维利帕尼在抗新型冠状病毒中的应用

1.本发明属于药物研发和制药领域，具体涉及维利帕尼(小分子)作为sars-cov-2-e通道抑制剂在抗新型冠状病毒中的应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(新冠病毒，sars-cov-2)，属于冠状病毒家族，具有极强传染性和极高死亡率，导致了全球范围内严峻的呼吸系统疾病大流行。该病毒感染主要出现呼吸道症状包括发热、咳嗽、气促和呼吸困难等；进一步的感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前，已有许多药物用于临床试验，包括抑制rdrp(依赖rna的rna聚合酶)的核苷类似物瑞德西韦(remdesivir)、羟氯喹、地塞米松等，但这些药物在实际应用过程中均存在不足。如地塞米松虽能够提升呼吸困难重症患者的生存几率，但无法用于轻症患者；羟氯喹由于毒副作用较强导致2020年6月被美国食品药品监督局(fda)紧急撤回；同时，世界卫生组织公布了近7个月的药物抗新冠病毒临床治疗应用，全球30多个国家共计11266名患者在接受瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦、干扰素、干扰素加洛匹那韦等试验药物作为临床治疗后，与未接受药物的患者相比，其总体死亡率、接受呼吸机治疗时间及住院时间等指标之间并无差异，说明目前临床试验的抗新冠肺炎治疗药物疗效甚微。此外，目前应用于临床治疗的药物均无明确的治疗机制。因此，至今仍无有效的靶标明确的药物用于临床。
3.冠状病毒包膜蛋白(sars-cov-2-e)是sars-cov-2的重要结构蛋白之一。sars-cov-2是一种囊膜、单股正链的rna病毒，基因序列大小约为26～32kb，可编码冠状病毒非结构蛋白及结构蛋白两大类，它所包含的4种结构蛋白为病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，包括刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜糖蛋白(m)、核衣壳蛋白(n)。其中sars-cov-2-e由75个氨基酸编码而成，是最小的结构蛋白，属于跨膜整合蛋白，具有亲水的氨基末端(ntd)、疏水性跨膜结构域(tmd)以及长而亲水的羧基端(ctd)三部分，与严重急性呼吸综合征(sars)病毒具有高度同源性。已有工作证明，sars-cov-2-e蛋白可以通透钾、钠、钙，镁等离子，对氯离子显示弱通透性，是一种非选择性阳离子通道。
4.sars-cov-2-e通道作为新冠病毒中的一种结构蛋白离子通道，在sars-cov-2病毒侵染过程具有重要作用。已有研究报道在不同的宿主细胞上表达与生理感染水平相当的sars-cov-2-e蛋白，可介导快速的细胞死亡并诱发“炎症风暴”；同时，sars-cov-2-e蛋白能够作为毒力因子诱发宿主发生炎症和死亡，加剧患者的病情进展，且对sars-cov-2自身的存活、复制、释放、以及侵袭具有至关重要的作用。由此可见，抑制sars-cov-2-e离子通道活性，不仅可以抑制病毒增殖，减少宿主感染后的恶性进展，同时能够降低肺部炎症反应，减少宿主损伤。此外，近期sars-cov-2-e的结构解析也同样显示sars-cov-2-e是一个极具潜力的抗病毒药物靶点。然而，目前尚无靶向sars-cov-2-e通道并应用于抗新冠肺炎治疗的药物。
5.维利帕尼(veliparib)，化学名为2-[(2r)-2-甲基-2-吡咯烷基]-1h-苯并咪唑-7-甲酰胺，是一种有效的口服parp(poly adp-ribose polymerase)抑制剂，它通过几种不同
的作用机制发挥功能。parp-1是一种含量较高的核酶，调节多种细胞过程，包括染色质重塑、转录调节，多聚adp-核糖体聚合和损伤信号。当parp-1和2被抑制时，单链dna断裂的积累会导致双链断裂，如果不能正确修复，则会导致基因组完整性的丧失和随后的细胞死亡。目前veliparib已进入iii期临床，用于卵巢癌和乳腺癌的治疗，治疗效果显著，同时其可以在同基因和异种移植瘤模型中穿越血脑屏，表现出很好的安全性、药物代谢动力学和药物效应动力学性能。


技术实现要素：

[0006]
本发明基于外源性表达sars-cov-2-e可导致宿主细胞死亡的效应，建立基于细胞存活率为指标的高通量筛选方法。首先对已上市的老药进行筛选，获得具有细胞保护活性的药物，然后通过平面脂双层工作站(blm)检测药物对sars-cov-2-e通道的阻断效果，同时考察药物对新冠病毒复制的抑制活性，获得靶向sars-cov-2-e通道的抗新冠治疗药物。本研究显示维利帕尼(小分子)具有很好的细胞保护效应，能够阻断sars-cov-2-e通道活性，并且具有抑制新冠病毒复制的功能，是一种潜在的抗新冠病毒药物，具有治疗新冠肺炎的应用前景。本发明提供了维利帕尼的新应用。
[0007]
