一种泥鳅抗菌肽Ma-sHep及其应用

一种泥鳅抗菌肽ma-shep及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种泥鳅抗菌肽的真核表达，抗菌活性检测及饲料添加的应用探索。


背景技术：

2.鱼类是水生低等脊椎动物，兼具先天性与适应性免疫系统。大多数的鱼类从胚胎时期就生活在水生环境中，适应性免疫系统不够完善，主要依靠先天免疫抵抗各种病害。随着水生环境的污染加重，出现了越来越多的鱼类疾病，包括细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫性疾病等。过去往往优先使用抗生素进行预防和治疗，但抗生素的滥用容易引起细菌抗药性。而抗菌肽具有广谱的抑菌活性，同时不易产生耐药性，对人体和环境副作用小，因此选择抗菌肽作为抗生素的新一代替代品。
3.抗菌肽广泛分布于自然界，并参与每个物种的先天宿主防御。当机体被病原体侵入时，抗菌肽充当了抵御侵入的第一屏障。鱼类hepcidins首先是在杂交条纹鲈鱼中被鉴定分离出来，含有8个保守的半胱氨酸残基，能够形成4个二硫键，平均等电点通常高于8，是典型的阳离子抗菌肽。鱼类hepcidin通常可以通过暴露在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌被刺激诱导，此外，肿瘤细胞系如l-1210，真菌如酿酒酵母同样可以诱导hepcidins的表达。已经证实，hepcidins对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及病毒都具有有效的抑制活性。同时，hepcidins还显示出调节多种免疫相关基因表达的能力。这充分表明了在鱼类中，hepcidins发挥先天免疫功能，充当抵御病原体入侵的第一道屏障。
4.毕赤酵母表达系统是目前研究比较清楚、应用最广的真核表达系统。使用毕赤酵母已经成功表达了数千种蛋白质，包括胰岛素、人血清白蛋白等。作为真核生物，毕赤酵母具有真核表达系统的许多优点，操作简单、价格低廉，并且能够对蛋白质进行翻译后修饰，修饰后的蛋白既可以在毕赤酵母细胞内发挥功能，也可以分泌出细胞至外环境。除了作为蛋白表达的宿主，酵母作为益生菌在水产养殖中也具有广泛的应用。酵母自身含有多种免疫刺激化合物，包括核酸、β-葡聚糖和几丁质以及甘露寡糖，同时还富含维生素、粗蛋白和肽，这些物质能够调节免疫反应并促使营养物质的消化与吸收，进而提升机体的抗菌能力与生长性能。目前还没有泥鳅抗菌肽被克隆并应用到饲料制备方面的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供泥鳅抗菌肽hepcidin全长与活化肽的基因序列。
6.本发明的再一目的是提供泥鳅抗菌肽hepcidin全长与活化肽的氨基酸序列。
7.本发明的再一目的是提供泥鳅抗菌肽hepcidin全长与活化肽的制备方法。
8.本发明的再一目的是提供一种含抗菌肽饲料的制备方法。
9.本发明的再一目的是提供抗菌肽饲料添加的应用。
10.本发明人通过基因克隆得到一个具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的抗菌肽，且该抗菌肽对温度和酸碱度十分稳定，适合于饲料的添加。
11.上述泥鳅抗菌肽hepciidn全长命名为ma-hep，活化肽命名为ma-shep。
12.所述泥鳅抗菌肽ma-hep，其氨基酸序列如序列表seq id no：1或seq id no：2所示。
13.所述泥鳅抗菌肽ma-hep基因，其核苷酸序列如序列表seq id no：3或seq id no：4所示。
14.所述泥鳅抗菌肽ma-hep的制备方法，包括如下步骤：
15.1)构建泥鳅抗菌肽ma-hep基因的重组表达载体；
16.2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得重组蛋白。
17.所述的重组载体包括ppic9k-ma-hep、ppic9k-ma-shep和ppic3.5k-ma-shep。
18.一种重组菌株，包含所述的重组表达载体ppic9k-ma-hep、ppic9k-ma-shep和ppic3.5k-ma-shep。
