靶向SOAT1蛋白的化合物在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用

靶向soat1蛋白的化合物在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用
1.本技术是申请号为202110371783.4、申请日为2021年04月7日、发明创造名称为“靶向soat1蛋白的化合物在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明属于医药技术领域，具体涉及了一组靶向胆固醇稳态靶标soat1蛋白的小分子药物，具有治疗肝癌的前景。


背景技术：

3.胆固醇是维持细胞稳态的必要脂质成分。它除了作为胆汁酸、类固醇激素和维生素d的合成前体外，还是细胞膜的主要组成成分，富含于脂筏并在细胞信号导中起重要作用。研究发现肿瘤细胞发生、发展过程中存在胆固醇代谢重编程，胞内胆固醇水平显著上调，其代谢产物异常堆积。前期，本课题组通过对101例早期肝细胞癌及配对癌旁组织样本的蛋白质组和磷酸化蛋白质组研究发现，目前临床上认为的早期肝细胞癌患者，可分成三种蛋白质组亚型，而不同亚型的患者具有不同的预后特征(s-i，s-ii，s-iii)，术后需要对应不同的治疗方案。其中，对第三类肝细胞癌患者的蛋白质组数据研究发现，胆固醇代谢通路发生了重编程，其中候选药靶胆固醇酯化酶(soat1)的高表达具有最差的预后风险，这表明soat1蛋白在调节胆固醇稳态及在肝癌发生发展中发挥重要作用。
4.近年来，靶向soat1蛋白的抗肿瘤药物开发也在不断进行，如avasimibe最先被用于治疗动脉粥样硬化的调血脂药，最近不断被发现对于胰腺癌，肝癌等也具有治疗效果；另外，如nevanimibe,cl-976等小分子先后被报道出和soat1蛋白的共晶三维结构并具有抑制蛋白活性的作用。但是这些研究都还处于临床前研究，因此，围绕影响胆固醇稳态的靶点soat1进行药物筛选，并结合肿瘤细胞和胆固醇稳态分析验证，发现具有抗肿瘤效应的新的小分子，这为肝癌的靶向治疗提供了新方向。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一组靶向soat1蛋白的药物/化合物的新用途。
6.本发明所提供的靶向soat1蛋白的药物/化合物的新用途是其在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
7.本发明所提供的靶向soat1蛋白的药物/化合物的新用途是其在制备肝癌细胞增殖抑制剂中的应用。
8.本发明所述的靶向soat1蛋白的药物/化合物是通过与soat1蛋白结合并抑制肝癌细胞生长。
9.本发明还包括靶向soat1蛋白的药物/化合物在下述方面的应用：
10.1)预防和/或治疗肝癌；
11.2)抑制肝癌细胞的增殖。
12.本发明中所述肝癌细胞具体可为hepg2、plc/prf/5(plc)和mhcc97l(97l)。
13.本发明所述靶向soat1蛋白的药物/化合物具体选自下述至少一种：nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737和evacetrapib(ly2484595)。
14.其中，nilotinib(amn-107)，cas no.：641571-10-0，结构式如下所示：
[0015][0016]
ramipril(altace)，cas no.：87333-19-5，结构式如下所示：
[0017][0018]
abt-737，cas no.：852808-04-9，结构式如下所示：
[0019][0020]
evacetrapib(ly2484595)，cas no.1186486-62-3，结构式如下所示：
[0021][0022]
所述的nilotinib(amn-107)对三种肝癌细胞hepg2、plc和97l均具有明显抑制作用，ic
50
分别为448.5nm,15.7μm和2.44μm。
[0023]
所述的ramipril(altace)对三种肝癌细胞hepg2、plc和97l均具有明显抑制作用，ic
50
分别为96.8nm,25.1nm和6.0μm。
[0024]
所述的abt-737对三种肝癌细胞hepg2、plc和97l均具有明显抑制作用，ic
50
分别为184.0nm,3.3μm和2.1μm。
[0025]
所述的evacetrapib(ly2484595)对三种肝癌细胞hepg2、plc和97l均具有明显抑制作用，ic
50
分别为9.2μm,5.6μm和2.0μm。
[0026]
本发明还提供了一种产品，其特征在于：所述产品的活性成分选自nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737和evacetrapib(ly2484595)中的至少一种。
[0027]
所述产品具有下述至少一种功效：
[0028]
1)用于预防和/或治疗肝癌；
[0029]
2)抑制肝癌细胞的增殖。
[0030]
示例性的，所述产品可为药物或药物制剂。
[0031]
所述产品除含有活性成分外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
[0032]
本发明还提供了预防和/或治疗肝癌的方法，包括如下步骤：给受体动物或人施用
所述靶向soat1蛋白的药物/化合物以预防和/或治疗肝癌。
[0033]
本发明中，所述动物可为哺乳动物。
[0034]
本发明所述的四种药物/化合物可与soat1蛋白结合并影响胞内胆固醇稳态。
[0035]