根据本发明的一个方面，提供了维利帕尼在制备sars-cov-2-e通道抑制剂中的应用。
[0008]
根据本发明的另一个方面，提供了维利帕尼在制备抗sars-cov-2病毒的药物、消毒用品或防护用品中的应用。
[0009]
根据本发明的另一个方面，提供了维利帕尼在制备用于治疗新冠肺炎的药物中的应用。
[0010]
在所述应用中，维利帕尼为sars-cov-2-e通道抑制剂。
[0011]
根据本发明的另一个方面，提供了维利帕尼用于抗sars-cov-2病毒药物的临床前药效学评价的用途。
[0012]
本发明通过实验显示了维利帕尼能够强效地抑制sars-cov-2-e介导的通道电流；维利帕尼能够特异性地保护细胞免于由sars-cov-2-e通道介导的细胞死亡；在病毒侵染的细胞中，维利帕尼能够抑制sars-cov-2病毒的复制，显著降低新冠病毒滴度。
附图说明
[0013]
图1为维利帕尼的结构式。
[0014]
图2示出了维利帕尼对sars-cov-2-e通道电流的抑制作用效果。
[0015]
图3示出了维利帕尼对细胞保护随浓度的变化曲线及ic
50
。
[0016]
图4示出了维利帕尼对sars-cov-2-e通道抑制率随浓度的变化曲线及ic
50
。
[0017]
图5示出了维利帕尼对sars-cov-2病毒的抑制率随浓度的变化曲线及ic
50
。
具体实施方式
[0018]
在下文中，将结合附图通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明的目的，其并不用于限制本发明。
[0019]
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0020]
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021]
维利帕尼(veliparib)粉末购买于mce公司
[0022]
实验材料与仪器
[0023]
转染试剂lipofectamine 3000购买于thermo fisher公司；cell counting kit(cck-8)，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)粉末，his标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂(hissep ni-ntaagarose resin 6ff)购自翊圣公司；磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，pc)，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)购自avanti polar lipids公司；二甲基亚砜(dmso)，咪唑(imidazole)，氯化钾(kcl)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，癸烷(decane)购于sigma公司；rna提取试剂盒(minibest viral rna/dnaextraction kit)，反转录试剂盒(primescript
tm rt reagent kit)，实时荧光pcr试剂盒(takara tbpremix ex taq
tm
ii)购于takara公司。
[0024]
酶标仪(thermo scientific microplate reader)，实时荧光定量pcr仪器(abi 7500)购于thermo fisher公司；匀质机(ah-100b)购自ats engineering公司；平面脂双层工作站(the planar lipid bilayer workstation，blm workstation)购自warner公司。
[0025]
实施例1维利帕尼保护细胞免于sars-cov-2-e引发的细胞死亡
[0026]
在本实施例中，通过cck8试剂盒分析维利帕尼对vero e6细胞的保护活性(ic
50
)。vero e6细胞购买自atcc，sars-cov-2-e基因序列由华大基因公司合成并构建于pcdna5载体上，sars-cov-2-e基因号为yp_009724392.1。首先，将4000个细胞/孔的vero e6细胞铺在96孔板中培养过夜。第二天，预孵不同浓度的维利帕尼(0.033，0.11，0.33，1.1，3.3，11，33μm)，6h后转染sars-cov-2-e质粒200ng/孔，再培养24h后利用cck8试剂盒检测细胞的存活率，根据细胞存活率计算维利帕尼的细胞保护半抑制浓度(ic
50
)。
[0027]
如图3所示，结果表明，维利帕尼有较好的细胞保护作用，ic
50
为0.42μm。
[0028]
实施例2维利帕尼强效抑制sars-cov-2-e通道电流
[0029]
在本实施例中，通过平面脂双层工作站检测维利帕尼对sars-cov-2-e通道电流的抑制作用。
