ɑ的制作方法

ɑ-葡聚糖的制备方法
技术领域
1.本发明属于生物发酵工程及膳食纤维技术领域，特别涉及一种低分子量
ɑ-葡聚糖的制备方法。


背景技术：

2.随着人类肥胖症和三高症状“高血脂、高血压、高血糖”的普遍存在，为了顺应现代食品科技发展的方向并满足消费者的健康需求,低血糖指数、低热量的功能性碳水化合物已成为二十一世纪健康食品的发展潮流，功能性多糖日益成为人们关注的焦点。葡聚糖是一种乳酸菌胞外多糖，是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的有特殊结构的低聚多糖，因其良好的低酸、高热稳定性，抗消化性，低血糖指数，低胰岛素指数，热量低以及防止龋齿等益生元特性，可以促进肠道益生菌的生长，维持肠道内微生物平衡, 是一种功能性多糖类碳水化合物。
3.微生物发酵生产低聚多糖生产成本低，不受季节和区域环境条件限制，微生物发酵法对低聚多糖工业化生产具有深远的意义，肠膜明串珠菌 (leuconostocmesenteroides)是被美国fda和aafco于1989年列为可以直接食(饲 )用的42种安全微生物之一。我国卫生部也于 2012年将肠膜明串珠菌列入了《可用于食品的菌种名单》，肠膜明串珠菌生长代谢过程中，产生葡聚糖蔗糖酶到细胞外，利用廉价的、环保的蔗糖作为供体，通过葡聚糖蔗糖酶的葡糖基化反应使蔗糖的果糖基和葡萄糖基部分发生聚合生成主链由
ɑ-（1，6）糖苷键构成、支链以
ɑ-（1，2）、
ɑ-（1，3）
ɑ-（1，4）糖苷键连结的
ɑ-葡聚糖，分子量分布由数万到数百万，呈胶粘状。
4.ɑ-葡聚糖酶可以切断
ɑ-葡聚糖的糖苷键从而降低葡聚糖分子量，制造低分子量的
ɑ-葡聚糖，降低粘度的同时，增加可使用性，这种低分子量的
ɑ-葡聚糖实际上是一种多聚糖，因
ɑ-葡聚糖酶只对
ɑ-（1，6）糖苷键有专一性，而不会裂解其他的糖苷键，酶解后的低分子
ɑ-葡聚糖中仍夹杂着不同程度的
ɑ-（1，2）、
ɑ-（1，3）
ɑ-（1，4）糖苷键形成的分支结构，就是这些特殊的分子结构，使其具有了消化耐受性、免疫抗癌性、预防高血压、动脉硬化，有助于减肥，控制
ɑ-葡聚糖的分子量在5000d以下，产物易溶于冷水，成为一种优质的新型的膳食纤维食品原料，可以作为低升糖甜味剂和益生元使用。
5.正常情况下，肠膜明串珠菌发酵产生
ɑ-葡聚糖会带来发酵液粘度增加，使反应速率逐渐降低，我们将
ɑ-葡聚糖酶分解反应与生物发酵合成过程几乎同时在发酵反应罐中进行，便可降低发酵反应液粘度，同时降低发酵液中高分子
ɑ-葡聚糖的浓度，促使反应可不断的朝正向进行，加快蔗糖转化速率，提高产物产量。
6.反应产生的副产物果糖留存于发酵液中。在发酵液的后处理中，采用色谱分离将果糖分离出来进一步利用制作果聚糖。


技术实现要素：

7.本发明的首要目的在于提供一种
ɑ-葡聚糖膳食纤维的制备方法。
8.本发明利用肠膜明串珠菌对蔗糖的代谢和转化作用生成
ɑ-葡聚糖，同时在反应过程中合适的时间点加入
ɑ-葡聚糖酶，使得
ɑ-葡聚糖的生成反应和降解反应同时进行，通过酶的作用降解高分子量、高粘度产物
ɑ-葡聚糖，使得反应顺利向正向进行，通过对肠膜明串珠菌的优选，发酵、酶解反应条件的优化进一步的提高原料底物的利用率、改良产物的膳食纤维特性。
9.本发明所采取的技术方案是：一种
ɑ-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：（1）一种肠膜明串珠菌，可以以蔗糖为主要成分的白沙糖、苷蔗原糖、蔗糖浆为主要生长代谢营养源产生葡聚糖蔗糖酶胞外酶并进一步裂解蔗糖生成果糖基和葡萄糖基，再重新聚合生成以
ɑ-（1，6）糖苷键为主链、支链上连接着
ɑ-（1，2）、
ɑ-（1，3）
ɑ-（1，4）糖苷键的
ɑ-葡聚糖。
10.（2）上述聚合反应进行到一定的时候，加入
ɑ-葡聚糖酶切断
ɑ-葡聚糖的糖苷键从而降低葡聚糖分子量，制造低分子量的
ɑ-葡聚糖膳食纤维。
11.（3）通过控制
ɑ-葡聚糖酶的加入时间、添加量及反应时间达到控制反应液中
ɑ-葡聚糖分子量的目的。
12.（4）反应液经过过滤、离子交换过程的初步处理后，进一步用色谱分离来将小于500d小分子
ɑ-葡聚糖和大于5000d的大分子
ɑ-葡聚糖去除，最终产物95%以上为500-5000d分了量的符合特殊功能要求的
ɑ-葡聚糖膳食纤维产品。
13.进一步的，步骤（1）所述的产葡聚糖蔗糖酶的菌种优选为肠膜明串珠菌cicc一23614、肠膜明串珠菌lm-1226、肠膜明串珠菌lm-0326、肠膜明串珠菌lm一31208，活化后以10%种子液接种到5l发酵罐中。
14.进一步的，考虑到生产成本，充分还原菌种的自然生长属性及对营养的全面要求，步骤（1）所述发酵液碳源为白砂糖、苷蔗原糖、甘蔗汁，加量为10%、15%、18%、20%、25%、30%，浓度均以蔗糖计；氮源为胰蛋白胨、酵母粉及其1：1混合物，加量为：0.3%。
