氢化镁在制备防治肾结晶结石病的药物中的应用

1.本发明涉及防治肾结晶结石药物技术领域，尤其涉及氢化镁在制备防治肾结晶结石药物中的应用及相关药物组合物。


背景技术：

2.肾结石作为泌尿系统的常见疾病，在全球范围广泛分布，给国家带来了沉重的经济和医疗负担，尤以亚洲为甚，我国的患病率高达4.87-10％以上，且呈逐年增高趋势，随着外科技术发展，肾结石治疗手段日渐丰富(如体外震波碎石、经皮肾镜取石等)，但是，复发率仍居高不下，有统计显示五年复发率超过50％，目前仍无预防结石生成和复发的有效方法。
3.氢作为自然界最简单和最丰富的元素，自日本科学家发现氢气可通过选择性抗氧化治疗疾病后，氢气在各个领域得到广泛的关注和研究，且发现氢气在多种疾病模型和人类疾病中显示出预防和治疗效果，氢气通过直接或间接的作用发挥其选择性抗氧化作用，清除体内有害的自由基减轻机体损伤是目前认为氢气发挥作用的最主要形式。但在氢气摄入方式上，无论是吸入氢气还是饮入富氢水，都有一定的局限性，因此，固态氢载体的生物学效应，成为氢医学的热点。氢化镁(magnesium hydride，mgh2)是一种新型高效的镁基储氢材料，具有释放氢气量大，副产物mg(oh)2对人体没有危害等优点。1克氢化镁可以产生1729毫升氢气，水解缓慢释放氢气，持续时间长，这些特点使氢化镁成为一种理想的生物供氢材料。2016年kamimura n首次将氢化镁用于生物学研究，研究结果提示氢化镁能够改善喂食高脂饮食的野生型小鼠血浆甘油三酯水平，并延长它们的平均寿命。最新一项关于氢化镁的研究来自于韩国，研究结果提示，氢化镁通过保护海马神经元来预防血管性痴呆的发生。