[0030]
1.sars-cov-2-e蛋白纯化
[0031]
sars-cov-2-e基因序列由华大基因公司合成并构建至pet28a载体上，将重组质粒转化至bl21-lyss感受态中，扩增3～4h至菌对数生长期时加入0.5mm的iptg诱导sars-cov-2-e蛋白表达，22℃表达16～18h。诱导后的菌液在4000rpm下离心20min，去上清并用重悬液(4mm dtt，20mm咪唑，25mm tris-base，150mm nacl ph＝8.0)重悬，再加入终浓度为1mm的pmsf，使用匀质机(ah-100b,ats engineering inc)破菌。菌液破碎后在13000rpm下离心30min，取上清并用0.22μm滤膜(millex-gp,millipore)进行过滤。将滤液转至his标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂(hissep ni-nta agarose resin 6ff，翊圣)中充分结合2h，然后分别用30ml的20，30，40，50mm的咪唑清洗层析柱，最后用300mm的咪唑洗脱，并使用3kd超滤管(ultra-15,millipore)浓缩蛋白溶液并更换缓冲液为25mm tris-base，150mm nacl ph＝8.0。得到浓缩的sars-cov-2-e蛋白产物后用sds-page凝胶电泳及考马斯亮蓝染色检测目的蛋白纯度，并用于后续的电生理检测，纯化的蛋白液氮速冻后保存于-80℃冰箱。
[0032]
2.化合物blm检测
[0033]
将磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰丝氨酸(ps)(avanti polar lipids；alabaster；al)按3:2的比例混合并用氮气吹干，再溶于癸烷中至终浓度为50mg/ml。将blm系统中的cup(cis)与槽子(trans)安装好，并分别加入1ml的内外液(500mm kcl在cis侧/50mm kcl在trans侧，5mm hepes，ph＝6.35)。接着将制备好的磷脂涂于cup的孔上，并在clampex10.3软件中记录到稳定的基线。5min后，在cis侧加入纯化的sars-cov-2-e蛋白，等待蛋白上膜。待sars-cov-2-e介导的电流开放后，记录3min然后在trans侧加入1，10，50，100μm的维利帕尼并继续记录至10min，检测其是否对通道电流有抑制作用。通过膜片钳放大器(bc535，warner)的电压钳模式记录电流，单通道的电导及开放频率通过高斯函数进行拟合，且开放时间小于0.5-1.5ms的被视为噪音并忽略。所有数据以平均值
±
标准差表示。
[0034]
3.实验结果分析
[0035]
电生理数据分析利用clampfit 10.3(molecular devices,sunnyvale,ca)，再利用graphpad prim 5(graphpad sofware,san diego,ca)，剂量效应曲线用希尔等式(hill equation)拟合。
[0036]
如图2所示，100μm的维利帕尼可有效地抑制sars-cov-2-e通道所介导的阳离子电流，图4所示维利帕尼抑制通道的ic
50
为7.91μm。以上实验结果表明维利帕尼是sars-cov-2-e通道的强效抑制剂。
[0037]
实施例3维利帕尼在vero e6细胞上抗sars-cov-2活性
[0038]
测定化合物维利帕尼对2019新型冠状病毒(sars-cov-2)复制抑制活性：sars-cov-2病毒来源于国家病毒资源库微生物菌毒种保藏中心(wuhan-hu-1)。将vero e6细胞在密度为5
×
104细胞/孔的48孔细胞培养皿中培养过夜，用不同浓度的维利帕尼(6.25，12.5，25，50，100，200μm)预先处理细胞1h，然后加入病毒(感染复数moi为0.05)使其感染1h，然后取出病毒化合物混合物，用含待测样品的新鲜培养基进一步培养细胞。在侵染后24h.时，收集细胞上清液并在裂解缓冲液中裂解，通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)对细胞上清液中的病毒拷贝数进行定量评估。如图5所示，维利帕尼对sars-cov-2病毒有较强的抑制作用，其ic
50
为92.0μm。
[0039]
以上实验结果表明维利帕尼能够有效地抑制sars-cov-2病毒的复制，有较好的体外抗病毒活性，可作为药物分子应用于抗病毒药物的临床前药效学评价。
[0040]
如本发明所表明的，维利帕尼能够有效地抑制sars-cov-2-e介导的单通道电流，保护sars-cov-2-e通道介导的细胞死亡，同时表现出良好的抗sars-cov-2病毒活性。研究表明维利帕尼可作为潜在的抗新冠病毒治疗药物，以及用于抗sars-cov-2病毒的消毒用品、防护用品。