一种双靶点多聚体化合物及其应用

1.本发明属于药物领域，具体涉及一种双靶点多聚体化合物及其应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程。肿瘤的发生发展过程不仅是肿瘤细胞变化还与肿瘤微环境中多个非癌细胞密切相关。恶性肿瘤在肿瘤间和肿瘤内均具有高度不同的表型和分子特征称作肿瘤异质性，肿瘤的异质性导致在同一肿瘤实体中或原发肿瘤与转移病变间出现受体的表达水平和类型不同，并且受体表达可能随着疾病进展和治疗后诱导而改变[1]。肿瘤异质性是实现临床精准诊治、克服耐药问题的重大挑战，对临床诊断和治疗提出了挑战。传统单靶标探针通常只能反映一种生物靶标情况，不能全面可视化肿瘤细胞，一些病灶可能被遗漏导致假阴性诊断结果。因此，根据肿瘤中多个靶标的变化制备多靶点成像剂和治疗剂有望更全面反映肿瘤生物靶标的变化，达到更好的诊断和治疗效果。
[0003]
双靶点化合物或药物是由两个相同或者不同的配体通过连接子共价连接，即同型二聚体和异型二聚体。二聚体成像剂及放射治疗剂通过长度可调的柔性或刚性连接子共价连接，能够靶向同一肿瘤实体中的不同生物靶标，增加靶可视化灵敏度，解决普遍存在肿瘤异质性引起的生物靶标表达差异引起的肿瘤显像灵敏度有限的问题。二聚体与单体相比，能模拟抗体的多价相互作用获得更高的结合亲和力，导致更紧密的靶结合、更高的肿瘤摄取以及更高的肿瘤-背景比和延长的肿瘤保留时间。这种改善被认为是增加靶向受体数量，增加局部配体浓度和增加结合动力学的结果。首先，它们可以通过协同增加与靶标的结合亲和力来提高检测的灵敏度。其次，二聚体示踪剂靶向肿瘤表面或间质两种受体，提高肿瘤检测的特异性。因此，二聚体成像剂或治疗剂有望提高肿瘤诊疗的效果。
[0004]
肿瘤病灶内占体积的90％左右是由间质细胞组成，而肿瘤细胞仅占10％左右[2]。肿瘤间质的主要成分为癌相关成纤维细胞(caf，cancer associated fibroblasts)，它高表达成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein，fap)，fap是一种膜丝氨酸蛋白酶，具有二肽基肽酶及胶原酶两种活性，能降解二肽及i型胶原。fap在癌症相关的成纤维细胞和肿瘤微环境的细胞外基质中高度上调，选择性地表达于90％以上的上皮恶性肿瘤基质成纤维细胞表面，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤等，但在正常人组织中一般无表达，仅存在于宫颈和子宫内膜，在胚胎发育过程中短暂表达[3]。因此，fap 是肿瘤发生发展过程中重要的生物标靶，对肿瘤的诊断、治疗评估和研究至关重要。
[0005]
前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，psma)是一种跨膜蛋白，在近90％的前列腺癌组织中呈高表达，其表达量与肿瘤的分化程度、转移倾向以及对激素治疗的敏感性等均显著相关。此外，psma在多种实体肿瘤相关的新生血管内皮细胞中也有表达，如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、胃腺癌、肾癌及其他实体瘤，而在正常组织的新生血管中无表达。因此，psma也被认为是一种靶向肿瘤新生血管的特异性标志物。
[0006]
生长抑素受体(sstr，somatostatin receptors)是一种具有7个跨膜区段的糖蛋白，属于g蛋白偶联受体家族。sstr不仅在神经内分泌肿瘤细胞(net，neuroendocrine tumors) 表面高表达，包括胰腺内分泌肿瘤(胃泌素瘤、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、vip瘤)、垂体腺瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、类癌、甲状腺髓样癌、小细胞肺癌等，而某些非神经内分泌肿瘤，如导致肿瘤性骨软化症的肿瘤亦会高度表达sstr。因此，sstr也是个特异性肿瘤标志物。
[0007]
专利申请cn111699181a公开了一种基于fap抑制剂化合物结构，报道了正电子核素
68
ga和
18
f以及治疗核素
177
lu的标记的探针如：
68
ga-fapi-04、
18
f-nota-fapi42和
177
lu-fapi-04(如下结构所示)。但目前报道的探针存在摄取值不高，诊断的灵敏度和治疗效果有待提高，迫切需要发展新的诊疗放射性药物。
[0008][0009]
综上所述，肿瘤在发生发展过程中肿瘤细胞和肿瘤微环境中存在多个生物标志物如 psma，sstr和fap等。单个靶点成像剂只能反应肿瘤中单个生物标志物表达状况对肿瘤的诊断和预后的灵敏性受限，不能更多和更全面的显示肿瘤中多个重要生物标志物表达状况。


技术实现要素：

[0010]
为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：
[0011]
第一方面，本发明提供一种式(a)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0012][0013]
其中，m为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20)，n为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19或20)，p为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，r1包括选自以下结构：
[0014][0015]
r2包括选自以下结构：
[0016][0017]
r3包括选自以下结构：
[0018][0019]
在一些实施例中，所述式(a)所示化合物包括选自：式(c)化合物、式(d)化合物、式(e)化合物或式(f)化合物，
[0020]
[0021][0022]
其中，m为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20)，n为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，p为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
[0023]
在一些实施例中，所述式(a)化合物包括选自：nota-psma-fapi-01化合物或nota-psma-fapi-02化合物、nota-tate-fapi化合物或dota-tate-fapi化合物，
[0024]
[0025][0026]
第二方面，提供一种式(b)所示化合物或其药学上可接受的盐。
[0027]
一种式(b)所示化合物或其药学上可接受的盐，所述式(b)所示化合物包括选自：式(g)化合物、式(h)化合物、式(j)化合物、式(k)化合物或式(l)化合物，
[0028]
[0029]
[0030][0031]
其中，m为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，n为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19或20)，p为1-20的正整数(例如：1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
[0032]
在一些实施例中，一种式(b)所示化合物或其药学上可接受的盐，所述式(b)所示化合物包括选自：[
18
f]alf-psma-fapi-01、[
18
f]alf-psma-fapi-02、[