技术实现要素：

4.为了克服上述技术缺陷，本发明的第一个方面提供氢化镁在制备防治肾结晶结石病的药物中的应用。
5.本发明所述的肾结晶结石病具体是指肾结晶病和肾结石病；
6.本发明所述的防治是指预防或治疗，其中预防是指预防肾结晶转化为肾结石病。
7.进一步地，所述的药物是以氢化镁作为唯一活性成份，或者包含氢化镁的药物组合物。
8.进一步地，所述的药物中氢化镁的含量为0.1-99wt％。优选为0.5-10wt％。
9.进一步地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
10.进一步地，所述药学上可接受的辅料选自玉米油、甘油、丙二醇、水中的任一种或两种以上。
11.进一步地，所述的药物为口服制剂或注射制剂。
12.本发明的第二个方面提供一种用于防治肾结晶结石病的口服制剂，包括氢化镁和
药学上可接受的辅料。优选地，所述药学上可接受的辅料为溶媒剂，优选地，所述溶媒剂为油脂，优选地，所述油脂为玉米油。优选地，所述溶媒剂还可以为甘油、丙二醇、或水等。
13.以上所述的药学上可接受的辅料是指药学领域常规的药物辅料，其中，稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙或碳酸氢钠；也可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和/或甜味剂。
14.所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将氢化镁作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成各种剂型。可以按剂型通过口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、淋巴结内注射、粘膜用药等途径应用于需要治疗的个体。个体可以是人或动物。剂量一般为1～1000mg/公斤体重/天，具体可根据个体的年龄、病情等进行变化。当用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将其制备成注射液。在各种制剂中，氢化镁活性成分的重量含量为0.1％～99％，优选的重量含量为0.5-10wt％。
15.采用了上述技术方案后，与现有技术相比，具有以下有益效果：
16.本发明首次披露氢化镁在制备防治肾结晶结石病的药物中的应用，氢化镁作为全新的治疗手段在结晶肾损伤中的应用潜力巨大，对其疗效评价的研究具有重要意义和广泛的临床应用前景。
附图说明
17.图1为不同浓度的氢化镁玉米油制剂。12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml浓度的氢化镁玉米油制剂在静置60分钟后肉眼下的性状表现；
18.图2为氢化镁改善乙醛酸盐诱导结晶肾小鼠模型肾组织损害的剂量效应。con组为腹腔注射等剂量的生理盐水5天，gly组腹腔注射乙醛酸盐5天，gly mh50组、gly mh100组、gly mh200组、gly mh400组为提前2天分别给予mgh
2 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg灌胃，2天后继续给予乙醛酸盐腹腔注射5天，两药间隔时间4-6小时，放大倍数：200倍；
19.图3为氢化镁改善肾小管损伤程度。con组为腹腔注射等剂量的生理盐水5天，gly组腹腔注射乙醛酸盐5天，gh组提前2天予mgh
2 200mg/kg灌胃，后续乙醛酸盐腹腔注射5天，两药间隔4-6小时，goh组提前2天予mg(oh)2灌胃，2天后继续给予乙醛酸盐腹腔注射5天，两药间隔时间4-6小时；gv组提前2天予玉米油灌胃，2天后继续给予乙醛酸盐腹腔注射5天，两者间隔时间4-6小时。图3为五组小鼠肾组织h&e、vonkossa、masson染色，放大倍数：200倍；
20.图4为氢化镁保护结晶肾损伤小鼠的肾功能，*p《0.05(相对于con组)，#p《0.05(相对于gly组)；
21.图5为氢化镁降低结晶肾损伤小鼠炎症水平，*p《0.05(相对于con组)，#p《0.05(相对于gly组)；
22.图6为氢化镁改善结晶肾损伤小鼠肾组织氧化应激和脂质过氧化水平，*p《0.05(相对于con组)，#p《0.05(相对于gly组)；
23.图7为氢化镁改善结晶肾损伤小鼠肾小管细胞凋亡情况。分组及给药剂量同图3，图7是五组小鼠肾组织反应细胞凋亡情况的tunel染色，染红色箭头所指凋亡细胞，放大倍数400倍。
具体实施方式
24.以下结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的优点。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
25.(一)氢化镁玉米油制剂的制备与应用
26.试验方法：将氢化镁(购自武汉克米克生物医药技术有限公司)加入到实验用玉米油(根据实验需求还可使用甘油、丙二醇、水等其他试剂作为氢化镁的药物载体)中，根据实验需要配置12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml浓度的氢化镁玉米油制剂。将制剂充分斡旋震荡后，进一步使用超声让氢化镁均匀分布在玉米油中。氢化镁玉米油制剂要求现配现用，如果使用含水试剂作为氢化镁载体，要求制备后立即在短时间内完成给药。
27.试验结果：制备后的氢化镁玉米油制剂在常温常压下能够保持相对长时间的物理化学性质稳定，能够保证动物给药的均一性和稳定性，不同浓度的氢化镁玉米油制剂见图1，由图1可知，无论是静置前还是静置60分钟后的不同浓度的氢化镁玉米油制剂均呈现为状态均一的悬浊液；其中，静置前的低浓度(当12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml时)氢化镁玉米油制剂为浅黄色的均一悬浊液，随着浓度的提高，浅黄色逐渐变淡，当浓度增加到100mg/ml时，氢化镁玉米油制剂呈现为乳白色的悬浊液；静置60分钟后的氢化镁玉米油制剂的颜色和悬浊液状态几乎没有改变，说明氢化镁玉米油制剂的物理化学性质稳定。同时玉米油保护的氢化镁进入体内后能够减缓其水解反应，防止氢化镁在胃液强酸环境快速反应，从而延长氢化镁体内释氢的时间。
28.(二)氢化镁治疗结晶肾损伤的剂量效应关系
29.试验方法：利用乙醛酸盐腹腔注射(100mg/kg，腹腔注射5天)的方式构建c57bl/6小鼠的结晶肾损伤模型，con组为腹腔注射等剂量的生理盐水5天，gly组腹腔注射乙醛酸盐5天，gly mh50组、gly mh100组、gly mh200组、gly mh400组为提前2天分别给予mgh
