一种高通量酵母双杂交文库筛选方法与流程

1.本发明涉及分子生物技术领域，更具体的说是涉及一种高通量酵母双杂交文库筛选方法。


背景技术：

2.酵母菌是一种微生物，其生长条件简单，遗传背景清楚，高效低成本的特点使得酵母适合用于突变筛选和功能研究，在分析蛋白质相互作用方面尤为突出。通过dna结合结构域和转录激活结构域结合共同启动蛋白的转录与翻译，通过涂板观察酵母菌落的生长情况来鉴定蛋白之间是否具有相互作用。经典方法在进行大批量筛选互作蛋白时涂板，挑选单克隆验证都会消耗大量时间。
3.综上，如何提供一种不需进行涂板筛选鉴定互作蛋白的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种高通量酵母双杂交文库筛选方法。本发明的方法提高了工作效率，免除了杂交后涂板生长的步骤。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种高通量酵母双杂交文库筛选方法，包括如下步骤：
7.(1)酵母诱饵菌株的制备；
8.(2)酵母诱饵菌株与文库菌的杂交；
9.(3)交配后培养物的培养与检测：
10.将交配后培养物置于半固态培养基中，冰上培养，使液态培养基凝固成半固态胶冻状，之后培养收集酵母细胞，并提取酵母细胞质粒进行pcr扩增，凝胶电泳检测。
11.所取得的有益效果：该方法采用半固态凝胶培养基培养来代替经典方法中涂板培养的步骤，缩减了工作量，也免去挑选单克隆进行检测时的大量重复操作。
12.进一步的，步骤(1)的具体操作为：将质粒和carrier dna混合后加入到酵母感受态细胞中培养，经solution b孵育和solution c清洗后，使用sd/-trp筛选培养基培养，得到酵母诱饵菌株；其中，
13.solution b包括如下质量浓度的组分：200mm/l的bicine和40％的pge1000；
14.solution c包括如下质量浓度的组分：10mm/l的bicine和150mm/l的nacl；
15.sd/-trp筛选培养基包括如下质量浓度的组分：sd/-leu/-trp 1.19g/l、yeast nitrogen base w/o amino acids(ynb)6.7g/l、leu 10～200mg/l和agar 20g/l；调节ph至5.8，且使用时加入葡萄糖，使葡萄糖的终质量浓度为2～20％。
16.进一步的，步骤(1)的具体操作为：
17.(11)取质粒和carrierdna；其中，质粒和carrier dna的质量体积比为1:10μg/μl，且carrier dna的质量浓度为10mg/ml；
18.(12)将质粒和carrierdna混合后加入到酵母感受态细胞中，37℃培养3～5min，且转速为200～250rpm/min；
19.(13)培养完成后加入1ml solution b，混匀后30℃孵育1小时；
20.(14)24～30℃条件下3000～4000rpm/min离心1min，弃上清，加入1ml solution c，24～30℃条件下3000～4000rpm/min离心1min，弃上清，再加入100μl solution c重悬细胞；
21.(15)涂布在sd/-trp筛选培养基中，封闭膜封闭，28℃培养2～3天，得酵母诱饵菌株。
22.所取得的有益效果：上述方法可通过96孔板高通量制备诱饵菌。
23.进一步的，carrier dna使用前需要100℃预热3～5min，之后冰上放置1～2min；
24.酵母感受态细胞类型为y187。
25.所取得的有益效果：使用carrierdna前进行上述操作以保证在转化试验体系中以单链形式存在并发挥作用，促进质粒进入酵母细胞和保护质粒不被dna酶降解。
26.进一步的，步骤(2)的具体操作为：将文库菌与酵母诱饵菌株混合，培养，待有受精卵后即得交配后培养物。
27.进一步的，步骤(2)的具体操作为：
28.(21)培养完成后，挑选直径2～3mm的酵母细胞接种到30～50ml sd/-trp液体培养基中，28℃下振荡培养至od
600
＝0.6～1.0，震荡培养参数200～250rpm/min，1000g离心3～5min，弃上清，重悬于3～5ml sd/-trp液体培养基中；
