一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法

一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升
ω-转氨酶催化活性的方法
技术领域
1.本发明属于催化剂技术领域，具体涉及一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法。


背景技术：

2.绿色化学以及可持续化学一直是化学研究领域的热点和前沿方向，绿色溶剂以及催化剂的研究开发更是一个重要的核心内容。在一些化学反应中，繁琐的操作步骤、苛刻的反应条件、价格高昂的催化剂以及污染严重的有机溶剂已经成为制约其进一步发展应用的主要阻力。酶催化反应具有条件温和、环境友好以及高效专一性等显著特点，是较为理想的绿色催化剂。生物酶催化剂由于其天然来源，反应条件温和，副反应少的特点，使得反应过程更绿色环保，反应过程及产物更具安全性。
3.手性胺作为一种重要的医药中间体，在农业和化学工业中具有广泛的应用，目前，几乎一半的活性药物成分都至少含有一个手性胺单元，使手性胺成为制药工业中十分有价值的结构砌块。胺的工业化生产主要依赖于烯酰胺的金属催化氢化，但此方法成本昂贵，生产过程危险，污染严重，且生成的胺大多为非手性的。生物酶法合成手性胺以其经济、环保、反应条件温和、制备效率高等逐渐得到关注，其中，利用ω-转氨酶催化相应的前体酮不对称合成手性胺，以其优异的立体选择性成为手性胺工业化生产最具潜力的替代手段之一。
4.目前可以用于手性胺合成的生物催化剂主要有胺脱氢酶、人工金属酶、单胺氧化酶、亚胺还原酶和ω-转氨酶等。其中，ω-转氨酶以前手性酮类化合物作为底物，通过立体选择性的转氨基作用实现手性胺的生物合成，且产物纯度高，具有相对更好的工业应用前景。
5.ω-转氨酶(aminotransferase，transaminase)是一类需要通过磷酸吡哆醛(plp)来进行可逆催化氨基酸与酮类之间氨基转移的转移酶，普遍存在于动物、植物组织和微生物中，它们可以可逆地将来源于氨基供体的氨基转移到酮类氨基酸受体上。
6.在转氨酶酶催化反应中，由于存在某些条件(酶稳定性低、水解严重、溶解性差等)的约束，此类型反应在传统缓冲液中进行并不能获得令人满意的结果。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，通过该方法制备得到的低共熔溶剂能够较大程度的促进底物的溶解。在ω-转氨酶酶促反应的过程中，解决了酶促反应时反应底物溶解性较差而造成催化效率低的问题，并且提高了ω-转氨酶的催化活性、热稳定性、保存时间等酶活性质。本发明的des-缓冲溶剂制作简单、反应条件温和、无毒、可降解，符合绿色化学的发展，具有广泛的工业生产前景。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂，包括氢键供体试剂和氢键受体试剂；其中：氢键供体试剂选自多元醇类化合物，氢键受体试剂选自季铵盐。
10.作为优选，氢键供体试剂选自1,2-丙二醇、甘油、乙二醇、木糖醇。
11.作为优选，氢键供体试剂选自氯化胆碱和甜菜碱中的至少一种，或是它们的混合物。
12.本发明还提供了一种低共熔溶剂用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，该方法包括如下步骤：
13.s01、将氢键供体试剂和氢键受体试剂按预设比例混合，加热至70-80℃，反应3-8h后至澄清溶液状态，得到低共熔溶剂。
14.s02、将低共熔溶剂和缓冲溶液混合，即制备得到des-缓冲溶液。
15.作为优选，在步骤s01中，氢键供体试剂和氢键受体试剂的摩尔比为1:1或1:2或2:1或2:3。
16.作为优选，在步骤s01中，加热温度为75℃。
17.作为优选，在步骤s01中，反应时间为2-3h。
18.作为优选，在步骤s02中，缓冲溶液选自氯化胆碱和1,2-丙二醇摩尔比为1:2的混合液、氯化胆碱和甘油摩尔比为1:2的混合液、氯化胆碱和乙二醇摩尔比为1:2的混合液、氯化胆碱和木糖醇摩尔比为1:2的混合液中的至少一种。
19.作为优选，在步骤s02中，缓冲溶液选自氯化胆碱:乙二醇1:2的混合液；其中，des:缓冲溶液1:9。