18
f]alf-tate-fapi、 [
177
lu]lu-tate-fapi或[
68
ga]ga-tate-fapi，
[0033]
[0034]
[0035][0036]
第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述式(a)化合物或其药学上可接受的盐或者第二方面所述式(b)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料。
[0037]
第四方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：第一方面所述式(a)化合物或其药学上可接受的盐，以及用于制备第二方面所述式(b)化合物或其药学上可接受的盐的辅剂。
[0038]
第五方面，本发明提供一种第一方面所述式(a)化合物或其药学上可接受的盐、第二方面所述式(b)化合物或其药学上可接受的盐、第三方面所述的药物组合物和第四方面所述的试剂盒中任一项在制备检测和/或治疗与成纤维细胞活化蛋白、前列腺特异性膜抗原和/ 或生长抑素受体相关的疾病或病症的产品中的应用。
[0039]
所述与成纤维细胞活化蛋白、前列腺特异性膜抗原和/或生长抑素受体相关的疾病或病症包括肿瘤或炎症。
[0040]
所述产品包括诊断示踪剂或治疗药物。
[0041]
所述诊断示踪剂用于正电子发射断层扫描。
[0042]
所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤、骨骼及结缔组织肉瘤、肾细胞癌、甲状腺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、胰腺内分泌肿瘤(例如胃泌素瘤、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、vip瘤)、垂体腺瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、类癌、甲状腺髓样癌、小细胞肺癌或导致肿瘤性骨软化症的肿瘤。
[0043]
所述炎症包括骨关节炎、类风湿关节炎、肉芽组织、肝纤维化、肺纤维化或肝硬化。
[0044]
有益效果
[0045]
本发明所提供的式(b)化合物具有比单靶点显像剂和治疗剂获得更高的灵敏度、更高的肿瘤摄取值和肿瘤-背景比值、更好的显像和治疗效果，并且具有在体内及体外稳定性好、特异性高、摄取量高等优点。
附图说明
[0046]
图1a为实施例14中为[
18
f]alf-psma-fapi-01在体外及体内的稳定性谱图。 [
18
f]alf-psma-fapi-01与其标准品[19f]alf-psma-fapi-01和保留时间一致纯度＞95％，在 pbs和人血清中37℃孵育2小时保持原型(原型降解率≤5％)，注射小鼠体内60分钟后血清保持示踪剂原型(原型降解率≤5％)。
[0047]
图1b为实施例14中[
18
f]alf-psma-fapi-02在体外及体内的稳定性谱图。 [
18
f]alf-psma-fapi-02与其标准品[
19
f]alf-psma-fapi-02和保留时间一致纯度＞95％，在 pbs和人血清中37℃孵育2小时保持原型(原型降解率≤5％)，注射小鼠体内60分钟后血清保持示踪剂原型(原型降解率≤5％)。
[0048]
图2a为实施例8中示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在a549-fap细胞中孵育5，15，30，60，120分钟摄取组与抑制组的曲线图。
[0049]
图2b为实施例8中示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在22rv1 细胞中孵育5，15，30，60，120分钟摄取组与抑制组的曲线图。
[0050]
图3a为实施例9中示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在 a549-fap细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育120分钟的放射性流出百分比统计图。
[0051]
图3b为实施例9中示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在22rv1 细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育120分钟的放射性流出百分比统计图。
[0052]
图3c为实施例9中[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02分别在a549fap 与22rv1细胞中孵育60分钟后，再在酸性溶液中孵育10分钟后的细胞内源化及细胞外片段摄取值。
[0053]
图4a为实施例10中在a549-fap细胞中nota-psma-fapi-01，nota-psma-fapi-02， nota-fapi-42的ic50曲线图。
[0054]
图4b为实施例10中在22rv1细胞中nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02 的ic50曲线图。
[0055]
图5a为实施例15中[
18
f]alf-psma-fapi-01，[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]fapi-42 在a549-fap荷瘤模型体内的摄取和抑制组的mip图，白色箭头所指为肿瘤位置。
[0056]
图5b为实施例15中[
18
f]alf-psma-fapi-01，[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]fapi-42 摄取组及抑制组肿瘤的放射性摄取活度与时间曲线图。
[0057]
图6a为实施例15中[
18
f]alf-psma-fapi-01，[
18
f]alf-psma-fapi-02和 [
18
f]alf-psma-bch在22rv1荷瘤模型体内的摄取和抑制组的mip图，白色箭头所指为肿瘤位置。
[0058]
图6b为实施例15中[
18
f]alf-psma-fapi-01，[
18
f]alf-psma-fapi-02和22rv1摄取组及抑制组肿瘤的放射性摄取活度与时间曲线图。
[0059]
图6c为实施例15中[
18
f]a1f-psma-fapi-01对fap高表达的a549-fap肿瘤、psma 高
表达的22rv1肿瘤及其他器官在120分钟内的摄取-时间曲线图。
[0060]
图6d为实施例15中[
18
f]alf-psma-fapi-02对fap高表达的a549-fap肿瘤、psma 高表达的22rv1肿瘤及其他器官在120分钟内的摄取-时间曲线图。
[0061]
图7为实施例14中[
18
f]alf-tate-fapi在体外及体内的稳定性检测结果图。 [
18
f]alf-tate-fapi的纯度＞95％，在pbs和人血清中37℃孵育2小时保持原型(原型降解率≤5％)，注射小鼠体内60分钟后血清保持示踪剂原型(原型降解率≤5％)。
[0062]
图8a为实施例11中[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap中孵育5，15，30，60，120 分钟摄取组与抑制组的曲线图。
[0063]
图8b为实施例11中[
18
f]alf-tate-fapi在ar42j中孵育5，15，30，60，120分钟摄取组与抑制组的图。
[0064]