19.所述重组菌株为毕赤酵母km71。
20.所述泥鳅抗菌肽ma-hep在制备抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的制剂中的应用。
21.一种含抗菌肽的饲料的制备方法，将所述的表达抗菌肽ma-shep的毕赤酵母km71添加至商业饲料中。
22.所述泥鳅抗菌肽ma-shep在水产动物饲料添加中的应用。
23.本发明的有益效果：本发明克隆了泥鳅抗菌肽ma-hep基因，通过毕赤酵母对抗菌肽hepcidin进行胞内表达，将具有抗菌活性的hepcidin随着酵母饲料的喂养直接摄入鱼类体内，简单方便且成本低廉；本发明为鱼类来源的抗菌肽的饲料开发和生产提供了理论支持与技术途径。
附图说明
24.图1为ma-hep与ma-shep的蛋白表达图；
25.图中，a为sds-page检测分泌型ma-shep的诱导表达；泳道1：转化ppic9k空载的酵母km71；泳道2：转化ma-shep-ppic9k的酵母km71甲醇诱导24h；泳道3：转化ma-shep-ppic9k的酵母km71甲醇诱导48h；泳道4：转化ma-shep-ppic9k的酵母km71甲醇诱导72h；
26.b为western blot检测胞内型ma-shep的诱导表达；泳道1：转化ma-shep-ppic3.5k的酵母km71菌株(1)甲醇诱导72h；泳道2：转化ma-shep-ppic3.5k的酵母km71菌株(2)甲醇诱导72h；泳道3：转化ppic3.5k空载的酵母km71；
27.c为western blot检测分泌型ma-hep的诱导表达；泳道1：转化ma-hep-ppic3.5k的酵母km71菌株甲醇诱导72h；泳道2：转化ppic9k空载的酵母km71。
28.图2为抗菌肽ma-hep与ma-shep对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性。
29.图3为抗菌肽ma-shep对嗜水气单胞菌形态的影响；
30.图中，a用bsa处理嗜水气单胞菌1h的细胞形态；b用ma-shep处理嗜水气单胞菌1h的细胞形态。
31.图4为抗菌肽ma-shep对温度和ph的稳定性；
32.图中，a为ma-shep经不同温度处理1h后的抑菌活性；b为ma-shep经不同ph处理3h
后的抑菌活性。
33.图5为ma-shep在泥鳅体内的细菌清除作用；嗜水气单胞菌刺激后，用ma-shep或pbs处理的泥鳅血、肾中的细菌载量。星号代表差异显著(*，p＜0.05；**，p＜0.01)。
34.图6为不同饮食的泥鳅受病原体刺激后的存活率；分别用普通商业饲料、添加表达空载体酵母的饲料、添加表达ma-shep酵母的饲料饲喂三组泥鳅14天后，对泥鳅注射致死量的荧光假单胞菌，观察不同组泥鳅感染后的存活情况；虚线表示饲喂普通商业饲料的泥鳅受感染后的存活率；细实线表示饲喂添加空载体酵母饲料的泥鳅受感染后的存活率；粗实线表示饲喂添加ma-shep酵母饲料的泥鳅受感染后的存活率。
具体实施方式
35.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
36.实施例1抗菌肽ma-hep和ma-shep的cdna克隆及表达载体的构建
37.由于在进行酵母表达外源蛋白时，既可以进行胞内表达又可以进行分泌表达，因此发明人一共设计了三对特异性的引物来分别扩增胞内表达的ma-shep基因、胞外表达的ma-hep与ma-shep基因。胞内表达ma-shep：ma-shep-exf(5
’‑
tactcatacgtagccaccatgggucagtct-3’)和ma-shep-exr(5
’‑
tactcacctaggtcagtgatggtggtggtgatggaa-3’)；胞外表达ma-hep：ma-hep-exf(5
’‑
tactcatacgtatctccattcactcaagaa-3’)和ma-hep-exr(5
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tactcacctaggtcagtgatggtggtggtgatggaa-3’)；胞外表达ma-shep：ma-shep-exf(5