29.sd/-trp液体培养基包括如下质量浓度的组分：sd/-leu/-trp 1.19g/l、yeast nitrogen base w/o amino acids 6.7g/l和leu 10～200mg/l；调节ph至5.8，且使用时加入葡萄糖，使葡萄糖的终质量浓度为2％；
30.(22)在24～30℃条件下解冻1ml文库菌，与酵母诱饵菌株混合，置于含50μg/ml卡那霉素的2
×
ypda培养基，28℃、30～50rpm/min孵育20～24小时；
31.(23)孵育后在显微镜下检查，如果有受精卵，则进入下一步，如果没有，则交配继续，再孵育4小时；
32.(24)1000g离心10min，用含50μg/ml卡那霉素的0.5
×
ypda培养基重新悬浮沉淀的细胞后再次1000g离心10min，之后重悬于含50μg/ml卡那霉素的0.5
×
ypda培养基中，得交配后培养物；
33.(25)检测交配后培养物中的受精卵的数目和杂交融合度。
34.所取得的有益效果：此方式混合进行酵母杂交，交配转速30～50rpm/min，避免转速过低而造成菌体沉淀，过高影响交配效率。
35.进一步的，文库菌为y2h gold；
36.受精卵状似三叶草。
37.进一步的，步骤(25)的具体操作为：取交配后培养物稀释后分别涂在以下琼脂板上，并在28℃培养3～5天；
38.sd/
–
leu/
–
trp(ddo)、sd/
–
leu/
–
trp/-ade/-his(qdo)、sd/
–
leu/
–
tr p/-ade/-his 1～5mm/l 3at(qdo 1～5mm/l 3at)。
39.所取得的有益效果：上述检测方法可根据涂板结果快速判断筛选的克隆数量，根
据菌落大小判断互作强弱和是否有自激活。
40.进一步的，步骤(3)的具体操作为：
41.(31)取1～3ml交配后培养物，加入到50～500ml的半固态培养基中混匀，转移到灭菌容器中；
42.半固态培养基包括如下质量浓度的组分：sd/
–
leu/
–
trp/-ade/-his 1.15g/l、yeast nitrogen base w/o amino acids(ynb)6.7g/l和agarose 3～10g/l；ph为5.8；使用时加入葡萄糖和3at，并使二者的终质量浓度分别为2～20％和1～5mm/l；
43.(32)冰上培养45～60min，使得液态培养基凝固成半固态胶冻状，转移到28℃培养箱中，培养5～7天；
44.(33)将培养完成的凝胶基质1000g离心10min，收集酵母细胞，用蒸馏水洗涤酵母细胞后再次离心收集，提取质粒；
45.(34)取质粒0.5～1μl，进行pcr扩增，凝胶电泳检测。
46.所取得的有益效果：步骤(3)的操作免除传统方法涂板，并且可以进行高通量操作，节省时间成本。
47.进一步的，pcr反应体系为：
48.质粒：0.5～1μl，2x mix：5μl，引物f/r：0.15/015μl，ddh2o补足至10μl。
49.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：该方法采用半固态凝胶培养基培养来代替经典方法中涂板培养的步骤，缩减了工作量，也免去挑选单克隆进行检测时的大量重复操作。
附图说明
50.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
51.图1附图为本发明实施例1酵母交配培养物形态图示，其中，左图为三叶草，右图为“米老鼠”脸状的酵母交配培养物；
52.图2附图为本发明实施例1半固态培养基酵母交配物培养图示；
53.图3附图为本发明实施例1凝胶电泳检测图示，泳道从左往右依次是marker，质粒1-质粒10的酵母筛选培养物的扩增结果。
具体实施方式
54.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
55.本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
56.实施例1
57.酵母诱饵菌株的制备，具体步骤如下：
58.(1)取1μg质粒和5μl(10mg/ml)的carrier dna。
59.(2)将质粒和carrierdna混合后加入到酵母感受态细胞中，置于在37℃恒温摇床上培养5min，摇床转速为250rpm/min。
