一种RNA长片段靶向测序方法

一种rna长片段靶向测序方法
技术领域
1.本发明属于rna测序领域，具体涉及一种rna长片段靶向测序方法。


背景技术：

2.对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的sars、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室。病原微生物的基因片段都是特异的，有别于其他种或属，检测其特有的基因片段序列可用来鉴别病原微生物。随着科技的发展，基因检测技术逐渐代替其它检测技术，成为临床检验科和基础实验室对病原体的主流检测技术。
3.随着基因组学技术的发展，高通量测序技术(next-generation sequencing，ngs)越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的方向飞速发展。其一般过程包括，提取样本核酸序列，进行或不进行特定基因靶点的聚合酶链反应扩增，随后构建测序文库进行序列检测，将检测到的核酸序列与目标病原体的参比基因或基因组序列进行比对分析，根据设定的检测阈值，判断是否存在该病原体。但现有的ngs平台对实验室环境要求比较苛刻，样本制备过程相对复杂，测序运行时间较长，读长较短，并且在测序完成后只能在高性能计算设备上进行数据分析，限制了该平台在非实验室环境下的现场检测应用。
4.纳米孔靶向测序技术(nanopore cas9-targeted sequencing，ncats)是一种代表性的基因检测技术，该方法不依赖于传统的微生物培养，能够快速、客观地检测出临床样本中的疑似致病微生物(包括细菌、真菌和病毒)。该检测项目基于第三代纳米孔测序技术(nanopore sequencing)平台，是新一代单分子实时测序技术，其以单分子dna通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。其主要特点是读长更长，平均读长可达20kb，最长可达到mb级别；结合高效的基因组核酸提取和建库方式，测序结果经过生物信息学处理分析后与专业医学微生物数据库进行比对分析，可以获得样本中所有微生物的种属信息以及所携带的耐药和毒力基因信息。该方法检测范围广，可高效检测静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等多种临床样本中的致病微生物，适用于不明原因发热、疑难感染和急危重症的诊断。但是，一方面，ncats是一种针对基因组的测序方法，不适合转录组测序；另一方面，ncats还存在数据产量低和靶向效率低的问题。
5.因此，亟需开出出一种长读长、数据产量高、靶向效率高的rna长片段靶向测序方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种长读长、数据产量高、靶向效率高的rna长片段靶向测序方法。
7.本发明提供了一种rna的纳米孔靶向测序方法，所述方法包括以下步骤：
8.(i)取待检样本，提取rna，构建cdna；
9.(ii)在cdna中加入碱性磷酸酶，反应，反应后于高温下孵育使碱性磷酸酶失活；
10.(iii)在上一步反应后的体系中加入靶向目标序列的cas9-grna复合物，反应；
11.(iv)在上一步反应后的体系中加入不耐热蛋白酶，反应，反应后于高温下孵育使不耐热蛋白酶失活；
12.(v)连接纳米孔测序接头，利用纳米孔测序平台进行测序。
13.进一步地，步骤(i)中，所述cdna是rna经过反转录、pcr扩增后得到的；
14.和/或，所述rna为总rna。
15.进一步地，步骤(ii)中，所述反应的时间为20-40min，优选为30min，温度为35-40℃，优选为37℃；
16.所述高温下孵育的时间为3-8min，优选为5min，温度为70-90℃，优选为80℃；
17.所述cdna与碱性磷酸酶的比例为(1-3)μg：(10-20)u，优选为2μg：15u。
18.进一步地，步骤(iii)中，所述cas9-grna复合物与cdna的比例为，优选为(8-12)pmol：(1-3)μg，优选为10pmol：2μg；
19.所述反应的时间为10-20min，优选为15min，温度为35-40℃，优选为37℃。
20.进一步地，步骤(iv)中，所述不耐热蛋白酶为qiagen protease蛋白酶。