15.进一步的步骤（1）所述的发酵液初始ph为：6.8-7.0，用碳酸内调节；步骤（1）所述的发酵液温度为：25-28℃。
16.进一步的，步骤（2）、步骤（3）所述的添加
ɑ-葡聚糖酶的时间为5-30小时，加量为发酵液总量的万分之一。
17.进一步的，步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）所述的总反应时间为20-40小时，控制反应液中产物分子量95%以上控制在10000d以内。
18.进一步的，步骤（4）所述的通过色谱分离，控制最终产物90%以上在500-5000d以内。
19.发明效果本发明利用肠膜明串珠菌对蔗糖的代谢和转化作用生成
ɑ-葡聚糖，同时在反应过程中合适的时间点加入
ɑ-葡聚糖酶，使得
ɑ-葡聚糖的生成反应和降解反应同时进行，通过对肠膜明串珠菌的优选，发酵、酶解反应条件的优化使得发酵液中蔗糖转化率达到90%以上，产品分子结构中
ɑ-（1，6）糖甘键占比达80%以上，最终通过脱色过滤、离子交换、色谱分离等后处理措施，得到目标分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖膳食纤维产品，
ɑ-葡聚糖膳食纤维产品抗消化性指标与慢消化性指标总和达到90%以上，后处理综合得率90%以上，这种通过
肠膜明串珠菌乳酸菌属对含蔗糖原料发酵、结合酶解的生物工程新技术生产新型的膳食纤维食品原料的方法，原料来源广泛、价格低廉，生产工艺易于掌握、产品质量稳定可控。
20.附图说明：图1为实施例14（发酵5小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus）产品分子量分布图；图2为实施例15（发酵10小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus）分子量分布图；图3为实施例16（发酵15小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus）分子量分布图；图4为实施例17（发酵20小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus）分子量分布图；图5为实施例18（发酵25小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus）分子量分布图；图6为实施例19（发酵30小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus）分子量分布图；图7为产品糖苷键特征图 ；在图7中，糖甘键
ɑ-（1，2）1.60%，糖甘键
ɑ-（1，3）0.66%，糖甘键
ɑ-（1，4）8.13%，糖甘键
ɑ-（1，6）80.13%；糖甘键
ɑ-（1，2）3.34%，糖甘键
ɑ-（1，3）2.98%，糖甘键
ɑ-（1，4）0.27%，糖甘键
ɑ-（1，6）82.15%。
21.具体实施方式：实施例1（1）将肠膜明串珠菌cicc一23614冻干菌种经2次斜面转接、再经1次液体种子培养活化后，以10%接种量转接到5l液体发酵罐(液体发酵培养基ⅰ）中,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留，计算蔗糖转化率；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
22.实施例2（1）将肠膜明串珠菌肠膜明串珠菌lm-0326冻干菌种）经2次斜面转接、再经1次液体种子培养活化后，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅰ）,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留，计算蔗糖转化率；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
23.实施例3（1）将肠膜明串珠菌肠膜明串珠菌lm一31208冻干菌种经2次斜面转接、再经1次液体种子培养活化后，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅰ）,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留，计算蔗糖转化率；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
24.实施例4（1）将肠膜明串珠菌lm-1226冻干菌种经2次斜面转接、再经1次液体种子培养活化后，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅰ）,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留，计算蔗糖转化率；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