20.作为优选，在步骤s02中，低共熔溶剂与缓冲溶液配比为1-10:1-10。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.1、本发明解决了酶促反应时反应底物溶解性较差的问题，促进氨基酸与酮类之间氨基的转移，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化，且通过多元醇类氢键供体制备得到的低共熔溶剂可有效提升ω-转氨酶催化活性催化活性的优点。
23.2、本发明与传统的缓冲溶剂相比，先进行了des-缓冲溶剂的制备，然后在ω-转氨酶的过程中将传统的缓冲溶剂换成des-缓冲溶剂，低共熔溶剂具有低波动性、低燃性、低熔点、低蒸汽压、溶解度高和稳定性强,易于存储和合成,以及原材料成本低等优势。
24.3、本发明提供的低共熔溶剂是由氯化胆碱:1,2-丙二醇、氯化胆碱:乙二醇、氯化胆碱:甘油按照一定比例混合，温度为80℃，加热搅拌3h以上，直到形成无色透明液体。待冷却至室温后，置于干燥皿干燥。该低共溶剂具有廉价无毒、可降解、易于制备、反应产物易分离等优点，是一个符合绿色化学的重要应用。
25.4、本发明中氯化胆碱、1,2-丙二醇、甘油、乙二醇都是价格低廉，且低共熔溶剂无毒可降解，与传统的缓冲溶剂相比，具有很大的优势。
附图说明
26.图1为苯乙酮高效液相色谱图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例1
29.本发明提供了一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，解决反应底物溶解性较差的问题，促进了氨基酸与酮类之间氨基的转移，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。该低共熔溶剂是由氯化胆碱与纯度≥98％的乙二醇按照1:2的比例混合制成。
30.制备上述低共溶溶剂的方法如下:氯化胆碱与纯度≥98％的乙二醇按照1:2的比例混合在蓝口烧瓶中，磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70℃-80℃，2h，直至形成无色透明液体。待冷却至室温后，收集在干燥器中干燥。干燥后的低共熔溶剂与传统缓冲溶剂进行1:9的混合，得到des-缓冲溶液。
31.本实施例提供了一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法如下:
32.取一定量的菌种接种在含有卡那霉素的lb液体培养基中，在摇床中过夜培养，温度37℃。随后，菌液接种到200ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，在摇床中培养2-4h。od浓度达到指标时加入iptg，诱导18-20h。
33.诱导表达后的细胞保存在离心管中，使用冷冻离心机收集菌体。菌体细胞重悬于咪唑中，利用高压均质机对细胞进行破碎，取上清液。粗酶经滤膜过滤后，使用亲和层析柱分离纯化重组蛋白。将得到的酶液进行浓缩，除去咪唑成分，浓缩过程中使用des-缓冲溶液替换传统缓冲溶液，得到ω-转氨酶。取稀释后的纯化酶液在ep管中，加入180μl反应底物混合，以磷酸盐缓冲液作为对照，三组平行实验，反应3min。通过高效液相色谱仪检测在245nm处的峰面积，计算出ω-转氨酶的比活力，计算ω-转氨酶的催化效率。
34.实施例2
35.本发明提供了一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，解决反应底物溶解性较差的问题，促进了氨基酸与酮类之间氨基的转移，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。该低共熔溶剂是由氯化胆碱与纯度≥98％的甘油按照1:2的比例混合制成。
36.制备上述低共溶溶剂的方法如下:氯化胆碱与纯度≥98％的甘油按照1:2的比例混合在蓝口烧瓶中，磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70℃-80℃，2h，直至形成无色透明液体。待冷却至室温后，收集在干燥器中干燥。干燥后的低共熔溶剂与传统缓冲溶剂进行1:9的混合，得到des-缓冲溶液。
37.本实施例提供了一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，具体方法如下:
38.取一定量的菌种接种在含有卡那霉素的lb液体培养基中，在摇床中过夜培养，温度37℃。随后，菌液接种到200ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，在摇床中培养2-4h。od浓度达到指标时加入iptg，诱导18-20h。
39.诱导表达后的细胞保存在离心管中，使用冷冻离心机收集菌体。菌体细胞重悬于咪唑中，利用高压均质机对细胞进行破碎，取上清液。粗酶经滤膜过滤后，使用亲和层析柱
分离纯化重组蛋白。将得到的酶液进行浓缩，除去咪唑成分，浓缩过程中使用des-缓冲溶液替换传统缓冲溶液，得到ω-转氨酶。取稀释后的纯化酶液在ep管中，加入180μl反应底物混合，以磷酸盐缓冲液作为对照，三组平行实验，反应3min。通过高效液相色谱仪检测在245nm处的峰面积，计算出ω-转氨酶的比活力，计算ω-转氨酶的催化效率。
40.实施例3
41.本发明提供了一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，解决反应底物溶解性较差的问题，促进了氨基酸与酮类之间氨基的转移，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。该低共熔溶剂是由氯化胆碱与纯度≥98％的1,2-丙二醇按照1:2的比例混合制成。
42.制备上述低共溶溶剂的方法如下:氯化胆碱与纯度≥98％的1,2丙二醇按照1:2的比例混合在蓝口烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70℃-80℃，2h，直至形成无色透明液体。待冷却至室温后，收集在干燥器中干燥。干燥后的低共熔溶剂与传统缓冲溶剂进行1:9的混合，得到des-缓冲溶液。
43.本实施例提供了一种基于多元醇类氢键供体的低共熔溶剂及其应用于提升ω-转氨酶催化活性的方法，具体方法如下:
44.取一定量的菌种接种在含有卡那霉素的lb液体培养基中，在摇床中过夜培养，温度37℃。随后，菌液接种到200ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，在摇床中培养2-4h。od浓度达到指标时加入iptg，诱导18-20h。
45.诱导表达后的细胞保存在离心管中，使用冷冻离心机收集菌体。菌体细胞重悬于咪唑中，利用高压均质机对细胞进行破碎，取上清液。粗酶经滤膜过滤后，使用亲和层析柱分离纯化重组蛋白。将得到的酶液进行浓缩，除去咪唑成分，浓缩过程中使用des-缓冲溶液替换传统缓冲溶液，得到ω-转氨酶。取稀释后的纯化酶液在ep管中，加入180μl反应底物混合，以磷酸盐缓冲液作为对照，三组平行实验，反应3min。通过高效液相色谱仪检测在245nm处的峰面积，计算出ω-转氨酶的比活力，计算ω-转氨酶的催化效率。
46.本实施例的结果:
47.经检测，本发明解决酶促反应时反应底物溶解性较差的问题，促进了氨基酸与酮类之间氨基的转移，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。并且很大程度的提高了ω-转氨酶的催化活性、热稳定性以及储存时间。
48.本发明的应用:在ω-转氨酶催化反应中，由于存在某些条件(酶稳定性低、水解严重、溶解性差等)的约束，此类型反应在传统缓冲液中进行并不能获得令人满意的结果。为了解决催化效率低、稳定性差等问题，促进氨基酸与酮类之间氨基的转移，本发明使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。
49.1、如图1为245nm处，检测苯乙酮高效液相色谱图，则如图1所示，8.8min左右出峰为苯乙酮目标峰，根据峰面积大小来判断苯乙酮的生成量。
50.2、下列公式计算酶的比活力:
[0051][0052]
其中，δod245:在245nm处每分钟吸光度的变化
[0053]
v:酶反应体系总体积(200μl)
[0054]
d:光径(0.6cm)
[0055]
ε:为苯乙酮的摩尔吸光系数(12000l/(mol
·
cm))
[0056]
ve:反应体系中酶的体积(20μl)
[0057]
[e]:酶的浓度(mg/ml)
[0058]
3、反应速率[v]与底物浓度[s]之间的关系如公式
[0059][0060]
催化效率kcat/km，其中[e]为酶的摩尔浓度。
[0061]kcat
＝v
max
/[e]。