21.进一步地，步骤(iv)中，所述不耐热蛋白酶与cdna的比例为(0.5-2.5)mau：(1-3)μg，优选为1.5mau：2μg。
22.au为蛋白酶活性单位，1000mau为1au。
23.进一步地，步骤(iv)中，所述反应的时间为2-8min，优选为5min，温度为45-65℃，优选为56℃。
24.进一步地，步骤(iv)中，所述高温下孵育的时间为10-20min，优选为15min，温度为60-80℃，优选为70℃。
25.进一步地，步骤(v)中，所述连接纳米孔测序接头的方法包括以下步骤：在上一步反应后的体系中加入datp和dna聚合酶，反应，然后加入接头连接缓冲液、纳米孔测序接头、t4 dna连接酶和水，反应，得到连接了纳米孔测序接头的序列。
26.进一步地，步骤(v)中，所述利用纳米孔测序平台进行测序的方法包括以下步骤：向连接了纳米孔测序接头的序列中加入测序缓冲液和微珠，混合均匀，加入纳米孔测序芯片中，于纳米孔测序仪上进行测序。
27.进一步地，步骤(i)和步骤(ii)中，还包括以下步骤y：利用末端转移酶将双脱氧核糖核苷酸连接到cdna的3’末端。
28.进一步地，所述利用末端转移酶将双脱氧核糖核苷酸连接到cdna的3’末端的方法包括以下步骤：将cdna、双脱氧核糖核苷酸、钴盐、末端转移酶和反应缓冲液混合，反应，反应后于高温下孵育使末端转移酶失活。
29.进一步地，所述双脱氧核糖核苷酸为ddatp、ddctp、ddgtp或ddttp，优选为ddgtp；
30.所述钴盐为cocl2；
31.所述cdna、双脱氧核糖核苷酸、钴盐、末端转移酶的比例为(1-3)μg：(3-7)nmol：(10-15)nmol：(6-14)u，优选为2μg：5nmol：12.5nmol：10u；
32.所述反应的时间为1-3h，优选为2h，温度为35-40℃，优选为37℃；
33.所述高温下孵育的时间为10-30min，优选为20min，温度为65-85℃，优选为75℃。
34.本发明首次发现，在利用cas9切割目标序列后，不耐热蛋白酶处理可以将cas9-grna复合物从dna切割位点移除，从而使被切割的dna完全断开以暴露出切割末端。本发明的方法在利用cas9切割目标序列后增加了不耐热蛋白酶处理步骤，显著提高了测序数据产量。与不进行不耐热蛋白酶移除cas9蛋白的方法相比，本发明的rna长片段靶向测序方法的数据产量提高了4.5倍。
35.在增加不耐热蛋白酶处理步骤的基础上，本发明进一步利用末端转移酶在dna 3’端引入双脱氧核糖核苷酸，发现该测序方法可以高效获取目标区域的序列信息，相比于现有的方法在靶向效率和数据产量上均有显著提升。
36.本发明的rna长片段靶向测序方法克服了现有技术中测序方法的问题，同时具备长读长、数据产量高、靶向效率高的优势，降低了测序成本，适合用于rna长片段的靶向测序，应用前景广阔。
37.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
38.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
39.图1为本发明实施例1的rna长片段靶向测序方法的示意图。
40.图2为利用不耐热蛋白酶处理(图中表示为“实验组”)、不进行不耐热蛋白酶处理(图中表示为对照2)和不进行cas9-grna复合物切割(图中表示为对照1)对移除cas9蛋白并暴露dna切口的效果比较。
41.图3为本发明实施例1的rna长片段靶向测序方法(图中表示为“蛋白酶消化”组)和对照例1的省略利用不耐热蛋白酶移除cas9蛋白的测序方法(图中表示为“空白对照”组)对数据产量的效果比较。
42.图4为实施例2的测序方法(图中表示为“本发明”)、对照例1的测序方法(图中表示为“原方法”)和对照例2的测序方法(图中表示为“全rna测序”)的测序孔状态比较。
43.图5为实施例2的测序方法(图中表示为“本发明”)、对照例1的测序方法(图中表示为“原方法”)和对照例2的测序方法(图中表示为“全rna测序”)的相对数据产量比较。
44.图6为实施例2的测序方法(图中表示为“本发明”)、对照例1的测序方法(图中表示为“原方法”)和对照例2的测序方法(图中表示为“全rna测序”)的靶向效率比较。
45.图7为实施例2的测序方法(图中表示为“本发明”)、对照例1的测序方法(图中表示为“原方法”)和对照例2的测序方法(图中表示为“全rna测序”)的相对有效数据产量比较。