25.实施例5（1）将肠膜明串珠菌cicc一23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），以白砂糖作碳源（蔗糖浓度18%）,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
26.实施例6（1）将肠膜明串珠菌cicc一23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），以甘蔗原糖作碳源（蔗糖浓度18%）,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
27.实施例7（1）将肠膜明串珠菌cicc一 23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），以甘蔗汁作碳源（蔗糖浓度18%）,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
28.实施例8（1）将肠膜明串珠菌cicc一 23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），甘蔗汁中蔗糖浓度10%,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l，继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、
色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
29.实施例9（1）将肠膜明串珠菌cicc一23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），甘蔗汁中蔗糖浓度15%,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l，继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
30.实施例10（1）将肠膜明串珠菌cicc一23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），蔗糖汁中蔗糖浓度18%,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l，继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
31.实施例11（1）将肠膜明串珠菌cicc一 23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），蔗糖汁中蔗糖浓度20%,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l，继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
32.实施例12（1）将肠膜明串珠菌cicc一 23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），蔗糖汁中蔗糖浓度25%,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l，继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
33.实施例13（1）将肠膜明串珠菌cicc一 23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），蔗糖汁蔗糖浓度30%,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养15小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l，继续反应,加入量为发酵液总量的万分之一，每隔30min取样检测发酵液分子量分布；
l,每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
39.实施例19（1）将肠膜明串珠菌cicc一23614已活化的种子培养液，以10%接种量转接到5l液体发酵罐中（液体发酵培养基ⅱ），以20%蔗糖浓度的甘蔗汁作碳源,28℃发酵培养，每隔5小时取样检测蔗糖残留；（2）发酵培养30小时后，加入发酵液总量万分之一的
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l,每隔30min取样检测发酵液分子量分布；（3）当反应液产物分子量90%以上控制在10000d以内时终止反应，过滤、离子交换、色谱分离、浓缩或喷雾干燥制成分子量500-5000d的