’‑
tactcatacgtacagtctcatttatccatg-3’)和ma-shep-exr(5
’‑
tactcacctaggtcagtgatggtggtggtgatggaa-3’)。如下进行pcr扩增：
[0038][0039]
pcr扩增步骤如下：94℃5min；94℃30s、49℃30s、72℃1min，34个循环；72℃10min。
[0040]
完成pcr扩增之后，将产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，120v电泳20min。待完成电泳后，使用凝胶小剂量回收试剂盒，按照制造商的说明对琼脂糖凝胶回收，最后获得纯化的ma-hep片段和ma-shep片段。
[0041]
将ma-hep和ma-shep片段和ppic3.5k、ppic9k质粒进行双酶切，使用的酶分别是：snabⅰ和avrⅱ。酶切的体系为：
[0042][0043]
混匀体系后，37℃反应15min。
[0044]
酶切后，对完成酶切的ppic3.5k、ppic9k载体进行检测并回收。将回收后的ma-hep、ma-shep片段与载体ppic3.5k、ppic9k进行连接，构建表达载体ma-shep-ppic3.5k、ma-shep-ppic9k和ma-hep-ppic9k。
[0045]
将上述步骤的连接产物转化感受态大肠杆菌dh5α，筛选阳性菌株，接种于含有氨苄青霉素钠的lb培养基中，37℃180rpm培养10小时，随后用试剂盒提取表达质粒。
[0046]
用sacⅰ内切酶对上述的三种表达质粒进行线性化，并按照之前的实验方法对产物检测、回收。
[0047]
通过电转化将线性化后的表达质粒转化毕赤酵母(km71)感受态细胞，电转参数为：1.5kv，25uf，200ω，电转5ms，并筛选阳性菌株。
[0048]
实施例2ma-hep与ma-shep的蛋白表达
[0049]
本试验中大量表达的蛋白包括：胞内型ma-shep、分泌型ma-shep、分泌型ma-hep。将酵母阳性菌株在mgy培养基中30℃、250rpm生长起来，按照1:100的比例，将5ml菌液转接于500ml的mgy培养基，30℃、250rpm振荡培养使其生长至对数期(od600为4)。接着在室温下离心，3000
×
g，5min，将上清液丢弃并对沉淀进行收集。用1/5原培养基体积的mm(100ml)将沉淀悬起，转入灭菌的三角瓶，放于摇床30℃、250rpm继续培养72h，同时每间隔24h向其中补充500μl 100％甲醇使其终浓度达到0.5％。培养72h后，3000
×
g、5min离心,胞内表达去除上清保留沉淀存于-80℃直至使用，分泌表达取上清存于-80℃直至使用(图1)。
[0050]
实施例3ma-hep与ma-shep的抑菌活性检测
[0051]
抗菌活性检测的目标菌种为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌和乙型链球菌。具体检测方法：将六种菌接种在lb培养基，37℃、180rpm过夜振荡；隔天将六种菌液6000rpm、5min离心，上清丢弃，用灭菌的pb培养基重悬沉淀并进行稀释；接着将10μl的细菌悬液(1
×
105cfu)、170μl灭菌的新鲜pb培养基与20μl的重组蛋白(50μg/ml)混匀，然后加入96孔板中，对照组是用酵母胞外表达的mm培养基与细菌悬液和pb培养基混合后孵育；最后将96孔板在37℃恒温下110rpm慢摇，在0h、2h、4h、8h、16h、24h六个时间点通过测定600nm处的吸光度来检测细菌密度，实验数据进行3次重复。
[0052]
最小抑菌浓度(mic)的检测：将ma-hep与ma-shep进行梯度稀释，接着细菌的处理如之前所述，将细菌悬液(1
×
105cfu)与不同浓度的ma-hep，ma-shep以及pb培养基混匀，加入到96孔板中，对照用酵母胞外表达的mm培养基替代重组蛋白；最后将96孔板在37℃恒温下110rpm慢摇，18h后测定600nm处的吸光度来检测细菌密度，从而判断不同浓度的ma-hep
与ma-shep是否具有抑菌活性，所有实验均进行3次重复。