具体实施方式
46.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
47.实施例1：rna长片段靶向测序方法
48.1构建全长cdna文库
49.提取总rna，通过模板转换技术和pcr扩增生成cdna，具体操作如下：
50.总rna提取：
51.取5
×
106细胞重悬于1ml trizol(invitrogen,15596026)中。室温孵育5min后加入200μl氯仿并迅速混匀。12000g于4℃离心10min并收集上层清液。向收集的液体中加入500μl异丙醇，迅速混匀后室温孵育10min使rna沉淀。12000g于4℃离心10min后移除液体。加入1ml 75％乙醇使沉淀悬浮以漂洗沉淀。7500g于4℃离心5min℃后彻底移除液体。开盖室温干燥沉淀，待沉淀边缘呈透明状使加入20μl无核酸酶的水溶解沉淀，此液体为提取的rna。利用qubit检测rna浓度，并-80℃保存rna备用。
52.反转录：
53.在12μl反应体系中加入2μg从实验材料提取的rna、2μl浓度为10μm的反转录引物(序列为5
’‑
acgagcatcagcagcatacgat
30
vn-3’(seq id no:1))、2μl浓度为10mm的dntp和水并混匀。于65℃反应5min后立即置于冰上。之后在上述反应混合物中加入4μl反转录反应缓冲液5
×
rt buffer(thermo scientific，ep0751)、1μl rna酶抑制剂rnaseout(invitrogen，10777019)，2μl浓度为10μm的模板转换引物(序列为5
’‑
agagacagattgcgcaatgrgrgrg-3’(seq id no:2)，rg为核糖核苷酸)和1μl反转录酶maxima h-minus reverse transcriptase(thermo scientific,ep0751)使总反应体系为20μl并混匀。按照以下温度程序进行反应：
[0054][0055]
pcr扩增：
[0056]
在50μl反应体系中加入25μl dna聚合酶vahts hifi amplification mix(vazyme,n616)、6μl上一步所得到的反转录产物、5μl浓度为5μm的扩增引物(序列为5
’‑
agagacagattgcgcaatg-3’(seq id no:3)，5
’‑
acgagcatcagcagcatacga-3’(seq id no:4))和水并混匀。按照以下温度程序进行反应，得到cdna。
[0057][0058]
2去除cdna 5’端的磷酸基团
[0059]
在30μl体系中加入2μg cdna、3μl反应缓冲液cutsmart buffer(neb，b7204)和3μl碱性磷酸酶(neb，m0525，5u/μl)，于37℃反应30min，之后于80℃孵育5min使碱性磷酸酶失活。
[0060]
3利用cas9切割目标序列
[0061]
将10μl(总量为10pmol)靶向目标序列的cas9-grna复合物加入上一步反应混合物中，于37℃反应15min，切割目标dna。
[0062]
其中，cas9-grna复合物组装过程如下：
[0063]
将1μl浓度为100μm的tracrrna(genscript)、1μl浓度为100μm的crrna混合物(特异识别序列为5
’‑
ucccaaagugcugggauuac-3’(seq id no:5)，5
’‑
gccucggccucccaaagugc-3’(seq id no:6)，5
’‑
ucugagaucaaacugcaagg-3’(seq id no:7)，5
’‑
uuucauccaugucccuacaa-3’(seq id no:8))和8μl缓冲液cutsmart buffer(neb,b7204)混合，于95℃孵育5min后置于室温孵育5min使grna形成；取3μl grna并加入1.4μl缓冲液cutsmart buffer(neb,b7204)、9.4μl水和1.2μl稀释五倍的cas9蛋白hifi cas9 nuclease v3(idt，1081060)并混匀，室温孵育20min以组装cas9-grna复合物。组装好的cas9-grna复合物浓度为1μm，将其置于冰上备用。
[0064]
4利用不耐热蛋白酶移除cas9蛋白