60.(3)培养完成后加入1ml solution b，轻轻混匀后在金属浴上30℃孵育1小时。
61.solution b包括如下质量浓度的组分：200mm/l的bicine和40％的pge1000。
62.(4)28℃下4000rpm/min离心1min，弃上清，加入1ml solution c，28℃下4000rpm/min离心1min，弃上清，加入100μl solution c重悬细胞。
63.solution c包括如下质量浓度的组分：10mm/l的bicine和150mm/l的nacl。
64.(5)涂布在sd/-trp筛选培养基中，封闭膜封闭，28℃恒温培养箱中培养3天。
65.sd/-trp筛选培养基包括如下质量浓度的组分：sd/-leu/-trp 1.19g/l、yeast nitrogen base w/o amino acids 6.7g/l、leu 100mg/l和agar 20g/l；调节ph至5.8，且使用时加入葡萄糖，使葡萄糖的终质量浓度为2％。
66.酵母诱饵菌株与文库菌的杂交，具体步骤如下：
67.(6)培养完成后，挑选直径2～3mm的酵母细胞群接种到50ml sd/-trp液体培养基中，28℃下振荡培养(250rpm/min)培养至od600＝0.8，1000g离心5min，弃上清，重悬于5ml sd/-trp液体培养基中。
68.sd/-trp液体培养基包括如下质量浓度的组分：sd/-leu/-trp 1.19g/l、yeast nitrogen base w/o amino acids 6.7g/l、leu 100mg/l，调节ph至5.8，且使用时加入葡萄糖，使葡萄糖的终质量浓度为2％。
69.(7)在28℃下解冻1ml文库菌，与(6)中的酵母诱饵菌株混合，并入无菌锥形瓶中，加入45ml 2
×
ypda(含50μg/ml卡那霉素)。28℃低转速(50rpm/min)孵育20小时。
70.(8)经孵育过程20小时后，在显微镜下检查一滴培养物。如果有受精卵，则进入下一步，如果没有，则交配继续；再孵育4小时。
71.受精卵状似三叶草。
72.(9)1000g离心10min，用50ml 0.5
×
ypda(含50μg/ml卡那霉素)重新悬浮沉淀的细胞后再次1000g离心10min，重悬于10ml 0.5
×
ypda(含50μg/ml卡那霉素)中。
73.(10)从交配后培养物中，将100μl 1/1000和1/10000稀释液分别涂在以下100毫米琼脂板上，并在28℃孵育3-5天。
74.·
sd/
–
leu/
–
trp(ddo)；
75.·
sd/
–
leu/
–
trp/-ade/-his(qdo)；
76.·
sd/
–
leu/
–
trp/-ade/-his(qdo 1-5mm/l 3at)。
77.交配后培养物的培养与检测，具体步骤如下：
78.(11)取3ml交配后培养物，加入到300ml的半固态培养基中混匀，转移到灭菌容器中。
79.半固态培养基包括如下质量浓度的组分：sd/
–
leu/
–
trp/-ade/-his 1.15g/l、yeast nitrogen base w/o amino acids 6.7g/l和agarose 5/l；ph为5.8；使用时加入葡萄糖和3at，并使二者的终质量浓度分别为2％和5mm/l。
80.(12)冰上培养60min，使得液态培养基凝固成半固态胶冻状，随后小心地将容器转
移到28℃培养箱中，培养7天。
81.(13)将培养完成的凝胶基质1000g离心10min，收集酵母细胞。用蒸馏水洗涤酵母细胞后再次离心收集细胞，提取质粒。
82.(14)取质粒1μl，进行pcr扩增，凝胶电泳检测。
83.pcr反应体系为：
84.质粒：1μl，2x mix：5μl，引物f/r：0.15/015μl，ddh2o补足至10μl。
85.图3为部分质粒酵母筛选培养物的扩增结果，各泳道呈弥散状，表明含有不同长度的基因被扩增，结合测序技术捕获互作基因序列，根据泳道条带亮度和片段大小与测序所得基因序列大小进行相互印证。
86.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
87.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。