/或普通型和/或重型和/或危重型新型冠状病毒肺炎，或者所述新型冠状病毒肺炎还伴有心肌损伤、脑血管意外和/或血栓。
20.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
21.本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
22.(1)本发明首次提出，将pde4d作为治疗新型冠状病毒肺炎(尤其是重型和危重型新型冠状病毒肺炎)的药物作用靶点，通过本发明提供的药物靶点，可以为轻型、普通型、重型和危重型新冠病毒肺炎患者提供新的治疗策略。
23.(2)本发明首次发现，通过使用具有pde4d抑制作用的药物，例如，桑辛素m，可以对pde4d进行有效抑制，为轻型、普通型、重型和危重型新冠病毒肺炎患者提供新的治疗机会。
附图说明
24.图1：重型与危重型患者组对比，在危重型患者中5hmc上调差异性标志物go分析。其中，节点的大小与网络中计算出的p值成正比。5hmc上调差异性标志物主要富集在细胞趋化和中性粒细胞相关免疫信号通路。
25.图2：未发生心肌损伤与心肌损伤患者组对比，在心肌损伤患者中5hmc下调和上调差异性标志物go分析。其中，节点的大小与网络中计算出的p值成正比。5hmc下调差异性标志物主要富集在pi3k信号通路；5hmc上调差异性标志物主要富集在β-连环蛋白-转录因子(β-catenin-tcf)复杂装配-信号通路。
26.图3：pde4d在健康人、普通型、重型和危重型、未发生心肌损伤和心肌损伤患者以及康复和死亡患者中的5hmc分布箱式图。使用wilcoxon检验进行分析。结果显示：pde4d在普通型、重型、危重型患者中的分布水平逐渐升高；在心肌损伤与死亡患者中分布水平远高于未发生心肌损伤和康复患者。
具体实施方式
27.本发明人在对新型冠状病毒病理生理机制的深入研究中，通过大量筛选，首次发现磷酸二酯酶4d(pde4d)可作为治疗轻型、普通型、重型与危重型新型冠状病毒肺炎的药物靶点。此外，还意外地发现了，桑白皮提取物，特别是桑辛素m或其药学上可接受的盐，能够有效抑制pde4d表达，具有开发成治疗新型冠状病毒肺炎的药物的前景。在此基础上完成了本发明。
28.发明人此前的研究表明，cfdna的5hmc标记可以作为冠心病、急性心肌梗死、冠心病心力衰竭等人类疾病的表观遗传标志物和潜在药物治疗靶点。这些特征表明，5hmc标志物在covid-19靶向药物发现方面可能具有潜在价值。本发明通过对不同临床表现的新型冠状病毒肺炎患者及健康者的5hmc标志物进行测序及差异化分析，发现了pde4d可作为新型冠状病毒肺炎的药物靶点，尤其是可以作为重症和危重症新型冠状病毒肺炎的药物靶点，更特别是作为伴有心肌损伤的重症和危重症新型冠状病毒肺炎的药物靶点。
29.磷酸二酯酶(phosphodiesterase，pde)是一类催化水解camp和cgmp，使其转变为失去活性的单核苷酸的关键酶，pde4d为camp特异性pde，其作用为水解细胞内camp水平，pde4d可能通过其水平和活性的变化影响细胞内camp水平，进而发挥多种生物学作用。
30.如本文所用，本发明药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂或吸入剂。优选地，本发明的剂型为片剂或胶囊剂。
31.如本文所用，本发明的“药学上可接受的载体”是指药物制剂领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、色素、矫味剂、溶剂、表面活性剂中的一种或几种。
32.本发明所述填充剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述助悬剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
33.优选地，可以将本发明的药物制成各种固体口服制剂、液体口服制剂等。药剂学可接受的口服剂固体制剂有：普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂等。或者，也可以将本发明的药物制成注射剂或吸入剂。
34.上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。
35.如本文所用，本发明的“桑白皮提取物”，特别是“桑辛素m”可以采用生物提纯方法从含有该活性成分的桑白皮等植物中提取分离得到，也可以购自市售产品。
36.在上文所述的医药用途中，对于“桑白皮提取物”(特别是“桑辛素m”)的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。
37.为了更好地理解本发明的实质，在下文实施例部分用体外和体内药效学实验及其结果来进一步说明本发明药物在制药领域中的新用途。
38.下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
39.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
40.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
41.在本发明的实施例中，采用5hmc-seal高通量测序法对样本进行测序，对以下实施例所采用的5hmc-seal高通量测序法解释如下：