[0065]
向上一步反应混合物中加入1.5μl不耐热蛋白酶qiagen protease(qiagen，19155，1mau/μl)，于56℃反应5min，之后于70℃孵育15min使该蛋白酶失活。
[0066]
5加测序接头并测序
[0067]
向上一步反应混合物中加入1μl浓度为10mm的datp(neb,n0440)和1μl dna聚合酶(vazyme,p101-d1-ac)，于72℃反应5min。然后加入20ul的接头连接缓冲液4
×
lnb(ont,sqk-lsk110)、3.5μl的纳米孔测序接头amx-f(ont,sqk-lsk110)、10μl的t4 dna连接酶(neb,m2200)和水使总反应体系为80μl并混匀。室温反应10min使测序接头连接，然后纯化dna。
[0068]
dna纯化步骤为：向反应后的体系中加入80μl水和64μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)并混匀。室温孵育10min后置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体。将样品从磁力架上取出，加入250μl sfb(ont,sqk-lsk110)重悬磁珠，再将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体，重复此漂洗步骤一次。开盖室温干燥磁珠30s，之后加入17μl洗脱缓冲液eb(ont,sqk-lsk110)并混匀。室温孵育10min后将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后收集液体，此液体为纯化后的样品，用于下一步上机测序。
[0069]
向纯化后的样品中加入37.5μl测序缓冲液sqb(ont,sqk-lsk110)和20.5μl的上样微珠loading beads(ont,sqk-lsk110)并混匀。将此混合物加入纳米孔测序芯片minion flow cell r9.4.1中，于纳米孔测序仪gridion上进行测序。
[0070]
实施例2：rna长片段靶向测序方法
[0071]
1构建全长cdna文库
[0072]
按照与实施例1步骤1相同的方法得到cdna。
[0073]
2利用末端转移酶将双脱氧核糖核苷酸加到cdna的3’末端
[0074]
在50μl体系中，加入2μg cdna、0.5μl浓度为10mm的ddgtp(roche,03732738001)、5
μl浓度为2.5mm的cocl2(neb，m0315)、5μl的10
×
末端转移酶反应缓冲液(neb，m0315)和0.5μl的末端转移酶(neb，m0315，20u/μl)，于37℃反应2h，之后于75℃孵育20min使末端延伸酶失活。然后纯化反应后的cdna。
[0075]
cdna纯化步骤为：向反应后的体系中加入40μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)并混匀，室温孵育10min后置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体。将样品保持于磁力架上，加入200μl 70％的乙醇漂洗30s后移除液体，重复此步骤一次。开盖室温干燥磁珠，待磁珠晾干至表面呈磨砂状时，将样品从磁力架上取出，加入25μl水重悬磁珠。室温孵育10min后将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后收集液体，此液体为纯化后的样品。
[0076]
3去除cdna 5’端的磷酸基团
[0077]
在30μl体系中加入24μl上一步纯化后的cdna、3μl反应缓冲液cutsmart buffer(neb,b7204)和3μl碱性磷酸酶(neb，m0525，5u/μl)，于37℃反应30min，之后于80℃孵育5min使碱性磷酸酶失活。
[0078]
4利用cas9切割目标序列
[0079]
将10μl(总量为10pmol)靶向目标序列的cas9-grna复合物加入上一步反应混合物中，于37℃反应15min，切割目标dna。
[0080]
5利用不耐热蛋白酶移除cas9蛋白
[0081]
向上一步反应混合物中加入1.5μl不耐热蛋白酶qiagen protease(qiagen，19155，1mau/μl)，于56℃反应5min，之后于70℃孵育15min使该蛋白酶失活。