ɑ-葡聚糖浆或糖粉。
40.如表四和图1、图2、图3、图4、图5、图6所示分子量分布情况以及抗消化性数据来看，以发酵15-20 小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l为最佳，发酵15小时至20小时后加入
ɑ-葡聚糖酶dextranase plus l的终产品分子量分布在1000-3000d之间，发酵5小时、10小时后加
ɑ-葡聚糖酶的产物中小分子量成分偏多，后处理收得率偏低，发酵25小时、30小时后加入
ɑ-葡聚糖酶的产物中较高分子量成分偏高，后处理难度较大、收得率也偏低。
41.上述实施例终产品，抗消化性含量能稳定达到82%-95%之间，产品白度达到70以上，产品不易吸湿。
42.上述实施例分析及检测方法及图表示例。
43.一、检测方法：（一）蔗糖转化率的计算：1、蔗糖残留的测定：利用高效液相色谱对发酵液中残留蔗糖进行定量分析计算。
[0044] 分析条件：检测器：岛津rid-10a;分析柱：shodex ks803;柱温：50℃；流速：1.0ml/min;流动相：超纯水。
[0045]
2、蔗糖转化率%=蔗糖残留/加入培养基的蔗糖
×
100%（二）消化性含量检测方法采用megazyme公司产的套酶，参照englyst提出的步骤分析样品的消化性，具体步骤如下：1.酶的制备酶a：猪胰α淀粉酶（型号为p7545）取四个50ml离心管，各加3g酶和20ml水，加磁子磁力搅拌10分钟后(需要充分溶解，可根据需要延长时间)，在4300r/min下离心10分钟，每管中取出上清液13.5ml混合得54ml酶a；酶b：淀粉葡萄糖苷酶（型号为a7095）取3.15ml酶b和3.6ml水混合，从中取6ml酶b；酶解液：将所取的54ml酶a和6ml的酶b混合后，再加4ml蒸馏水，冷藏备用。
[0046]
2.配制缓冲液
1)溶解13.6g ch3coona
·
3h2o于蒸馏水中，并定容至1l；2)用0.1mol/l的醋酸将步骤1）溶液调ph至5.2（无水醋酸的浓度是17.5mol/l）；3)每升缓冲液中添加4ml的1mol/lcacl2(分子质量111)；4)若需要保存更久，需加防腐剂。
[0047]
3.消化性测试1)取0.6g样品（干基干重）于50ml离心管中，另设空白对照；2)加入20ml缓冲液，涡旋混匀；3)沸水浴30 分钟, 在水浴过程中要不断振荡，再置于37℃水浴锅中进行冷却；4)离心管中放5颗玻璃珠后，将离心管竖直放置；5)在离心管中加入5ml混合酶液后震荡混匀，将离心管水平固定放置在恒温水浴振荡器中（37℃，160 stroke/min）振荡；6)反应20分钟后，各取0.25ml反应液，加入10ml 66%的乙醇，在4300r/min离心5分钟。取0.1ml上清液，加3mlgopod（试剂盒），于50℃水浴20分钟，于510nm处测试吸光值。同时取0.1ml的1mg/ml的葡萄糖标液，加3ml gopod（试剂盒），于50℃水浴20分钟，于510nm处测试吸光值。反应120分钟后，取0.25ml反应液，加入10mll 66%的乙醇，在4300r/min离心5分钟。取0.1ml上清液，加3mlgopod（试剂盒），于50℃水浴20分钟，于510nm处测试吸光值。同时取0.1ml的1mg/ml的葡萄糖标液，加3mlgopod（试剂盒），于50℃水浴20分钟，于510nm处测试吸光值。
[0048]
at=测试溶液的吸光值vt=测试溶液的总体积c=标准浓度（mg 葡萄糖/ml）=1as=标准葡萄糖的吸光值wt=样品的重量d=稀释倍数=40rds = (g20
–
fg)
ꢀ×
0.9sds = (g120
–
g20)
ꢀ×
0.9rs = ts
–
(rds sds) = ts
–
(g120
×
0.9)rds=快消化含量sds=慢消化淀粉含量rs=抗消化性含量fg=初始葡萄糖含量（以0计算）ts=总淀粉（三）白度检测：实验仪器：白度检测用wsb-1数显白度仪（杭州齐威仪器有限公司）（四）
ɑ-葡聚糖的分支度检测（产品糖苷键特征），核磁氢谱测定方法:氢谱测定仪器名字:600m超导核磁共振波谱仪称取一定量的样品溶于氘代水中，配置成4%样品，然后在常温下，测定样品氢谱。
[0049]
（五）分子量的测定方法：用hplc对样品分子量进行测定，色谱柱为shodex ks-803(8.0 mm
×
300 mm)，检测
器为示差检测器。样品配制成2 mg/ml的溶液，过0.45 μm的膜，以超纯水为流动相，进样量20 μl，流速为0.8 ml/min，柱温70℃，检测器温度为50℃。
[0050]
二、附表图例：附表一：附表二：附表三：附表四
ꢀ
如实施例16、实施例17，抗消化性含量能稳定达到82%-90%之间，产品白度达到70以上，产品不易吸湿。
[0051]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。