42.5hmc-seal是一种基于5hmc的高通量测序方法。这种方法以改进后的化学糖基化标记为基础，结合二代高通量测序技术，得到5hmc在基因组dna上的分布信息。
43.由于化学标记法的高度灵敏特性，输入的dna可以低至1-10ng，所述的dna可以是打碎后的基因组dna，也可以是cfdna等小片段，按照二代测序的要求，在dna片段两端进行补平，之后在3’端连接上一个a尾，借由at特异性连接在每个dna片段两端连上测序y形接头，其中包含了区分样品的index信息和扩增引物等序列。之后，进入5hmc的标记步骤，先加入udp-6-n3-glc，在特定条件下，使dna上的5hmc都反应变为n3-5ghmc，再加入dbco-peg4-生物素，使n3-5ghmc都连上生物素，最后通过生物素-磁珠高效的特异性结合，筛选得到所有的包含5hmc位点的dna片段，经过pcr扩增、纯化之后完成基于5hmc的dna文库构建；通过fragment analyzer质控分析每个样品的dna条带大小和分布，通过qpcr对文库进行精确定量后，用illumina公司nextseq 500测序仪进行高通量测序，得到文库中所有dna片段的碱基序列。
44.实施例1：
45.203例新冠病毒肺炎患者和53例健康人，其中，203名新冠病毒肺炎患者包括普通型患者66例，重型99例，危重型38例(重型和危重型患者发生心肌损伤40例，死亡14例)。取上述256名受试者的外周血样品(8ml)，并分离血浆(3-4ml)，从血浆中提取cfdna进行5hmc-seal高通量测序，每个样品的测序通量为1.5gb，测序条带大小为75bp。具体步骤如下：
46.(1)样本收集：
47.在患者入院确诊时(来自武汉同济医院、武汉肺科医院和武汉中心医院)，共收集
203例新冠病毒肺炎患者血液各8ml，并于24小时之内进行血浆分离操作，收集患者血浆样品。另外，收集53名健康者的血液并在24小时之内进行血浆分离，收集血浆样品。具体步骤包括：首先进行第一次离心，1350g、4℃低温离心12min，小心取出淡黄色上清，转移至2ml无dnase无菌ep管中，避免污染白细胞层。然后，进行第二次离心，1350g、4℃低温离心5min；小心取出上清，转移至2ml无dnase无菌ep管中，再次除去残留红细胞。第三步，离心，13500g、4℃低温离心5min；小心取出上清，转移至2ml无dnase无菌离心管中，获得约4ml左右的血浆，将获得的血浆贴好标签后冻存于-80℃冰箱待用。
48.(2)抽提血浆dna：
49.利用quick-cfdna血清和血浆试剂盒(zymo)试剂盒，从来自步骤(1)制备得到的血浆样品中分别抽提8-10ng血浆cfdna。
50.(3)将cfdna进行末端补齐并与测序接头连接：
51.根据kapa hyperplus文库制备试剂盒说明书制备含有20μlcfdna、2.8μl末端修复&a尾缓冲液和1.2μl末端修复&a尾酶混合物的反应混合液(总体积为24μl)，在20℃温浴30分钟，然后在65℃温浴30分钟。然后在0.5ml低吸附ep管中配置以下连接反应混合物：2μl无核酸酶水，12μl连接缓冲液以及4μl dna连接酶。向18μl连接反应混合物中加入2μl的测序接头，混合，加入至24μl反应样本中，于20℃加热4小时。使用dna clean&concentrator 5(zymo)纯化试剂盒对反应产物进行纯化，用20μl洗脱缓冲液进行洗脱获得最终的dna连接样品。
52.(4)5hmc标记：
53.制备总体积为4μl的标记反应混合液：1μl 50μm udp-n3-glu、1μlβgt酶(neb)和2μl hepes缓冲液(ph8.0，终浓度为50mm)，将4μl标记混合液加入至20μl dna连接样本中。将混合液在37℃水浴2小时。取出混合液，用dna clean&concentrator 5(zymo)纯化试剂盒对反应产物进行纯化，获得纯化的30μl dna。然后在上述纯化的30μl dna中加入1μldbco-peg4-生物素(click chemistry tools)，于37℃水浴1小时，接着用dna clean&concentrator 5(zymo)纯化试剂盒对反应产物进行纯化，获得30μl纯化的标记产物。
54.(5)5hmc富集：
55.首先，按以下步骤准备结合磁珠：取出2.5μldynabeads(invitrogen)并加入100μl洗涤缓冲液(5mm tris(ph7.5)、1m nacl和0.02％吐温20)，吹打混匀，放置于1.5ml磁力架上，重复用100μl洗涤缓冲液洗涤结合磁珠3次，最后加入32μl结合缓冲液(10mm tris(ph7.5)、2m nacl和0.04％吐温20)，并混合均匀。然后，在磁珠混合液中加入上述步骤获得的纯化的标记产物，并在旋转混合器中混合30min使其充分结合。最后，用100μl洗涤液(5mm tris(ph7.5)、1m nacl和0.02％吐温20)洗涤磁珠5次，离心去掉上清液，加入23.8μl无rnase水。
56.(6)pcr扩增：
57.向上述步骤的最终体系中加入25μl 2
×
pcr master mix和1.25μl pcr引物(总体积为50μl)，按照表1所述pcr反应循环的温度和条件进行扩增：
58.表1：pcr反应循环的温度和条件