[0082]
6加测序接头并测序
[0083]
向上一步反应混合物中加入1μl浓度为10mm的datp(neb,n0440)和1μl dna聚合酶(vazyme,p101-d1-ac)，于72℃反应5min。然后加入20ul的接头连接缓冲液4
×
lnb(ont,sqk-lsk110)、3.5μl的纳米孔测序接头amx-f(ont,sqk-lsk110),10μl的t4 dna连接酶(neb,m2200)和水使总反应体系为80μl并混匀。室温反应10min使测序接头连接，然后纯化dna。
[0084]
dna纯化步骤为：向反应后的体系中加入80μl水和64μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)并混匀。室温孵育10min后置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体。将样品从磁力架上取出，加入250μl sfb(ont,sqk-lsk110)重悬磁珠，再将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体，重复此漂洗步骤一次。开盖室温干燥磁珠30s，之后加入17μl洗脱缓冲液eb(ont,sqk-lsk110)并混匀。室温孵育10min后将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后收集液体，此液体为纯化后的样品，用于下一步上机测序。
[0085]
向纯化后的样品中加入37.5μl测序缓冲液sqb(ont,sqk-lsk110)和20.5μl的上样微珠loading beads(ont,sqk-lsk110)并混匀。将此混合物加入纳米孔测序芯片minion flow cell r9.4.1中，于纳米孔测序仪gridion上进行测序。
[0086]
以下为对照测序方法。
[0087]
对照例1：直接将ncats应用的cdna测序方法
[0088]
1构建全长cdna文库
[0089]
按照与实施例1步骤1相同的方法，得到cdna。
[0090]
2去除cdna 5’端的磷酸基团
[0091]
在30μl体系中加入2μg cdna、3μl反应缓冲液cutsmart buffer(neb，b7204)和3μl碱性磷酸酶(neb，m0525，5u/μl)，于37℃反应30min，之后于80℃孵育5min使碱性磷酸酶失活。
[0092]
3利用cas9切割目标序列
[0093]
将10μl(总量为10pmol)靶向目标序列的cas9-grna复合物加入上一步反应混合物中，于37℃反应15min，切割目标dna。
[0094]
4加测序接头并测序
[0095]
向上一步反应混合物中加入1μl浓度为10mm的datp(neb,n0440)和1μl dna聚合酶(vazyme,p101-d1-ac)，于72℃反应5min。然后加入20ul的接头连接缓冲液4
×
lnb(ont,sqk-lsk110)、3.5μl的纳米孔测序接头amx-f(ont,sqk-lsk110),10μl的t4 dna连接酶(neb,m2200)和水使总反应体系为80μl并混匀。室温反应10min使测序接头连接，然后纯化dna。
[0096]
dna纯化步骤为：向反应后的体系中加入80μl水和64μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)并混匀。室温孵育10min后置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体。将样品从磁力架上取出，加入250μl sfb(ont,sqk-lsk110)重悬磁珠，再将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体，重复此漂洗步骤一次。开盖室温干燥磁珠30s，之后加入17μl洗脱缓冲液eb(ont,sqk-lsk110)并混匀。室温孵育10min后将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后收集液体，此液体为纯化后的样品，用于下一步上机测序。
[0097]