图9a为实施例16中[
18
f]alf-tate-fapi摄取组在u87荷瘤模型体内的pet显像的 mip图，箭头所指为肿瘤位置。
[0065]
图9b为实施例16中[
18
f]alf-tate-fapi在肿瘤、肾脏、肝脏、肌肉、肺、心脏和脑的放射性摄取活度与时间曲线图。
[0066]
图10a为实施例16中[
18
f]alf-tate-fapi摄取组在a549-fap荷瘤模型体内的pet显像的mip图，箭头所指为肿瘤位置。
[0067]
图10b为实施例16中[
18
f]alf-tate-fapi肿瘤、肾脏、肝脏、肌肉、肺、心脏和脑的放射性摄取活度与时间曲线图。
[0068]
图11为本发明式(b)化合物的作用示意图。
[0069]
图12为实施例11中[
177
lu]lu-tate-fapi的摄取组和抑制组在fap高表达的a549-fap 细胞和sstr高表达的ar42j细胞中的摄取值；其中a图为示踪剂[
177
lu]lu-tate-fapi的摄取组和抑制组在fap高表达的a549-fap细胞中的摄取值，b图为示踪剂 [
177
lu]lu-tate-fapi的摄取组和抑制组在sstr高表达的ar42j细胞中的摄取值。
[0070]
图13a为实施例12中[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap细胞中细胞孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育120分钟的放射性流出百分比统计图。
[0071]
图13b为实施例12中[
18
f]alf-tate-fapi在ar42j细胞中细胞孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育120分钟的放射性流出百分比统计图。
[0072]
图14a为实施例12中[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap细胞中孵育5，15，30，60， 120分钟后，内源化所占百分比统计图。
[0073]
图14b为实施例12中[
18
f]alf-tate-fapi在u87mg细胞中孵育5，15，30，60， 120分钟后，内源化所占百分比统计图。
[0074]
图15a为实施例12中[
177
lu]lu-tate-fapi在a549-fap细胞中细胞孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育0.5，1，2，4，6，24小时的放射性流出百分比统计图。
[0075]
图15b为实施例12中[
177
lu]lu-tate-fapi在ar42j细胞中细胞孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育0.5，1，2，4，6，24小时的放射性流出百分比统计图。
[0076]
图16a为实施例12中[
177
lu]lu-tate-fapi在a549-fap细胞中孵育0.5，1，2，4， 6，24小时后，内源化所占百分比统计图。
[0077]
图16b为实施例12中[
177
lu]lu-tate-fapi在ar42j细胞中孵育0.5，1，2，4，6， 24小时后，内源化所占百分比统计图。
negative表示fap低表达细胞。
[0086]
术语“mip”是指最大密度投影。
[0087]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0088]
本发明中，“药学可接受的”的意思为：在充分的医学判断范围内，适于与人和低等动物组织接触而不存在不适宜的毒性、刺激性、过敏反应及类似反应、而且具有相当的合理获益/风险比率的物质或化合物。
[0089]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0090]
本发明中，类似“式(1)化合物”、和“式(1)所示的化合物”、“化合物1”、“化合物 (1)”以及“化合物1”的表述，表示的是同一个含义，其他化合物的命名以此类推。
[0091]
本发明中，类似“[
18
f]alf-psma-fapi-01”、“[
18
f]alf-psma-fapi-01化合物”、“化合物[
18
f]alf-psma-fapi-01”和“示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01”的表述，均表示同一含义；其他化合物的描述一次类推。
[0092]
本发明中，各化合物简称的结构如下：
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]
具体实施方式
[0097]
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
[0098]
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
[0099]
dsc表示n，n
′‑
二琥珀酰亚胺碳酸酯；dcc表示二环己基碳二亚胺；dipea表示n，n
‑ꢀ
二异丙基乙胺；dmf表示n，n-二甲基甲酰胺；hobt表示1-羟基苯并三唑；dic表示n，n
‑ꢀ
二异丙基碳二亚胺；tis表示三异丙基硅烷；dcm表示二氯甲烷；piperidine表示哌啶；tfa 表示三氟乙酸；i2表示碘；meoh表示甲醇。
[0100]
ul表示微升；ml表示毫升。
[0101]
[
18
f]alf-psma-bch是已知psma单配体显像剂：
[0102][0103]
实施例1：nota-psma-fapi-01化合物的制备
[0104]
[0105][0106]
1)式(1)化合物的制备
[0107]
将ctc树脂(471mg，0.5mmol，sub＝1.06)浸泡在二氯甲烷(20毫升)中30分钟，加入 fmoc-lys(dde)-oh(533mg，1mmol)和dipea(359μl，2mmol)室温搅拌3小时后，再加甲醇 (0.5ml)继续搅拌30分钟，除去二氯甲烷，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌30分钟后，除去溶剂，再用dmf洗5遍，得到式(1) 化合物。
[0108]
2)式(2)化合物的制备
[0109]
取步骤1)所得式(1)化合物，加入dsc(256mg，1mmol)、dipea(359ul，2mmol)和 dmf(20ml)，室温搅拌3小时后除去dmf，并用dmf洗涤三遍，再加 h-glu(otbu)-otbu-hcl(296mg，1mmol)、dipea(359ul，2mmol)和dmf(20ml)室温搅拌2 小时，除去dmf，并用dmf洗涤三遍，然后加入体积百分比为2％的水合肼dmf溶液(20 ml)室温搅拌30分钟，除去溶剂，再用dmf洗涤5遍，得到式(2)化合物。
[0110]
3)式(3)化合物的制备
[0111]
取步骤2)所得式(2)化合物，加入fmoc-d-2-nal-oh(658mg，1.5mmol)， hobt
(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到式(3)化合物。
[0112]
4)式(4)化合物的制备
[0113]
取步骤3)所得式(3)化合物，加入fmoc-d-2-nal-oh(658mg，1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到式(4)化合物。
[0114]
5)式(5)化合物的制备
[0115]