[0059][0060]
将扩增产物用ampurexp小珠纯化，得到最终5hmc文库，并用qubit 3.0进行文库浓度测定。
[0061]
(7)对5hmc文库质控后进行高通量测序：
[0062]
将获得的5hmc文库进行fragment analyzer
tm
全自动毛细管电泳系统质控，确定文库中dna片段大小以及是否含有杂质；通过qpcr进行浓度测定。将通过质检的测序文库以相同浓度混合，用illumina nextseq500进行测序，使用的测序试剂盒是high output kit v2(75个循环)，每个样品的测序通量为1.5gb，测序条带大小为75bp。
[0063]
(8)原始测序数据比对：
[0064]
每个原始测序fastq数据先用trimmomatic软件进行低质量数据修剪，再用bowtie2软件比对到人基因组hg19上，使用macs软件进行包含5hmc的读数峰识别，参数为：effective genome size(有效基因组大小)＝2.72e 09；tag size(标签大小)＝38；bandwidth(带宽)＝100；model fold(模型倍数)＝10；p value cutoff(p值的临界值)＝1.00e-05。对比健康人和新冠患者血浆cfdna的峰信息，进行过滤，条件为每个峰至少在10个样品中出现，以此进行call peaks(峰富集)，生成counts(计数)文件；用deseq2软件比对来自不同样本的counts(计数)文件，找到的reads(读长)数大于50的5hmc峰区域，按|log2foldchange|》＝1，p值《0.01，分别筛选出5hmc上下调的差异性生物标志物。进一步的，利用cytoscape软件(版本3.7.2)的cluego(版本2.5.5)和cluepedia(版本1.5.5)插件分别对5hmc上下调的差异性生物标志物进行go分析(使用的参数：medium network specificity(中等网络特异度)，bonferroni step down pv correction(bonferroni多重检验校正法)，two-sidedhypergeometric test(双侧超几何检验))，发现与新冠肺炎发展密切的信号通路，从而确定潜在药物靶点。
[0065]
实施例2：
[0066]
随机抽取实施例1中的38例重型患者的counts(计数)数据与38例危重型患者的counts(计数)数据进行差异性分析，按|log2foldchange|》＝1，p值《0.01筛选出5hmc差异性标志物。进一步的，利用cytoscape软件进行go分析，在5hmc上调标志物的go分析结果里发现与新冠肺炎密切相关的信号通路，例如，细胞趋化和中性粒细胞相关免疫信号通路，其中5hmc上调标志物pde4d在这些信号通路中扮演重要角色(参见图1)。
[0067]
实施例3：
[0068]
从实施例1中的99例重型患者和38例危重型患者中随机抽取40例未发生心肌损伤患者的counts(计数)数据与40例发生心肌损伤患者的counts(计数)数据进行差异性分析，按|log2foldchange|》＝1，p值《0.01筛选出5hmc下调和上调差异性标志物。进一步的，利用
cytoscape软件进行go分析，再次发现5hmc上调标志物pde4d(参见图2)。
[0069]
实施例4：
[0070]
将实施例2和3中发现的5hmc差异性标志物pde4d(上调)在256例患者中的5hmc的分布水平进行验证。利用256例患者的counts(计数)数据进行标准化处理，探究5hmc差异性标志物pde4d在健康人，普通型重型和危重型新冠患者，未发生心肌损伤和心肌损伤患者以及康复和死亡患者中的分布水平，pde4d的分布水平的检测结果如图3所示，这些结果进一步证明pde4d与新冠病毒肺炎患者疾病的严重程度息息相关，是其潜在药物治疗的靶点。
[0071]
实施例5：
[0072]
桑白皮为桑科植物桑除去栓皮的根皮，其功效为泻肺平喘，利水消肿。主治肺热喘咳，水饮停肺，胀满喘急，水肿，脚气，小便不利。并已在北京与天津市新型冠状病毒肺炎中医药防治方案中作为组方成分使用。
[0073]
已有研究表明，桑辛素m为桑科植物桑白皮内中的一种酚类成分，其作为磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase-4,pde4)抑制剂，抑制pde4的2种亚基pde4d与pde4b的ic
50
值分别为2.9μm与4.5μm，并具有抗炎、治疗哮喘、抗肿瘤、镇痛与抗hiv活性等功能。
[0074]
在本实施例中，接种sars-cov-2病毒于10只hace2转基因小鼠，同时接种小鼠肝炎病毒于10只干扰素α受体抗体基因缺陷小鼠。将上述2组小鼠，分别随机分为abc三组。a组给予桑辛素m，b组给予桑白皮提取物，c组以等体积pbs作为对照组。每天观察并记录各组小鼠的健康状况和体重。分别于0、1、3、5、7天，收集小鼠外周血、肺组织与骨髓。肺组织he染色与病理评分对药物疗效进行评估。qrt-pcr检测分析小鼠肺部病毒载量。流式细胞术检测小鼠肺、血液和骨髓中的中性粒细胞。qrt-pcr方法检测分析小鼠外周血中b细胞标记基因cd19的表达。
[0075]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。