向纯化后的样品中加入37.5μl测序缓冲液sqb(ont,sqk-lsk110)和20.5μl的上样微珠loading beads(ont,sqk-lsk110)并混匀。将此混合物加入纳米孔测序芯片minion flow cell r9.4.1中，于纳米孔测序仪gridion上进行测序。
[0098]
对照例2：总rna测序方法
[0099]
构建全长cdna文库的操作步骤与实施例1步骤1相同，后续测序方法按照ont公司官方推荐的操作步骤进行，具体如下：
[0100]
1构建全长cdna文库
[0101]
按照与实施例1步骤1相同的方法得到cdna。
[0102]
2cdna末端修复
[0103]
在60μl体系中加入400ng cdna、3.5μl dna修复缓冲液ffpe dna repair buffer(neb，m6630)、2μl dna修复酶nebnext ffpe dna repair mix(neb，m6630)、3.5μl末端修复缓冲液nebnext ultra ii end prep reaction buffer(neb，e7546)和3μl末端修复酶nebnext ultra ii end prep enzyme mix(neb，e7546)并混匀。于20℃反应30min，之后于65℃孵育5min使酶失活。
[0104]
纯化反应后的dna产物。具体步骤如下：向反应后的体系中加入48μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)并混匀，室温孵育10min后置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体；将样品保持于磁力架上，加入200μl 70％的乙醇漂洗30s后移除液体，重复此漂洗步骤一次；开盖室温干燥磁珠，待磁珠晾干至表面呈磨砂状时，将样品从磁力架上取出，加入60μl水并混匀，室温孵育10min；最后将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力
架上后收集液体，此液体为纯化后的样品。
[0105]
3加测序接头并测序
[0106]
在100ul反应体系中加入200ng末端修复后的cdna、25ul的接头连接缓冲液4
×
lnb(ont,sqk-lsk110)、5μl的纳米孔测序接头amx-f(ont,sqk-lsk110)和10μl的t4 dna连接酶(neb,m2200)并混匀。室温反应10min使测序接头连接，之后纯化dna。
[0107]
dna纯化步骤为：向反应后的体系中加入40μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)并混匀。室温孵育10min后置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体。将样品从磁力架上取出，加入250μl sfb(ont,sqk-lsk110)重悬磁珠，再将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后移除液体，重复此漂洗步骤一次。开盖室温干燥磁珠30s，之后加入17μl洗脱缓冲液eb(ont,sqk-lsk110)并混匀。室温孵育10min后将样品置于磁力架上，待磁珠完全吸附于磁力架上后收集液体，并用qubit检测dna浓度。此液体为纯化后的样品，用于下一步上机测序。
[0108]
取100ng测序样品并加入37.5μl测序缓冲液sqb(ont,sqk-lsk110)和一定体积的上样微珠loading beads(ont,sqk-lsk110)使总体积为75μl并混匀。将此混合物加入纳米孔测序芯片minion flow cell r9.4.1中，于纳米孔测序仪gridion上进行测序。
[0109]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0110]
实验例1：不耐热蛋白酶移除cas9蛋白从而使目标dna切口暴露的效果验证
[0111]
1、实验方法
[0112]
分组：分为实验组、对照1组、对照2组。其中，对照1组相比于实验组不加cas9-grna复合物和不耐热蛋白酶处理，对照2组相比于实验组不经不耐热蛋白酶处理。
[0113]
(1)实验组：琼脂糖凝胶电泳检测不耐热蛋白酶对移除cas9蛋白的效果，操作如下：
[0114]
