一种丛枝菌根真菌培养基质的制作方法

1.本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌培养基质。


背景技术：

2.丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi,amf）是自然界大量存在的能够侵染植物根系且与植物根系形成菌根共生体的土壤真菌。amf菌丝与宿主植物营养根系共生所形成的丛枝菌根是生态系统中广泛分布的植物-真菌互惠共生体系的代表，其对植物群落生产力的形成和生物多样性的维持具有重要作用。有研究表明，全球约80%的陆生植物能够与amf形成共生体系，且部分植物对amf具有高度依赖性。在amf与宿主根系形成的共生体系内，amf菌丝一端侵染进宿主根系表皮细胞内形成丛枝结构，用无机化合物（氮和磷酸盐）与宿主细胞的碳水化合物和脂肪酸进行交换以及分泌菌根因子激活宿主相关基因的表达，另一端则形成根外菌丝扩大宿主根系吸收养分的范围。amf从宿主体内获取含碳有机物以满足自身的生长和繁殖，研究显示宿主体内约20%的光合产物用于amf的消耗，其中一部分用于amf自身的生长代谢，另一部分则以小分子有机化合物的形式释放到土壤中，以诱导根际细菌在菌丝附近或表面定殖，从而改善土壤微生物群落结构，进而改变宿主植物根际微环境。amf的共生可为宿主根系提供更多的营养物质和水分，增大宿主对营养物质的吸收和利用效率。此外，amf也可以通过影响宿主体内相关代谢途径和基因的表达等调节宿主植物体内激素的合成与分配，促进宿主植物的生长和发育，两者在长期的协同进化过程中所形成的互惠互利共生关系，对植物生长乃至繁殖发挥着重要的调控作用。
3.目前丛枝菌根真菌的培育方法包括盆栽培养法、培养基培养法、营养液培养法、汽雾培养法、玻璃珠分室培养法、离体无菌纯培养法等，其培育过程大多对培养基质的要求较高，导致培养成本提高。例如，专利cn201811102296.2公开了一种丛枝菌根真菌培养基质，包括改性的膨润土陶砂，对膨润土陶砂进行改性处理的改性液包括：硫酸亚铁、硫酸锰、硝酸铜、硝酸锌、维生素b2、维生素b3、维生素b6、蔗糖、葡萄糖、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、钼酸钠和氯化钴，其需在低压下采用该改性液对膨润土陶砂进行超声震荡，条件较为苛刻。专利cn200910098981.7公开了一种丛枝菌根真菌合成培养基，所述的培养基包含：硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硝酸钙、edta铁钠盐、肌醇、硫酸锰、硫酸铜、硼酸、硫酸锌、碘化钾、钼酸钠、氯化钴、维生素b、咇哆醇、烟酸、蔗糖、葡萄糖和植物胶等，采用该培养基进行丛枝菌根真菌培养，繁殖速度较慢。因此，进一步优化丛枝菌根真菌培养基质，对于丛枝菌根真菌的大规模生产及应用十分必要，且对于农业可持续发展及生态环境保护也具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种丛枝菌根真菌培养基质。
5.本发明中培养基的成分如无特别说明，均为本领域一般认定的成分。
6.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：一方面，本发明提供了一种丛枝菌根真菌培养基质，所述的培养基质包含玉米秸
秆生物炭、膨润土、亚硫酸锌、硫酸镁、海藻酸钠、维生素b2、谷胱甘肽、双甘氨肽、木质素、葡萄糖、果糖。
7.具体地，所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭5-15份、膨润土20-40份、亚硫酸锌0.05-0.5份、硫酸镁0.1-0.5份、海藻酸钠0.1-0.5份、维生素b2 1-5份、谷胱甘肽1-3份、双甘氨肽1-3份、木质素3-7份、葡萄糖3-7份、果糖3-7份。
8.进一步具体地，所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭10份、膨润土30份、亚硫酸锌0.1份、硫酸镁0.3份、海藻酸钠0.3份、维生素b2 3份、谷胱甘肽2份、双甘氨肽2份、木质素5份、葡萄糖5份、果糖5份。
9.进一步具体地，所述亚硫酸锌的浓度为0.05-0.15mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.01-0.1mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.01-0.1mg/l，所述维生素b2的浓度为10-15mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为3-7mg/l、所述双甘氨肽的浓度为3-7mg/l、所述葡萄糖的浓度为1200-1800mg/l、所述果糖的浓度为800-1200mg/l。
10.进一步具体地，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
11.进一步具体地，所述的玉米秸秆生物炭的制备方法为：取玉米秸秆置于400℃炭化5-7h，制备得到玉米秸秆生物炭。
12.进一步具体地，所述的玉米秸秆生物炭的比表面积为100-500m2·
g-1
，优选为100-200m2·