取步骤4)所得式(4)化合物，加入fmoc-d-2-nal-oh(658mg，1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到式(5)化合物。
[0116]
6)式(6)化合物的制备
[0117]
取步骤5)所得式(5)化合物，加入nota(623mg，1.5mmol)，hobt(203mg，1.5mmol)， dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时后除去dmf，并用dmf洗涤三遍，再加h-glu(otbu)-otbu-hcl(296mg，1mmol)、dipea(359ul，2mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌2小时，除去dmf，再用dmf洗树脂三遍，得到式(6)化合物。
[0118]
7)式nota-psma-fapi-01合物的制备
[0119]
取步骤6)所得式(6)化合物，加入化合物7(880mg，1.5mmol)，hobt(203mg，1.5mmol)， dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去dmf，用dmf洗涤三遍，再分别用二氯甲烷和甲醇洗两遍，减压干燥，再加入tfa∶tis∶水的体积比为95∶2.5∶2.5的混合液10ml，室温搅拌2.5小时后过滤，滤液倒入100ml冷乙醚中，大量固体初产品析出，离心分离初产品后用半制备分离法分离得到nota-psma-fapi-01化合物。取适量 nota-psma-fapi-01化合物进氢谱、碳谱、质谱和高效液相色谱检测，测得质谱结果：分子式为c
72h94
f2n
14o19
，[m 2h

]
2
＝749.9；测得高效液相色谱结果：纯度＞98％。 nota-psma-fapi-01的氢谱、碳谱结果如下：1h nmr(300mhz，(cd3)2so，25℃，d)： 12.2-12.7(m，5h)，8.30-8.55(m，4h)，7.40-8.05(m，14h)，6.40-6.50(m，2h)，4.93(s，1h)，4.20-4.56(m，6h)，3.18-3.54(m，18h)，2.30-2.75(m，19h)，2.04-2.10(m，5h)，1.25-1.73(m， 20h)。
13
c nmr(75mhz，(cd3)2so，25℃，d)：178.4，177.4，174.7，173.6，172.6，171.0，167.8， 165.4，157.6，148.8，142.8，137.1，133.7，131.8，127.6，126.3，125.1，124.0，117.4，116.2，106.9， 99.6，67.7，60.5，59.0，57.5，55.9，42.3，41.1，39.2，37.8，35.9，34.5，32.8，29.7，26.9，25.5，22.3。
[0120]
实施例2：式nota-psma-fapi-02化合物的制备
[0121][0122]
取实施例1步骤6)所得式(6)化合物，加入化合物8(880mg，1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，用dmf洗涤三遍，再分别用二氯甲烷和甲醇洗两遍，减压干燥，再加入tfa∶tis∶水的体积比为95∶2.5∶2.5的混合液10ml，室温搅拌2.5小时后过滤，滤液倒入100ml冷乙醚中，大量固体初产品析出，离心分离初产品后用半制备分离法分离得到 nota-psma-fapi-02化合物。取适量nota-psma-fapi-02化合物进行氢谱、碳谱、质谱和高效液相色谱检测，测得质谱结果：分子式为c
79h106
f2n
16o20
，[m 2h

]
2
＝819.8；测得高效液相色谱结果：纯度＞98％。nota-psma-fapi-02的氢谱、碳谱结果如下：1h nmr(300 mhz，(cd3)2so，25℃，d)：12.2-12.7(m，5h)，
8.30-8.55(m，4h)，7.40-8.05(m，14h)，6.40-6.50 (m，2h)，4.93(s，1h)，4.40-4.66(m，4h)，4.00-4.10(m，2h)，3.70-3.86(m，4h)，3.10-3.54(m， 18h)，2.30-2.75(m，27h)，2.04-2.10(m，3h)，1.25-1.93(m，22h)。
13
c nmr(75mhz，(cd3)2so， 25℃，d)：178.4，177.4，174.7，173.6，171.7，168.7，165.4，157.6，148.8，142.8，137.1，134.0，131.8， 127.5，125.1，123.3，117.4，116.2，106.9，99.6，73.1，60.5，58.2，56.8，54.8，49.9，42.3，39.2，37.5， 35.9，34.5，31.5，29.8，26.9，25.5，22.3.
[0123]
实施例3：式nota-tate-fapi化合物的制备
[0124]
[0125][0126]
式(9)化合物的制备
[0127]
将ctc树脂(471mg，0.5mmol，sub＝1.06)浸泡在二氯甲烷(20毫升)中30分钟，加入 fmoc-thr(tbu)-oh(397mg，1mmol)和dipea(359μl，2mmol)室温搅拌3小时后，再加甲醇 (0.5ml)继续搅拌30分钟，除去二氯甲烷，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌30分钟后，除去溶剂，再用dmf洗5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0128]
步骤a：上一步得到的化合物中加入fmoc-cys(trt)-oh(878mg，1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0129]
步骤b：上一步得到的化合物中加入fmoc-thr(tbu)-oh(1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0130]
步骤c：上一步得到的化合物中加入fmoc-lys(dde)-oh(1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0131]
步骤d：上一步得到的化合物中加入fmoc-dtrp(boc)-oh(1.5mmol)， hobt(203mg，
1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0132]
步骤e：上一步得到的化合物中加入fmoc-cys(trt)-oh(1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0133]
步骤f：上一步得到的化合物中加入fmoc-dphe-oh(1.5mmol)，hobt(203mg，1.5mmol)， dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0134]
步骤g：上一步得到的化合物中加入fmoc-gly-oh(1.5mmol)，hobt(203mg，1.5mmol)， dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0135]
