cap1帽类似物的合成方法与流程

1.本技术涉及一种cap1帽类似物的合成方法，属于生物化学技术领域。


背景技术：

2.mrna疫苗是近几年兴起一种疫苗形式，尤其是新冠期间表现突出。mrna疫苗具有快速响应、便于大规模制备的优点，同时又没有dna疫苗的遗传变异的风险。非常适合应对突发性的、流传性、季节性的疾病威胁。mrna除了在疫苗领域应用，还可以应用于癌症治疗、遗传性疾病治疗等领域。mrna作为活性药物组分，其核心结构有5’端的帽子结构，5
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utr，基因翻译去、3
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utr和3
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polya尾巴。mrna的帽子结构可以通过转录后使用加帽酶和2-o-甲基转移酶的酶法加帽修饰完成，也可以通过帽类似物共转录加帽方式完成。
3.cap1结构的帽类似物是目前常用的形式，其生产方式是复杂的化学合成。核苷酸上有多个活性基团，因此合成过程中需要到多次的保护和脱保护反应，所以合成产率很低。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种cap1帽类似物的合成方法，采用化学合成加酶促反应的方法，简化了传统上的纯化学合成方法。
5.本发明采用的技术手段为：一种cap1帽类似物的合成方法，其步骤包括：通过多步化学反应合成二核苷酸pnpn；二核苷酸pnpn与gdp或者3'-ome-gdp缩合反应生成g-cap结构，即g(5')ppp(5')npn或者（3'-ome）g(5')ppp(5')npn；g(5')ppp(5')npn或者（3'-ome）g(5')ppp(5')npn在加帽酶的催化下生成cap0结构，即m7g(5')ppp(5')npn或者3'-ome-m7g(5')ppp(5')npn；m7g(5')ppp(5')npn或者3'-ome-m7g(5')ppp(5')npn在2-o甲基转移酶的催化下生成cap1帽类似物，即m7g(5')ppp(5')(2'-omen)pn或者(3'-ome-m7g)(5')ppp(5')(2'-omen)pn。
6.优选的，步骤（1）具体为：化合物1、化合物2与吡啶三氟乙酸盐溶于乙腈中搅拌反应，旋蒸旋掉乙腈，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，柱层析得到产品1；产品1溶解于thf：pyridine：h2o溶剂中，控温至0度，缓慢加入碘单质，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到产品2；产品2溶解于chcl3中，控温至0度，缓慢加入三氟乙酸，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，碳酸氢钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到化合物3；化合物3 溶解于乙腈中，加入双(2-氰乙基)-n,n-二异丙基亚磷酰胺，及吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌过夜，反应完全后加入二氯甲烷及水，分出有机相，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，柱层析得到产品3；
产品3溶解于thf：pyridine：h2o溶剂中，控温至0度，缓慢加入碘单质，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到产品4；产品4溶解于thf中，加入浓氨水，室温搅拌过夜，反应完全后旋干得到粗品，柱层析得到二核苷酸pnpn；其中化合物1的结构为，或者化合物1的碱基为尿嘧啶；化合物2的结构为 。
7.优选的，步骤（2）具体为将二核苷酸pnpn溶解于dmf中，加入cdi，加热至50℃反应一段时间，再加入gdp 或者3'-ome-gdp，室温搅拌，反应完后经过离子交换树脂纯化，得到g(5')ppp(5')npn或者（3'-ome）g(5')ppp(5')npn。
8.优选的，步骤（3）和（4）同时进行，即g(5')ppp(5')npn或者（3'-ome）g(5')ppp(5')npn在加帽酶和2-o-甲基转移酶的同时作用下，生成m7g(5')ppp(5')(2'-omen)pn或者(3'-ome-m7g)(5')ppp(5')(2'-omen)pn。
9.优选的，所述加帽酶为牛痘病毒加帽酶，或者加帽酶的甲基转移酶的活性亚基。
10.优选的，所述2-o-甲基转移酶是牛痘病毒来源、黄病毒来源或者冠状病毒来源的2-o-甲基转移酶。
11.本发明采用化学合成加酶促合成的方法合成cap1帽类似物，简化了传统上的纯化学合成方法。起始原料来源更广泛，更便宜，合成步骤更简单，合成得率更高。
附图说明
12.图1：化合物5g(5’)ppp(5’)apg的合成路线图。
13.图2：由化合物5g(5’)ppp(5’)apg合成m7g(5')ppp(5')(2'-omen)pg的合成路线图。
14.图3：m7g(5')ppp(5')(2'-omen)pg的结构式。
15.图4：(3'-ome-m7g)(5')ppp(5')(2'-omea)pg的结构式。