2 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg灌胃。提前2天分别使用50、100、200、400mg/kg剂量的mgh2灌胃治疗，2天后继续给予乙醛酸盐腹腔注射5天，两次给予乙醛酸盐腹腔注射的给药时间间隔4-6小时。小鼠接受乙醛酸盐腹腔注射5天后，取各组小鼠肾组织并用多聚甲醛固定，经过脱水、包埋、切片等步骤后，对肾组织石蜡切片进行“h&e”染色，“masson”染色和“vonkossa”染色，利用显微镜观察h&e染色切片确定肾组织损伤情况，观察masson染色切片确定肾组织纤维化程度，观察vonkossa染色切片确定肾草酸钙结石情况，以及进一步利用偏正光(polarized light)显微镜观察h&e染色切片确定肾脏结晶结石情况。
30.试验结果：小鼠模型接受乙醛酸盐腹腔注射5天后的肾组织损害的剂量效应见图2(放大倍数：200倍)，由图2可见，h&e染色提示模型小鼠肾组织可见片状的小管急性损伤，表现为肾小管刷状缘脱落，上皮细胞扁平，管腔囊性扩张，间质见灶性炎细胞浸润，使用不同剂量的氢化镁治疗后，均提示上述肾小管急性损伤的病理表现有所缓解，同时存在剂量效应关系，氢化镁的剂量越大肾损伤程度越轻，gly mh200和gly mh400组效果最好，且治疗效果无明显差异；masson染色见模型小鼠肾间质中蓝染的胶原纤维沉积明显增加，提示肾脏纤维化明显，治疗组的肾脏纤维化均有所减轻，gly mh200和gly mh400效果更为明显；vonkossa染色见模型小鼠肾小管管腔内大量黑色的晶体沉积，堵塞管腔，部分间质内也可见黑色晶体浸润，晶体密集处中等量炎细胞浸润，治疗组中gly mh50组晶体沉积没有明显改善，gly mh100组晶体沉积明显减少，gly mh200和gly mh400组几乎未见黑色的晶体染
色；h&e染色切片偏振光下晶体呈双折光，说明该实验草酸钙动物模型诱导成功，所形成的结晶/结石成分为草酸钙，在治疗组中，随着给药剂量的增加，双折光晶体显著减少。综合以上实验结果发现，氢化镁能够显著减轻结晶结石诱导的肾小管损伤，抑制肾结晶结石的形成，改善肾脏纤维化程度，同时随着氢化镁剂量的增加，其肾保护作用越强，当剂量大于200mg/kg小鼠体重时，其疗效与200mg/kg的剂量没有明显差异，因此在后续实验中确定小鼠体内氢化镁的给药剂量为200mg/kg小鼠体重。
31.(三)氢化镁改善小鼠肾小管的损伤程度
32.试验方法：根据氢化镁剂量效应实验结果，选用氢化镁200mg/kg进行后续动物实验，玉米油作为溶媒混合氢化镁成悬液进入消化道后与水反应水解生成氢气和氢氧化镁。con组为腹腔注射等剂量的生理盐水5天，gly组腹腔注射乙醛酸盐5天，gh组提前2天予mgh
2 200mg/kg灌胃，后续乙醛酸盐腹腔注射5天，两次给予乙醛酸盐腹腔注射的给药时间4-6小时，goh组提前2天予mg(oh)
2 446mg/kg小鼠体重灌胃，2天后继续给予乙醛酸盐腹腔注射5天，两次给予乙醛酸盐腹腔注射的给药时间间隔4-6小时；gv组提前2天予玉米油灌胃，2天后继续给予乙醛酸盐腹腔注射5天，两次给予乙醛酸盐腹腔注射的给药时间4-6小时。
33.试验结果：试验结果见图3所示(放大倍数：200倍)，由五组小鼠肾组织的h&e、vonkossa、masson染色图可知，氢化镁组(gh组)改善了乙醛酸盐诱导的结晶肾小鼠肾小管的急性损伤，而且masson染色提示间质纤维化也有一定的减轻，而goh组和gv组并无上述的作用。
34.(四)氢化镁改善结晶肾损伤小鼠肾功能水平
35.试验方法：小鼠腹腔注射乙醛酸盐5天后，收集小鼠血液样本，离心获取血清，利用全自动生化仪检测小鼠血清肌酐和尿素氮水平。
36.试验结果：由图4可知，gly组小鼠血清尿素氮和肌酐均较con组明显升高，氢化镁治疗后肾功能有所降低，而goh和gv组无上述保护作用。
37.(五)氢化镁降低结晶肾损伤小鼠炎症水平
38.试验方法：小鼠腹腔注射乙醛酸盐5天后，收集小鼠血液样本，离心获取血清，利用elisa法检测小鼠血清il-1β和tnf-α水平。
39.试验结果：试验结果如图5所示，gly组血清il-1β和tnf-α值均升高，gh组，上述炎症指标均下降，差异有显著性意义，氢化镁对结晶肾损伤的炎症反应有改善作用。
40.(六)氢化镁改善结晶肾损伤小鼠肾组织氧化应激和脂质过氧化指标
41.试验方法：利用氧化应激和脂质过氧化试剂盒，使用多功能酶标仪检测结晶肾损伤小鼠肾组织的氧化应激指标(gsh和no)及脂质过氧化指标(mda和4hne)。
42.试验结果：结果如图6所示，结晶肾损伤小鼠机体氧化应激水平及脂质过氧化水平均明显升高，而氢化镁可以清除体内氧自由基，改善机体的氧化应激和脂质过氧化水平。
43.(七)氢化镁改善结晶肾损伤小鼠肾小管细胞凋亡
44.试验方法：原位末端转移酶标记技术(tdt-mediated dutp nick end labeling，tunel)反应细胞在凋亡早期过程中细胞核dna的断裂情况。将石蜡切片脱蜡和复水；蛋白酶k消化，暴露dna，20μg/ml，室温孵育15分钟，pbs洗5分钟
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3次；tunel反应液中孵育，室温1小时；dab显色，10分钟，pbs洗5分钟
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3次；苏木素复染细胞核；酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片，光学显微镜下观察拍照。
45.试验结果：结果如图7所示，结晶肾小鼠肾小管上皮细胞出现散在的细胞核为棕黄色的细胞(箭头所指)，即为凋亡细胞，goh组和gv组肾小管上皮细胞也有散在的凋亡细胞存在，氢化镁干预组肾小管上皮细胞形态正常，未见凋亡细胞，本实验结果提示，氢化镁可以改善小鼠肾小管上皮细胞的凋亡程度。
46.应当注意的是，本发明的实施例有较佳的实施性，且并非对本发明作任何形式的限制，任何熟悉该领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容变更或修饰为等同的有效实施例，但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改或等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。