获得带目标序列的dna片段：
[0115]
利用引物(正向：5
’‑
agttctcaagctgggatccgt-3’(seq id no:9)，反向：5
’‑
gtgagagtctctgaatacaggcagt-3’(seq id no:1)0)在人类基因组上扩增一段长度为2.1kb的dna片段，该dna含有两个拷贝的目标序列(5
’‑
tcccaaagtgctgggattac-3’(seq id no:11))。
[0116]
pcr反应体系:
[0117]
试剂体积q5 high-fidelity 2x master mix(neb，m0492s)25μl10μm正向引物2.5μl10μm反向引物2.5μl基因组dna10ngh2o将总体积补齐到50μl
[0118]
扩增程序：
[0119][0120]
切割目标dna并移除cas9蛋白：
[0121]
对于实验组，在10μl反应体系中加入180ng扩增的dna、1μl cas9-grna复合物、1μl反应缓冲液cutsmart buffer(neb，b7204)和水并混匀，37℃孵育15min。然后加入1μl不耐热蛋白酶qiagen protease(qiagen，19155，1mau/μl)于56℃孵育5min。
[0122]
琼脂糖凝胶电泳检测：
[0123]
取5μl上述反应后的样品，加入1％的琼脂糖胶，于120v电压电泳15min。
[0124]
(2)对照1组：琼脂糖凝胶电泳检测不经cas9-grna和不耐热蛋白酶处理的dna片段，操作如下：
[0125]
参照实验组操作，区别在于用水代替cas9-grna复合物和不耐热蛋白酶。即在10μl反应体系中加入180ng扩增的dna、1μl反应缓冲液cutsmart buffer(neb，b7204)和水并混匀，37℃孵育15min。然后加入1μl水于56℃孵育5min。同样取5μl样品与实验组一同进行琼脂糖凝胶电泳。
[0126]
(3)对照2组：琼脂糖凝胶电泳检验被cas9-grna切割但不经不耐热蛋白酶处理dna片段，操作如下：
[0127]
参照实验组操作，区别在于用水代替不耐热蛋白酶。即在10μl反应体系中加入180ng扩增的dna、1μl cas9-grna复合物、1μl反应缓冲液cutsmart buffer(neb，b7204)和水并混匀，37℃孵育15min。然后加入1μl水于56℃孵育5min。同样取5μl样品与实验组一同进行琼脂糖凝胶电泳。
[0128]
2、实验结果
[0129]
理论上，带目标序列的dna片段可以被cas9-grna复合物切割为三段。如图2所示，在对照2中，dna片段被cas9-grna复合物切割，但不进行不耐热蛋白酶处理，该dna片段在电泳过程中保持完整，大小与不进行cas9-grna复合物切割的dna片段(对照1)大小相同，证明切割dna后该复合物依然包裹于切割位点。在实验组中，dna片段被cas9-grna复合物切割后，进行不耐热蛋白酶处理，dna片段显示完全断开。
[0130]
本实验结果证明了不耐热蛋白酶处理可以将cas9-grna复合物从dna切割位点移除，从而使被切割的dna完全断开以暴露出切割末端。
[0131]
实验例2：不耐热蛋白酶处理增加靶向测序数据产量的效果验证
[0132]
1、实验方法
[0133]
分组：“蛋白酶消化”组表示实施例1的测序方法；“空白对照”组表示对照例1的测序方法，相比于“蛋白酶消化”组，区别仅在于省略不耐热蛋白酶处理。
[0134]
为了客观比较两种方法的测序产量，这里将“空白对照”组和“蛋白酶消化”组分别加上测序条形码，于同一张芯片上进行测序。最后计算出相对数据产量。
[0135]
加测序条形码及接头连接方法如下：
[0136]“空白对照”组和“蛋白酶消化”组分别参照对照例1和实施例1直到加入datp和dna聚合酶于72℃反应5min。各取32.5μl两组样品，分别加入10μl t4 dna连接酶缓冲液5
×
buffer(neb,m2200)、2.5μl测序条形码(ont,exp-nbd114)和5μl的t4 dna连接酶(neb,m2200)并混匀。室温反应10min使测序条形码连接，然后分别用40μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)纯化dna，并用qubit检测dna浓度。各取1μg“空白对照”组和“蛋白酶消化”组dna并混合，加入20μl t4 dna连接酶缓冲液5