步骤h：上一步得到的化合物中加入fmoc-lys(boc)-oh(1.5mmol)， hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul，1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去 dmf，并用dmf洗涤三遍，再加体积百分比为20％的哌啶dmf溶液(20ml)，室温搅拌 30分钟后，除去溶剂，并用dmf洗涤5遍，得到的化合物直接用于下一步反应。
[0136]
取步骤h得到的化合物加入nota(623mg，1.5mmol)，hobt(203mg，1.5mmol)，dic(232ul， 1.5mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌1.5小时，除去dmf，并用dmf洗涤三遍，再加入 tfa∶tis∶水的体积比为95∶2.5∶2.5的混合液10ml，室温搅拌2.5小时后过滤，滤液倒入100ml 冷乙醚中，大量固体析出，离心分离得到沉淀物，将沉淀物溶于甲醇溶液中，再加入i2室温搅拌12小时后旋干，用半制备hplc纯化得到式(9)化合物，测得质谱结果：分子式为 c
79h110n16o21
s2，[m 2h

]
2
＝842.6。
[0137]
所得式(9)化合物，加入式(7)化合物(623mg，1.5mmol)，hosu(173mg，1.5mmol)，dcc(232ul，1.5mmol)，dipea(359μl，2mmol)和dmf(20ml)，室温搅拌2.5小时后除去 dmf，然后加入体积百分比为2％的水合肼dmf溶液(20ml)室温搅拌30分钟，除去溶剂。混合物用半制备hplc纯化得到化合物式nota-tate-fapi。取适量nota-tate-fapi 化合物进行氢谱、碳谱、质谱和高效液相色谱检测，测得质谱结果：分子式为c
90h116
f2n
20o23
s2， [m 2h

]
2
＝974.4；测得高效液相色谱结果：纯度＞98％。nota-tate-fapi的氢谱、碳谱结果如下：1h nmr(300mhz，(cd3)2so，25℃，d)：12.4-13.0(m，3h)，10.79(s，1h)，8.60-9.05(m， 4h)，7.70-8.35(m，7h)，6.90-7.40(m，19h)，6.60-6.70(m，2h)，5.28-5.37(m，2h)，4.40-4.90(m， 12h)，3.70-4.12(m，8h)，2.30-3.50(m，36h)，2.00-2.10(m，2h)，1.16-1.70(m，20h)。
13
c nmr (75mhz，(cd3)2so，25℃，d)：177.6，175.4，172.5，170.7，167.8，165.4，155.7，148.8，142.8，136.6，134.0，130.2，127.7，125.9，123.0，121.7，119.8，118.8，117.4，115.8，111.1，109.7，106.9，99.6，67.7， 66.7，64.7，62.5，61.4，60.5，58.0，56.8，55.9，54.8，42.0，38.6，36.3，34.5，32.8，31.5，28.6，24.2， 22.3，19.0。
[0138]
实施例4：式dota-tate-fapi化合物的制备
[0139]
将实施例3中的nota换为dota，其余操作同实施例3相同的反应步骤，制备得到 dota-tate-fapi化合物，测得质谱结果：分子式为c
94h123
f2n
21o25
s2，[m 3h

]
3
＝684.1；测得高效液相色谱结果：纯度＞98％。dota-tate-fapi的氢谱、碳谱结果如下：1h nmr(300 mhz，(cd3)2so，25℃，d)：12.4-13.0(m，4h)，10.79(s，1h)，8.60-9.05(m，4h)，7.70-8.35(m， 7h)，6.90-7.40(m，19h)，6.60-6.70(m，2h)，5.28-5.37(m，2h)，4.40-4.90(m，12h)，3.70-4.12 (m，10h)，2.30-3.50(m，40h)，2.00-2.10(m，2h)，1.16-1.70(m，20h)。
13
c nmr(75mhz， (cd3)2so，25℃，d)：177.4，175.4，174.7，172.5，171.7，170.7，167.8，165.4，155.7，148.8，142.8， 136.6，134.0，130.2，127.7，125.9，123.0，121.7，119.8，118.8，117.4，115.8，111.1，109.7，106.9， 99.6，67.7，66.7，64.7，62.5，61.4，60.5，58.0，56.8，55.9，54.8，42.0，38.6，36.3，34.5，32.8，31.5， 28.6，24.2，22.3，19.0。
[0140]
实施例5：[
18
f]alf-psma-fapi-01、[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]alf-tate-fapi 的制备
[0141]
以nota-psma-fapi-01化合物为前体，用allinone型氟-18多功能合成模块或手动标记进行示踪剂的制备，其步骤包括：
[0142]
1)回旋加速器通过
18
o(p，n)
18
f核反应生产得到
18
f-离子，
18
f-离子通过qma柱富集俘获；
[0143]
2)用0.5m的醋酸钠溶液(ph＝3.9，0.3ml)溶液洗脱qma柱；洗脱的
18
f-离子进入到反应瓶中；
[0144]
3)反应瓶中加入前体溶液(40nmol nota-psma-fapi-0前体溶解于300μl的二甲基亚砜)和10μl的2mm alcl3溶液(0.2m的醋酸钠溶液，ph＝4.0)，加热到90-110℃反应10～20 分钟后，得到含产物的反应液，冷却至室温；
[0145]
4)加入10ml水稀释，得稀释后的反应液；
[0146]
5)稀释后的反应液经c18(或hlb)柱将产物吸附在c18柱上；
[0147]
6)再用水淋洗c18(或hlb)柱两次，每次10ml，除去c18柱中残留的
18
f-离子；
[0148]
7)用2ml乙醇/水混合液(体积比1∶1)洗脱c18(或hlb)柱中产物到20ml生理盐水的中转瓶中；
[0149]
8)再用10ml生理盐水洗脱c18(或hlb)柱到20ml生理盐水的中转瓶中；
[0150]
9)中转瓶中产物经无菌滤膜后得到示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01。
[0151]
从制备得到
18
f-离子开始，在40～50分钟内成功制备示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01，衰变矫正后放射化学产率为15％～35％，放射化学纯度＞98％，比活度为12-150gbq/μmol，与其标准品在hpcl中保留时间一致。
[0152]
示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]alf-tate-fapi的制备方法：分别将前体替换为 nota-psma-fapi-02、nota-tate-fapi，其他操作与[
18
f]alf-psma-fapi-01相同，分别得到[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]alf-tate-fapi。从制备得到
18
f-离子开始，在40～50 分钟内成功制备，[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]alf-tate-fapi的衰变矫正后放射化学产率15％～35％，放射化学纯度＞98％，比活度为12-150gbq/μmol.