具体实施方式
16.实施例1，化学合成g-cap，g(5’)ppp(5’)apg1、化合物3的合成如图1所示，步骤a， 57.5g化合物1加入1.2l 乙腈，溶清后加入85.8g化合物2，57g吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌反应过夜，反应完全，旋蒸旋掉乙腈，加入1l 二氯甲烷，水洗一次，饱和食盐水洗涤一次，柱层析得到100g产品1。
17.步骤b，上述100g产品1溶解于1l的thf：pyridine：h2o（4:2:4）溶剂中，控温至0度，缓慢加入3eq的碘单质，室温反应3小时，旋干，加入1000ml二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠洗涤，旋干，柱层析得到90g产品2。
18.步骤c，上述90g产品2溶解于1l的chcl3中，控温至0度，缓慢加入3eq的三氟乙酸，室温反应过夜，旋干，加入1000ml二氯甲烷，水洗，5%碳酸氢钠洗涤，旋干，柱层析得到65g化合物3。
19.2、化合物4的合成步骤d，54g 化合物3 溶解于600ml 乙腈中，加入 15g 双(2-氰乙基)-n,n-二异丙基亚磷酰胺，及15g吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌过夜，反应完全后加入600ml二氯甲烷及600ml水，分出有机相，5%碳酸氢钠洗涤，饱和氯化钠洗涤，柱层析得到50g产品3。
20.步骤e，上述50g产品3溶解于1l的thf：pyridine：h2o（4:2:4）溶剂中，控温至0度，缓慢加入3eq的碘单质，室温反应3小时，旋干，加入600ml二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠洗涤，旋干，柱层析得到40g产品4。
21.步骤f，上述40g产品4溶解于300ml的thf中，加入200ml浓氨水，室温搅拌过夜，反应完全后旋干得到粗品，柱层析得到10g化合物4。
22.3、化合物5的合成步骤g，10g 化合物4溶解于100ml dmf中，加入2g cdi，加热至50度反应2小时，再加入5g gdp，室温搅拌过夜。反应完后经过deae-sephadex离子交换树脂纯化，得到5g 化合物5（g(5’)ppp(5’)apg）。
23.实施例2，化学合成g-cap，（3'-ome）g(5')ppp(5')apg同实施例1相同的合成路线，区别在于3'-ome-gdp替代gdp，得到（3'-ome）g(5')ppp(5')apg。
24.实施例3，酶促合成cap0，m7gpppapg在实施例1中合成的g-cap，g(5’)ppp(5’)apg，取10g，按照下表配置反应体系：原料添加量g(5’)ppp(5’)apg10g氯化镁3.8g二硫苏糖醇3gs-腺苷蛋氨酸32g三羟甲基氨基甲烷2.4g牛痘病毒加帽酶0.1g超纯水至1l在2l反应釜中，控制反应温度为37℃，控制ph为8.0。反应12h后，加入8g edta终止
反应。hplc检测反应完成率为85%。高效液相纯化后纯度为96%，旋转蒸发后，冻干，得到7.5g目标产物m7gpppapg。
25.实施例4，酶促合成cap1，m7gpppampg在实施例3中合成的cap0，m7g(5’)ppp(5’)apg，取5g，按照下表配置反应体系：原料添加量m7g(5’)ppp(5’)apg5g氯化镁2g二硫苏糖醇1.5gs-腺苷蛋氨酸10g三羟甲基氨基甲烷1.2g牛痘病毒2-o-甲基转移酶0.05g超纯水至0.5l在1l反应釜中，控制反应温度为37℃，控制ph为8.0。反应12h后，加入8g edta终止反应。hplc检测反应完成率为92%。高效液相纯化后纯度为98%，旋转蒸发后，冻干，得到4.1g目标产物m7gpppampg。
26.实施例5，一步酶促合成cap1, (3'-ome-m7g)(5')ppp(5')(2'-omea)pg在实施例2中合成的g-cap，（3'-ome）g(5’)ppp(5’)apg，取10g，按照下表配置反应体系：原料添加量（3'-ome）g(5’)ppp(5’)apg10g氯化镁3.8g二硫苏糖醇3gs-腺苷蛋氨酸40g三羟甲基氨基甲烷2.4g非洲猪瘟病毒加帽酶0.1g黄病毒2-o-甲基转移酶0.1g超纯水至1l在2l反应釜中，控制反应温度为37℃，控制ph为8.0。反应12h后，加入8g edta终止反应。hplc检测反应完成率为79%。高效液相纯化后纯度为92%，旋转蒸发后，冻干，得到6.3g目标产物(3'-ome-m7g)(5')ppp(5')(2'-omea)pg。
27.实施例6，合成cap1, m7g(5’)ppp(5’)(2
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omea)pu同实施例1和2一样的合成路线合成g-cap，g(5’)ppp(5’)apu。取10g，按照下表配置反应体系：原料添加量g(5’)ppp(5’)apu10g氯化镁3.8g二硫苏糖醇3gs-腺苷蛋氨酸40g三羟甲基氨基甲烷2.4g
牛痘病毒加帽酶鸟苷转移酶亚基0.05g牛痘病毒2-o-甲基转移酶0.1g超纯水至1l在2l反应釜中，控制反应温度为37℃，控制ph为8.0。反应12h后，加热80℃，30分钟终止反应。hplc检测反应完成率为82%。高效液相纯化后纯度为93%，旋转蒸发后，冻干，得到6.7g目标产物m7g(5')ppp(5')(2'-omea)pu。