[0053]
结果显示：抗菌肽ma-hep与ma-shep对受试菌：肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌和乙型链球菌均具有较强杀伤作用，且ma-shep作为具有活化作用的肽片段，其抑菌活性要强于全长ma-hep(图2、表1)。
[0054]
表1抗菌肽ma-hep与ma-shep对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌和乙型链球菌的最小抑菌浓度
[0055][0056]
实施例4ma-shep对嗜水气单胞菌形态的影响
[0057]
通过扫描电镜探究ma-shep对嗜水气单胞菌生物膜的影响。操作步骤如下：将嗜水气单胞菌在lb培养基中37℃、180rpm生长至对数期；3000
×
g，离心5min，将上清丢弃，菌体沉淀用pbs洗涤2次；向菌体中加入5ml ma-hep于37℃孵育1h，对照采用5ml同等浓度的bsa；随后再次离心，用pbs洗涤沉淀2次后，在2.5％的戊二醛溶液中固定6h，取少量菌液于滴片上，用不同浓度的乙醇进行梯度脱水。接着吸尽乙醇，加入叔丁醇于4℃结晶，然后通过co2进行干燥；干燥后进行镀金，接着上机观察。
[0058]
结果显示：bsa处理后的细胞呈杆状，细胞表面规则、光滑且完整；而ma-shep处理后的细胞表面粗糙、凹凸不平，并具有许多丝状物质。ma-shep明显改变了嗜水气单胞菌的细胞形态，这可能导致最终的细胞活力丧失(图3)。
[0059]
实施例5ma-shep对温度的稳定性与对ph的耐受性
[0060]
为了评估ma-shep的热稳定性，将其在4℃、20℃、40℃、60℃、80℃和100℃下处理1小时。为了评估ma-shep的酸碱耐受性，用磷酸或氢氧化钾将ma-shep的ph分别调节至2、4、6、8和10，然后在室温下孵育3小时后恢复至其初始值。处理后，如前所述测试ma-shep对嗜水气单胞菌的抗菌活性，在37℃、110rpm下孵育18小时后，测量600nm处的吸光度。未处理的ma-shep用作对照。所有实验一式三份进行。
[0061]
结果显示：ma-shep具有良好的热稳定性与酸碱耐受性(图4)。
[0062]
实施例6抗菌肽ma-shep在泥鳅体内的细菌清除作用
[0063]
为了确定ma-shep是否能够在体内清除细菌，测量了泥鳅血淋巴和肾脏中的细菌载量。在注射嗜水气单胞菌(1
×
108cfu)30分钟后，泥鳅接受注射50μl 20μg/ml的ma-shep或pbs。12小时后，取肾和血淋巴(3条泥鳅/组)来定量细菌载量。血淋巴与等体积的抗凝剂混合，肾脏用无菌水匀浆。适当稀释后，将它们涂在lb平板上，并在37℃下孵育，直到出现菌落。实验进行了三次。
[0064]
结果显示：ma-shep在体内对嗜水气单胞菌具有活性，可以对其进行一定程度的清除(图5)。
[0065]
实施例7含抗菌肽饲料的制备
[0066]
通过电动搅碎机将商业泥鳅饲料充分搅碎成粉末，然后按照10％的比例，将10g胞内表达的ma-shep与190g饲料粉末混合，并加入适量的无菌水搅拌均匀。搅拌均匀后，通过造粒机进行饲料的制作，接着在35℃下密封干燥24h，即完成饲料的准备，存于4℃直至使用。
[0067]
实施例8存活率实验
[0068]
发明人将泥鳅分为三组，组1饲喂普通的商业饲料，组2饲喂掺入胞内表达空载体的饲料，组3饲喂掺入胞内表达ma-shep的饲料。进行为期两周的饲喂，每日饲料的喂食量是泥鳅体重的3％。
[0069]
从组1、组2、组3中各随机挑选30只健康的泥鳅，向每只泥鳅注射1
×
109cfu荧光假单胞菌；将完成注射的泥鳅放入恒定水流中20-25℃饲养，每24h观察记录泥鳅的存活情况，并及时处理掉死亡泥鳅；进行7天的观察记录，对泥鳅的死亡率进行分析，实验数据进行3次重复。
[0070]
结果显示：饲喂含空载体的酵母饲料有助于提高泥鳅的免疫力；饲喂含抗菌肽ma-shep的酵母饲料极大提高了泥鳅的免疫力，保护泥鳅免受细菌的侵害(图6)。
[0071]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。