[0153]
实施例6：[
177
lu]lu-tate-fapi的制备
[0154]
[
177
lu]lu-tate-fapi的制备以dota-tate-fapi化合物为前体，手动标记进行示踪剂的制备，其步骤包括：
[0155]
1)购买的
177
lucl3溶液(3.7gbq)中加入醋酸钠溶液(0.4m，ph＝5.5，0.4ml)和龙胆酸(4mg)，得混合溶液；
[0156]
2)把步骤1)所得混合溶液加入到前体dota-tate-fapi(1024μg，50nmol)中，加热到90-100℃反应30～60分钟后，得到含[
177
lu]lu-tate-fapi的反应液，冷却至室温；
[0157]
hplc检测放射化学纯度＞95％，生理盐水稀释后直接使用。
[0158]
实施例7：[
68
ga]ga-tate-fapi的制备
[0159]
[
68
ga]ga-tate-fapi的制备以dota-tate-fapi化合物为前体，手动标记进行示踪剂的制备，其步骤包括：
[0160]
1)用4ml的稀盐酸(0.05mol/l)淋洗锗镓(
68
ge/
68
ga)发生器到前体化合物dota-tate-fapi (25μg)和醋酸钠溶液(0.25m，1ml)中，得到混合溶液；
[0161]
2)将步骤1)所得混合溶液加热到90-100℃反应10～15分钟后，得到含 [
68
ga]ga-tate-fapi的反应液；
[0162]
3)稀释后的反应液经c18(或hlb)柱将产物吸附在c18柱上；
[0163]
4)再用2ml水淋洗c18(或hlb)柱一次，除去c18柱中残留的
68
ga离子；
[0164]
5)用0.8ml乙醇洗脱c18(或hlb)柱中产物到10ml生理盐水的中转瓶中；
[0165]
6)再用8ml生理盐水洗脱c18(或hlb)柱到10ml生理盐水的中转瓶中；
[0166]
7)中转瓶中产物经无菌滤膜后得到示踪剂[
68
ga]ga-tate-fapi。
[0167]
8)从淋洗得到
68
ga离子开始，在20～30分钟内成功制备示踪剂[
68
ga]ga-tate-fapi，衰变矫正后放射化学产率为55％～75％，放射化学纯度＞98％，比活度为25-50gbq/μmol，与其标准品在hpcl中保留时间一致。
[0168]
实施例8：[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02细胞摄取和抑制实验
[0169]
将a549细胞用慢病毒转染，成为具有fap高表达的a549-fap细胞；22rv1细胞psma 受体高表达。将a549-fap细胞和22rv1细胞，分别铺在六孔板中(细胞计数板计数细胞数， 0.4-0.8mio cells/well)，用不含胎牛血清的新鲜培养基进行培养，取放射性示踪剂 [
18
f]alf-psma-fapi-01或[
18
f]alf-psma-fapi-02(0.5μci/well)，按表1进行处理和分组。在37℃孵育5，15，30，60和120分钟后(每组4孔)，除去放射性培养液，细胞再用pbs (1ml)洗两遍细胞后用含0.2％sds的naoh溶液(1ml，1m)裂解细胞，裂解液用γ计数仪测计数。
[0170]
表1：细胞摄取和抑制实验处理方式和结果
[0171][0172]
结果如图2a和图2b，示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在fap 高表达的a549-fap细胞和psma高表达的22rv1细胞均高摄取。在a549-fap细胞中分别加入两种放射性示踪剂和fap抑制剂dota-fapi-04后，摄取均被显著抑制；在22rv1细胞中分别加入两种放射性示踪剂和psma抑制剂2-pmpa后，摄取均显著被抑制。说明示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在体外细胞中对fap和psma两个靶点均具有特异性高摄取。
[0173]
2-pmpa：2-(phosphonomethyl)pentanedioic acid)psma抑制剂
[0174][0175]
dota-fapi-04是fap抑制剂
[0176][0177]
实施例9：细胞流出和内源化实验
[0178]
流出实验：将经过慢病毒转染的具有fap高表达的a549-fap细胞或22rv1细胞铺在六孔板中(细胞计数板计数细胞数，0.4-0.8mio cells/well)，用1ml不含胎牛血清的新鲜培养基进行培养，每孔中分别加0.5μci放射性[
18
f]alf-psma-fapi-01或[
18
f]alf-psma-fapi-02， 37℃孵育60分钟后，移去放射性培养液，加无放射性培养液分别再孵育0，15，30，60，和 120min后，移去培养液，细胞用冷的pbs溶液(1ml)洗两遍。加naoh的sds溶液消融细胞后，用γ计数器测放射性。
[0179]
内源化实验：将经过慢病毒转染的具有fap高表达的a549-fap细胞或22rv1细胞铺在六孔板中(细胞计数板计数细胞数，0.4-0.8mio cells/well)，用1ml不含胎牛血清的新鲜培养基进行培养，每孔中分别加0.5μci放射性[
18
f]alf-psma-fapi-01或 [
18
f]alf-psma-fapi-02，37℃孵育60分钟后，移去放射性培养液，细胞用冷的pbs溶液 (1ml)洗两遍后加入1ml甘氨酸盐酸溶液(1m，ph＝2.2)，37℃孵育10分钟后，收集甘氨酸盐酸溶液，细胞用冷的pbs溶液(1ml)洗两遍。加naoh的sds溶液消融细胞后，用γ计数器分别测得甘氨酸盐酸溶液和naoh的sds溶液放射性。
[0180]
结果：如图3a、图3b和图3c所示，[
18
f]alf-psma-fapi-01或[
18
f]alf-psma-fapi-02 在a549-fap细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育的120分钟内， [
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02的流出分别为35％和19％； [
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02同样操作步骤在22rv1细胞中的流出分别为55％和40％。[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02在a549-fap细胞中的内源化分别为82％和84％；在22rv1细胞中的内源化分别为52％和51％。由此可见，在 a549-fap和22rv1细胞中[
18
f]alf-psma-fapi-01比[
18
f]alf-psma-fapi-02流出更快，两种示踪剂在a549-fap细胞中均比22rv1细胞中流出更少。细胞中
18
f-bi-fapi只有少数流出，放射性在细胞中长时间滞留。内源化实验结果显示[
18
f]alf-psma-fapi-01和 [
18
f]alf-psma-fapi-02在a549-fap和22rv1细胞中内源化百分比类似，两种示踪剂在 a549-fap细胞中的内源化率高于22rv1细胞。
[0181]
实施例10：nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02对fap和psma的亲和力测试
[0182]
(1)nota
‑‑
psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02对fap的亲和力测试操作：将a549-fap细胞铺在二十四孔板中，实验前除去培养液，分别向细胞中加入不同浓度不含胎牛血清的新鲜培养基溶解的nota-psma-fapi-01(10-11
mol/l，10-10
mol/l， 10-9
mol/l，10-8
mol/l，10-7
mol/l，10-6
mol/l，10-5
mol/l，10-4
mol/l)、nota-psma-fapi-02 (10-11
mol/l，10-10
mol/l，10-9
mol/l，10-8
mol/l，10-7
mol/l，10-6
mol/l，10-5
mol/l，10-4
mol/l) 或nota-fapi-42(10-11