×
buffer、5μl的纳米孔测序接头amii(ont,exp-nbd114),10μl的t4 dna连接酶(neb,m2200)和水使总反应体系为100μl并混匀。室温反应10min使测序接头连接，然后纯化dna。dna纯化步骤与实施例2中接头连接后的dna纯化相同，差别在于用50μl ampure xp磁珠(beckman，a63881)。
[0137]
相对数据产量指相对于“空白对照”组的数据产量，计算时将“蛋白酶消化”组的数据产量除以“空白对照”组的数据产量，这样“空白对照”组的数据产量被标准化为1。
[0138]
2、实验结果
[0139]
结果如图3所示，与不进行不耐热蛋白酶移除cas9蛋白的方法相比，本发明实施例1的rna长片段靶向测序方法的数据产量提高了4.5倍。
[0140]
上述实验结果表明，本发明的rna长片段靶向测序方法中，利用不耐热蛋白酶移除cas9蛋白，显著提高了测序数据产量。
[0141]
实验例3：本发明实施例2的rna长片段靶向测序方法与现有的测序方法比较
[0142]
1、实验方法
[0143]
分组：“本发明”表示实施例2的测序方法；“原方法”表示对照例1的测序方法；“全rna测序”表示对照例2的测序方法。
[0144]
比较三组实验的纳米孔状态、相对数据产量、有效数据产量和靶向效率。
[0145]
纳米孔状态主要分为三种，即“空闲的”、“测序接头”、“dna”。“空闲的”表示该纳米孔处于可用状态，但没有被dna占据；“测序接头”表示：该纳米孔被测序接头占据；“dna”表示：该纳米孔被dna占据，正在测序dna。高质量的测序实验意味着纳米孔状态组成以“dna”为主，“空闲的”和“测序接头”均占比较少。
[0146]
相对数据产量指相对于“原方法”的数据产量。
[0147]
有效数据产量指含有目标序列的数据量，故相对于“原方法”的有效数据产量是将各组数据除以“原方法”的数据。
[0148]
靶向效率计算方法为：含目标序列的读段占所有输出的读段的百分比。
[0149]
2、实验结果
[0150]
在纳米孔测序中，正在测序dna的纳米孔占据70％以上表示该测序实验效果良好，理论上数据产量能达到测序芯片的正常水平。对照例2的总rna测序方法已成熟建立，在实验操作无误的情况下，该方法在纳米孔测序状态和数据产量上均可以达到良好的效果，故这里将此方法作为衡量上述参数的阳性对照。如图4所示，对照例2的总rna测序方法的“dna”纳米孔平均百分比为92.0％，说明该实验操作正常。
[0151]
如图4所示，相比于对照例1直接将ncats应用于cdna的测序方法，本发明的rna长片段靶向测序方法中测序孔被接头占据以及测序孔处于空闲状态的情况极大降低，测序dna的纳米孔占比从对照例1方法的7.0％提升至93.0％，与阳性对照的92.0％相当。
[0152]
如图5所示，本发明rna长片段靶向测序方法的数据产量相比于对照例1平均提升
了39.3倍，与阳性对照相当。
[0153]
在靶向测序中，绝对理想的靶向效率理论值为100％。如图6所示，对照例2的总rna测序方法中，带目标序列的读段占所有测序读段的10.4％，靶向效率仅10.4％；对照例1直接将ncats应用于cdna的测序方法的靶向效率为59.0％；本发明rna长片段靶向测序方法的靶向效率高达89.5％。与对照例1直接将ncats应用于cdna的测序方法方法相比，本发明测序方法的靶向效率显著提高，最终使有效数据产量提升了59.7倍(图7)。
[0154]
上述结果说明了本发明实施例2的rna长片段靶向测序方法可以高效获取目标区域的序列信息，相比于现有的方法在靶向效率和数据产量上均有显著提升。
[0155]
综上，本发明提供了一种rna长片段靶向测序方法，属于rna测序领域。本发明首次发现，在利用cas9切割目标序列后，不耐热蛋白酶处理可以将cas9-grna复合物从dna切割位点移除，从而使被切割的dna完全断开以暴露出切割末端。本发明的方法在利用cas9切割目标序列后增加了不耐热蛋白酶处理步骤，显著提高了测序数据产量。与不进行不耐热蛋白酶移除cas9蛋白的方法相比，本发明测序方法的数据产量提高了4.5倍。本发明的rna长片段靶向测序方法克服了现有技术中测序方法的问题，同时具备长读长、数据产量高、靶向效率高的优势，降低了测序成本，适合用于rna长片段的靶向测序，应用前景广阔。