g-1
。
13.进一步具体地，所述的玉米秸秆生物炭与膨润土的比例为1:2-5，优选为1:3。
14.进一步具体地，所述的谷胱甘肽与双甘氨肽的比例为1:1-3，优选为1:1。
15.另一方面，本发明提供了上述培养基质在丛枝菌根真菌培养中的应用。
16.具体地，所述的丛枝菌根真菌为丛枝菌根真菌菌株rhizophagus irregularis m1。
17.又一方面，本发明提供了一种丛枝菌根真菌培养物，所述的培养物通过上述培养基质培养丛枝菌根真菌得到。
18.具体地，所述的丛枝菌根真菌为丛枝菌根真菌菌株rhizophagus irregularis m1。
19.又一方面，本发明提供了上述丛枝菌根真菌培养物在农业生产或生态环境修复中的应用。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭、膨润土、亚硫酸锌、硫酸镁、海藻酸钠、维生素b2、谷胱甘肽、双甘氨肽、木质素、葡萄糖、果糖，采用所述的培养基质培养丛枝菌根真菌，并与植物进行共培养，能够有效改善植物根系和微生物环境，提高植物重金属耐性，对于农业可持续发展及生态环境保护具有重要意义。
附图说明
21.图1为菌根侵染率检测结果图。
22.图2为植物p含量检测结果图。
23.图3为植物地上部分cr含量检测结果图。
24.图4为植物根系部分cr含量检测结果图。
25.图5为cr转运系数检测结果图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.一.实验材料1.丛枝菌根真菌为丛枝菌根真菌菌株rhizophagus irregularis m1，购自北京市农林科学院中国丛枝菌根真菌种质资源库。
28.2.膨润土：购自sigma-aldrich，货号682659。
29.3.亚硫酸锌：购自上海吉至生化科技有限公司，货号z80930。
30.4.硫酸镁：购自sigma-aldrich，货号m7506。
31.5.海藻酸钠：购自sigma-aldrich，货号w201502。
32.6.维生素b2：购自国药集团化学试剂有限公司，货号cato-ccfd200001。
33.7.谷胱甘肽：购自国药集团化学试剂有限公司，货号tg00731g。
34.8.双甘氨肽：购自国药集团化学试剂有限公司，货号catoccfd200626。
35.9.木质素：购自国药集团化学试剂有限公司，货号a37095901。
36.10.葡萄糖：购自北京凯森莱科技有限公司，货号mfcd00148913。
37.11.果糖：购自国药集团化学试剂有限公司，货号63003034。
38.实施例1.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭10份、膨润土30份、亚硫酸锌0.1份、硫酸镁0.3份、海藻酸钠0.3份、维生素b2 3份、谷胱甘肽2份、双甘氨肽2份、木质素5份、葡萄糖5份、果糖5份。
39.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
40.所述的玉米秸秆生物炭的制备方法为：取玉米秸秆洗净，自然风干，剪碎，放入粉碎机进行破碎。将破碎好的玉米秸秆放入烘箱，于70-80℃烘12h，至完全干燥。将烘干的玉米秸秆置于马弗炉内，于400℃加热6h，取出，过0.154mm筛。制备得到的玉米秸秆生物炭的比表面积为109.3m2·
g-1
。
41.实施例2.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭5份、膨润土20份、亚硫酸锌0.5份、硫酸镁0.5份、海藻酸钠0.5份、维生素b2 5份、谷胱甘肽3份、双甘氨肽3份、木质素7份、葡萄糖7份、果糖7份。
42.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻
酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
43.所述的玉米秸秆生物炭的制备方法同实施例1。
44.实施例3.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭15份、膨润土40份、亚硫酸锌0.05份、硫酸镁0.1份、海藻酸钠0.1份、维生素b2 1份、谷胱甘肽1份、双甘氨肽1份、木质素3份、葡萄糖3份、果糖3份。
45.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
46.所述的玉米秸秆生物炭的制备方法同实施例1。
47.对比例1.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭10份、膨润土30份、亚硫酸锌0.1份、硫酸镁0.3份、海藻酸钠0.3份、维生素b2 3份、谷胱甘肽2份、双甘氨肽2份、木质素5份、葡萄糖5份、果糖5份。
48.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
49.所述的玉米秸秆生物炭的制备方法为：取玉米秸秆洗净，自然风干，剪碎，放入粉碎机进行破碎。将破碎好的玉米秸秆放入烘箱，于70-80℃烘12h，至完全干燥。将烘干的玉米秸秆置于马弗炉内，于500℃加热6h，取出，过0.154mm筛。制备得到的玉米秸秆生物炭的比表面积为482.5m2·