mol/l，10-10
mol/l，10-9
mol/l，10-8
mol/l，10-7
mol/l，10-6
mol/l， 10-5
mol/l，10-4
mol/l)，每孔细胞中再加入放射性示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01(0.5 μci/well)，所有细胞在37℃孵育60分钟后(每组4孔)，除去放射性培养液，细胞再用pbs (1ml)洗三遍细胞后用含0.2％sds的naoh溶液(1ml，1m)裂解细胞，裂解液用γ计数仪测计数。分别计算出nota-psma-fapi-01、nota-psma-fapi-02和nota
ꢀ‑
fapi-42对fap的ic
50
值。
[0183]
(2)nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02对psma的亲和力测试
[0184]
操作：将22rv1细胞铺在二十四孔板中，实验前除去培养液，向细胞中加入不同浓度不含胎牛血清的新鲜培养基溶解的nota-psma-fapi-01(10-11
mol/l，10-10
mol/l，10-9
mol/l， 10-8
mol/l，10-7
mol/l，10-6
mol/l，10-5
mol/l，10-4
mol/l)和nota-psma-fapi-02(10-11 mol/l，10-10
mol/l，10-9
mol/l，10-8
mol/l，10-7
mol/l，10-6
mol/l，10-5
mol/l，10-4
mol/l)，每孔细胞中再加入放射性示踪剂[
18
f]alf-psma-bch(0.5μci/well)，所有细胞在37℃孵育 60分钟后(每组4孔)，除去放射性培养液，细胞再用pbs(1ml)洗三遍细胞后用含0.2％ sds的naoh溶液(1ml，1m)裂解细胞，裂解液用γ计数仪测计数。分别计算出 nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02对psma的ic
50
值。
[0185]
结果：如图4a和图4b所示，nota-psma-fapi-01、nota-psma-fapi-02和 nota-fapi-42对fap的ic
50
分别是1.68nmol/l，5.75nmol/l和14.45nmol/l， nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02与fap的结合力强度分别是nota-fapi-42 的8.6和2.5倍，由此可见nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02与fap的结合力高于单体nota-fapi-42。
[0186]
nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02对psma的ic
50
分别是33.73nmol/l 和9.77nmol/l，由此可见nota-psma-fapi-01和nota-psma-fapi-02与psma的具有强结合力，ic
50
值都在纳摩尔级。综上，新研制的化合物nota-psma-fapi-01和 nota-psma-fapi-02具有同时对fap和psma强结合力的特性。
[0187]
实施例11：[
18
f]aif-tate-fapi或[
177
lu]lu-tate-fapi细胞摄取和抑制实验
[0188]
将a549细胞用慢病毒转染，成为具有fap高表达的a549-fap细胞。ar42j细胞是已知sstr高表达细胞(j nucl med 2010；51：454-461.doi：10.2967/jhumed.109.066902)。将 a549-fap和ar42j细胞，分别铺在六孔板中(细胞计数板计数细胞数，0.4-0.8mio cells/well)，用不含胎牛血清的新鲜培养基进行培养，按表2所述处理方式，摄取值或抑制组取放射性化合物[
18
f]alf-tate-fapi(0.5μci/well)，在a549-fap或ar42j细胞中37℃孵育5，15，30， 60和120分钟(每组4孔)；摄取值或抑制组取放射性化合物[
177
lu]lu-tate-fapi(0.5 μci/well)，在a549-fap或ar42j细胞中37℃孵育0.5，1，2，4，6，24小时。放射性化合物孵育以上时间后除去放射性培养液，细胞用pbs(1ml)洗两遍细胞后用含0.2％sds的 naoh溶液(1ml，1m)裂解细胞，裂解液用γ计数仪测计数。
[0189]
表2：细胞摄取和抑制实验处理方式和结果
[0190][0191][0192]
结果：
[0193]
从图8a和图8b结果可知，示踪剂[
18
f]alf-tate-fapi在fap高表达的a549-fap细胞高摄取，加入fap抑制剂dota-fapi-04后摄取显著降低；示踪剂[
18
f]alf-tate-fapi在 sstr高表达的ar42j细胞中也高摄取，加入sstr抑制tate后摄取显著降低。说明示踪剂[
18
f]alf-tate-fapi在体外细胞中对fap和sstr两个靶点均具有高特异性。
[0194]
从图12可知，示踪剂[
177
lu]lu-tate-fapi在fap高表达的a549-fap细胞和sstr高表达的ar42j细胞中均高摄取。在a549-fap细胞中分别加入两种放射性示踪剂和fap抑制剂dota-fapi-04后，摄取均被显著抑制；在ar42j细胞中分别加入两种放射性示踪剂和 sstr
抑制剂tate后，摄取均显著被抑制。说明化合物[
177
lu]lu-tate-fapi在体外细胞中对fap和sstr两个靶点均具有特异性高摄取。
[0195]
tate：sstr抑制剂
[0196][0197]
实施例12：细胞流出和内源化实验
[0198]
分别取[
18
f]alf-tate-fapi和[
177
lu]lu-tate-fapi同实施例9所述细胞流出和内源化实验方法进行试验。
[0199]
流出实验：将经过慢病毒转染的具有fap高表达的a549-fap细胞或22rv1细胞铺在六孔板中(细胞计数板计数细胞数，0.4-0.8mio cells/well)，用1ml不含胎牛血清的新鲜培养基进行培养，每孔中分别加0.5μci放射性[
18
f]alf-tate-fapi或[
177
lu]lu-tate-fapi，37℃孵育60分钟后，移去放射性培养液，加无放射性培养液[
18
f]alf-tate-fapi示踪剂孵育0，15分钟，30分钟，60分钟，和120分钟或[
177
lu]lu-tate-fapi示踪剂孵育0.5小时，1小时，2小时，4小时，6小时和24小时后，移去培养液，细胞用冷的pbs溶液(1ml)洗两遍。加naoh的sds溶液消融细胞后，用γ计数器测放射性。
[0200]
内源化实验：将经过慢病毒转染的具有fap高表达的a549-fap细胞或22rv1细胞铺在六孔板中(细胞计数板计数细胞数，0.4-0.8mio cells/well)，用1ml不含胎牛血清的新鲜培养基进行培养，每孔中分别加0.5μci放射性[
18
f]alf-tate-fapi或[
177
lu]lu-tate-fapi，37℃孵育不同时间后，移去放射性培养液，细胞用冷的pbs溶液(1ml)洗两遍后加入1ml甘氨酸盐酸溶液(1m，ph＝2.2)，37℃孵育10分钟后，收集甘氨酸盐酸溶液，细胞用冷的pbs 溶液(1ml)洗两遍。加naoh的sds溶液消融细胞后，用γ计数器分别测得甘氨酸盐酸溶液和naoh的sds溶液放射性。
[0201]
实验结果：如图13a所示，[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育的120分钟，流出放射性百分比为35％；如图13b所示， [
18
f]alf-tate-fapi在ar42j细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育的120分钟，流出放射性百分比为72％；如图14a所示，[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap细胞中的内源化为90％；如图14b所示，[
18
f]alf-tate-fapi在ar42j细胞中的内源化为70％。如图15a 所示，[
177
lu]lu-tate-fapi在a549-fap细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育的24小时，流出放射性百分比从2小时的20％增加到24小时的62％；如图15a所示， [
177
lu]lu-tate-fapi在a549-fap细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育的24小时，流出放射性百分比从2小时的20％增加到24小时的62％；如图15b所示， [
177
lu]lu-tate-fapi在ar42j细胞中孵育60分钟后，换用无放射性培养液孵育的24小时，流出放射性百分比从2小时的41％增加到24
小时的80％。如图16a所示， [
177
lu]lu-tate-fapi在a549-fap细胞中的内源化从0.5小时开始到24小时持续为90％左右；如图16b所示，[
177
lu]lu-tate-fapi在ar42j细胞中的内源化从0.5小时开始到24小时持续为80％左右。由此可见，异聚化合物[
18
f]alf-tate-fapi和[
177
lu]lu-tate-fapi在 a549-fap和ar42j细胞中高度内源化，在a549-fap细胞中流出比ar42j细胞流出较慢。
[0202]
实施例14：稳定性实验
[0203]
1)体外稳定性实验：
[0204]
取示踪剂(20μl，60μci)，分别置于1ml生理盐水和小鼠血清中，置于37℃下，孵育120min后，用radio-hplc测定其放射化学纯度。
[0205]
结果：如图1a、图1b和图7所示，示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01， [
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]alf-tate-fapi体外生理盐水和血清中37℃下120min，三种示踪剂的降解率≤5％。
[0206]
2)体内稳定性实验：
[0207]
将c57小鼠分别尾静脉注射示踪剂(0.2ml，14.8mbq)，注射60分钟后，移除眼球取血，血液中加入0.5ml乙腈混合后，离心，将离心后的上清液注入hplc中检测。
[0208]
结果：如图1a、图1b和图7所示，示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01，[
18
f]alf-psma-fapi-02和[
18
f]alf-tate-fapi在体内小鼠血液中60min，三种示踪剂的降解率≤5％。
[0209]
实施例15：小动物pet-ct显像
[0210]
a549-fap荷瘤裸鼠模型摄取组：分别取150μci的[
18
f]alf-psma-fapi-01或 [
18
f]alf-psma-fapi-02或[
18
f]fapi-42经尾静脉注射到fap高表达的a549-fap荷瘤裸鼠体内，分别用小动物pet-ct动态扫描显像。
[0211]
a549-fap荷瘤裸鼠模型抑制组：分别取[
18
f]alf-psma-fapi-01或 [
18
f]alf-psma-fapi-02(150μci)和dota-fapi-04(50μg/只)，经尾静脉注射到fap高表达的a549-fap荷瘤裸鼠体内；用小动物pet-ct动态扫描显像。
[0212]
22rv1荷瘤裸鼠模型摄取组：分别取150μci的[
18
f]alf-psma-fapi-01或 [
18
f]alf-psma-fapi-02或[
18
f]alf-psma-bch经尾静脉注射到psma高表达的22rv1荷瘤裸鼠体内，分别用小动物pet-ct动态扫描显像。
[0213]
22rv1荷瘤裸鼠模型抑制组：分别取150μci的[
18
f]alf-psma-fapi-01或 [
18
f]alf-psma-fapi-02或[
18
f]alf-psma-bch和2-pmpa(50μg/只)经尾静脉注射到psma 高表达的22rv1荷瘤裸鼠体内；用小动物pet-ct动态扫描显像。
[0214]
结果：
[0215]
(1)从图5a和图5b中可以看出，摄取组中示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和 [
18
f]alf-psma-fapi-02在fap高表达的a549-fap肿瘤部位特异性高聚集。在a549-fap 肿瘤中[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02的摄取值与已保护的示踪剂 [
18
f]fapi-42相比摄取值显著增高(图5b)，示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和 [
18
f]alf-psma-fapi-02比[
18
f]fapi-42的肿瘤显像更清晰(图5a)。抑制组中，加入fap抑制剂dota-fapi-04后的a549-fap肿瘤对[
18
f]alf-psma-fapi-01和 [
18
f]alf-psma-fapi-02摄取值显著减弱，体内抑制效果均显著，说明[
18
f]alf-psma-fapi-01 和[
18
f]alf-psma-fapi-02在体内对fap具有高特异性。
[0216]
(2)从图6a和图6b中可以看出，摄取组中示踪剂[
18
f]alf-psma-fapi-01和 [
18
f]alf-psma-fapi-02在psma高表达的22rv1肿瘤部位特异性高聚集。在22rv1肿瘤中[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02的摄取值与已保护的示踪剂 [
18
f]alf-psma-bch相比摄取值显著增高(图6b)。抑制组中，加入psma抑制剂2-pmpa 后的22rv1肿瘤对[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02摄取值显著减弱，体内抑制效果均显著，说明[
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]a1f-psma-fapi-02在体内对psma 具有高特异性。
[0217]
(3)从图6c和6d中可以看出，120分钟内的各组织活度与时间曲线显示示踪剂 [
18
f]alf-psma-fapi-01和[
18
f]alf-psma-fapi-02对fap高表达的a549-fap肿瘤和psma 高表达的22rv1肿瘤均有高摄取并且随时间增加摄取逐渐增加，而在其他器官(如肾脏、心脏、脑、肌肉、肺和肝脏)中放射性随着血流快速达到峰值后摄取随时间逐渐减少，120 分钟内随着时间延长肿瘤病灶显像越清晰。两种示踪剂均主要通过肾脏途径代谢。
[0218]
实施例16：[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap和u87荷瘤裸鼠体内pet显像
[0219]
a549-fap和u87荷瘤裸鼠模型摄取组：取150μci的[
18
f]alf-tate-fapi经尾静脉注射到fap高表达的a549-fap和肿瘤微环境fap表达的u87荷瘤裸鼠体内，分别用小动物 pet-ct动态扫描显像。
[0220]
结果：
[0221]
(1)从图9a和图10a中可以看出，示踪剂[
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap和u87 荷瘤鼠中肿瘤部位特异性高聚集。
[0222]
(2)从图9b和图10b中，120分钟内的各组织活度与时间曲线显示示踪剂 [
18
f]alf-tate-fapi在a549-fap和u87荷瘤鼠中肿瘤病灶均有高摄取并且随时间增加摄取逐渐增加，而在其他器官(如肾脏、心脏、脑、肌肉、肺和肝脏)中放射性随着血流快速达到峰值后摄取随时间逐渐减少，120分钟内随着时间延长肿瘤病灶显像越清晰。示踪剂[
18
f]alf-tate-fapi主要通过肾脏途径代谢。
[0223]
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。