g-1
。
50.对比例2.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭10份、膨润土30份、亚硫酸锌0.1份、硫酸镁0.3份、海藻酸钠0.3份、维生素b2 3份、谷胱甘肽4份、木质素5份、葡萄糖5份、果糖5份。
51.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
52.所述的玉米秸秆生物炭的制备方法同实施例1。
53.对比例3.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含玉米秸秆生物炭10份、膨润土30份、亚硫酸锌0.1份、硫酸镁0.3份、海藻酸钠0.3份、维生素b2 3份、双甘氨肽4份、木质素5份、葡萄糖5份、果糖5份。
54.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
55.所述的玉米秸秆生物炭的制备方法同实施例1。
56.对比例4.一种丛枝菌根真菌培养基质所述的培养基质包含膨润土40份、亚硫酸锌0.1份、硫酸镁0.3份、海藻酸钠0.3份、维生素b2 3份、谷胱甘肽2份、双甘氨肽2份、木质素5份、葡萄糖5份、果糖5份。
57.其中，所述亚硫酸锌的浓度为0.1mg/l，所述硫酸镁的浓度为0.05mg/l，所述海藻酸钠的浓度为0.05mg/l，所述维生素b2的浓度为12mg/l、所述谷胱甘肽的浓度为5mg/l、所述双甘氨肽的浓度为5mg/l、所述葡萄糖的浓度为1500mg/l、所述果糖的浓度为1000mg/l。
58.实验例1.1.重金属土壤基质配制：取土壤自然风干，过4mm筛，得到土壤基质。重金属cr以k2cro4溶液的形式加入上述土壤基质中，土壤cr浓度为20mg/kg，制备得到重金属cr土壤基质。
59.2.丛枝菌根真菌菌剂制备：分别取400g步骤1制备的重金属土壤基质，与实施例1-3、对比例1-4的丛枝菌根真菌培养基质混合得到混合基质，在混合基质接种丛枝菌根真菌，使其接种孢子密度为10个/g，分别记为实施例1-3、对比例1-4；同时设置空白对照组（取400g步骤1制备的重金属土壤基质，接种丛枝菌根真菌，使其接种孢子密度为10个/g）。
60.3.实验方法：取8个培养盆栽，每个培养盆栽中先加入600g步骤1制备的重金属土壤基质，分别取步骤2制备的含有丛枝菌根真菌的实施例1-3、对比例1-4的混合基质，置于盆栽上层。每个盆栽中种植10棵紫花苜蓿幼苗，两周后间苗，保留3棵长势一致的植株，其余移除。每天称重浇水，保持水分含量在15%。盆栽置于人工气候室，其室内光照强度为700μmol/m2/s-1
，白天：黑夜为25℃：20℃、16h：8h，相对湿度70%。植物生长两个月后收获。
61.4.样品收获：将紫花苜蓿地上部分和根系分别收获，筛出根系后用自来水冲洗干净，分取少量根系存于50%酒精用于测定菌根侵染率。其余样品置于烘箱中105℃杀青30min，后70℃烘干48h至恒重后称重记录。同时保存土壤样品，自然风干待测。
62.5.参考现有技术已知的检测方法分别进行菌根侵染率、植物元素含量的测定及土壤cr形态的测定。
63.（1）菌根侵染率的测定：10% koh，90℃下水浴30min透明植物根系，水洗，2% hcl常温条件下酸化5min，然后用0.05%曲利苯蓝在90℃下水浴染色30min，最后用乳酸甘油脱色。完成脱色后随机挑选50根0.5cm长的根段制片，在200倍显微镜下观察，按照菌根侵染和丛枝丰度分级标准记录侵染等级，采用mycocalc计算菌根侵染率。检测结果如图1所示。
64.由图1可知，采用本发明所述的丛枝菌根真菌培养基质，可显著提高紫花苜蓿的菌根侵染率，促进植物的生长及菌根与植物的共生关系。
65.（2）植物p含量的测定：称取一定量的植物地上部分干样于微波消解管中，加入10ml纯硝酸，放置过夜预消解，后用微波消解仪消解。消解程序：8min爬升至120℃，保持3min；11min爬升至160℃，保持5min；7min爬升至180℃，保持40min。消解液在140℃下赶酸至剩余1ml，后转移至离心管定容，过滤后等待上机测定。用电感耦合等离子体发射光谱仪（icp-oes）测定植物样品p浓度。检测结果如图2所示。
66.由图2可知，采用本发明所述的丛枝菌根真菌培养基质，可显著提高植物的p含量，促进植物对p的吸收。
67.（3）植物cr含量的测定：称取一定量的植物地上部分及根系部分干样于微波消解管中，加入10ml纯硝酸，放置过夜预消解，后用微波消解仪消解。消解程序：8min爬升至120℃，保持3min；11min爬升至160℃，保持5min；7min爬升至180℃，保持40min。消解液在140℃下赶酸至剩余1ml，后转移至离心管定容，过滤后等待上机测定。用电感耦合等离子体质谱仪（icp-ms）测定植物样品cr浓度并计算cr转运系数（cr转运系数为植物地上部分cr含量和
植物根系部分cr含量之比）。检测结果如图3-图5所示。
68.由图3-图5可知，采用本发明所述的丛枝菌根真菌培养基质，可显著降低植物地上部分及根系的cr含量，同时抑制cr从根系向地上部分的转移，缓解植物铬毒害作用。
69.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。