本发明所述的四种药物或化合物均可明显抑制肝癌细胞生长，与avasimibe相比，nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737效果均强于阳性药avasimibe，所述evacetrapib也基本和阳性药效果相当。胆固醇稳态实验也表明，这几种药物通过与soat1结合从而抑制胆固醇向胆固醇酯转化，升高胞内胆固醇水平；且可以在更低的药物浓度下达到增高胞内胆固醇效果。本发明从靶向soat1蛋白影响胆固醇稳态的角度，提供了新的肝癌治疗靶向药物，为肝癌的临床治疗提供了新方向。
附图说明
[0036]
图1是基于soat1靶蛋白的高通量筛选。图示为几种药物或化合物与soat1蛋白结合口袋和潜在结合位点。
[0037]
图2是筛选小分子对肝癌细胞活力测定。图示是在hepg2细胞中分别给予四种药2μm和20μm两个浓度，24h后用cck-8测得的细胞活力，avasimibe为阳性对照。
[0038]
图3是nilotinib对三种肝癌细胞hepg2、plc、97l细胞活力ic
50
测定。
[0039]
图4是ramipril对三种肝癌细胞hepg2、plc、97l细胞活力ic
50
测定。
[0040]
图5是abt-737对三种肝癌细胞hepg2、plc、97l细胞活力ic
50
测定。
[0041]
图6是evacetrapib对三种肝癌细胞hepg2、plc、97l细胞活力ic
50
测定。
[0042]
图7是药物对细胞胆固醇稳态测定。图示分别是在上述四种药物2倍ic
50
给药浓度下，利用菲利宾菌素进行胞内胆固醇染色，avasimibe为阳性对照。
[0043]
图8是四种药物与阳性对照avasimibe在hepg2细胞中活性比较。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0045]
下述实施例中使用的nilotinib(amn-107)购自selleck，商品目录号s1033；ramipril(altace)购自selleck，商品目录号s1793，abt-737购自selleck，商品目录号s1002；evacetrapib(ly2484595)购自selleck，商品目录号s2825；avasimibe购自selleck，商品目录号s2187。
[0046]
下述实施例中使用的肝癌细胞hepg2购自atcc，产品编号atcc hb-8065；plc购自atcc，产品编号atcc crl-8024；97l购自atcc(武汉普诺赛生物有限公司代理)，产品编号cl-0497。
[0047]
实施例1：基于soat1靶蛋白的高通量筛选
[0048]
本实施例所述的soat1蛋白三维晶体结构来源于rcsb pdb数据库，选取了soat1蛋白pdb code为6l47和6vum二个模型进行高通量配体筛选，小分子数据库来源于fda及selleck compounds library。对接软件包括autodock 4.2、sybyl 2.0、glide三种软件的四种对接方法(glide分sp和xp二种对接方法)对所有待筛选化合物进行初步筛选。
[0049]
具体地，在进行分子对接之前，首先定义对接口袋，本实验主要以soat1蛋白疏水
口袋，c通道，t通道及ntd端结合口袋作为主要活性对接口袋。对于autodock 4.2和sybyl 2.0，在上述四个活性口袋周围创建了晶格(距离大小设置约15埃)，并通过将极性氢和gasteiger-huckel部分电荷添加到soat1和待对接化合物中。soat1和化合物的构象采样分别设置为刚性和柔性。遗传算法和经验自由能函数分别用于生成和计入对接姿势。对于glide sp和xp模式，蛋白和化合物前处理同上，对接结果通过对接后能量最小化完善，并通过评分功能glidescore评估对接结果。在完成所有这些对接步骤之后，对接结果将被合并，在所有对接工具中排名前20％的化合物及聚集度大于80％都被视为潜在的活性化合物。而后，进一步通过glidedocking进行高精度对接，并将结果在pymol软件中进行可视化展示及作图。nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737，evacetrapib(ly2484595)及阳性对照avasimibe对接结果如图1所示，四种药对接得分均小于阳性对照，并显示着和soat1有良好结合。
[0050]
实施例2：筛选小分子对肝癌细胞活力测定
[0051]
为了探究筛选的四种化合物对肝癌细胞的活性，我们继续进行了细胞活力测定。
[0052]
本实施例所用细胞为hepg2细胞，测试药物分别为nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737和evacetrapib(ly2484595)，另有空白对照和阳性对照组(avasimibe)。具体地：
[0053]
1)在96孔板中种入8000/孔hepg2细胞，在dmem含10％胎牛血清培养基中，37℃，5％co2培养环境中培养12～24h，待细胞长到70％左右，开始加入稀释好的药物。
[0054]
2)分别将上述四种药物及阳性对照用细胞培养基稀释至2μm和20μm，空白对照用等条件下dmso。
[0055]
3)移去旧的培养基，将稀释好的药物(用细胞培养基配的)加入含细胞的96孔板并做好标记，每个浓度三组重复。
[0056]
4)37℃，5％co2培养环境中继续培养24-48h后加入10μl/孔cck-8试剂，继续培养1h。
[0057]
5)将孵育好的样品于酶标仪450nm处测吸光值，收集整理数据，并在graphpad prism 9.0中进行分析作图。
[0058]
实验结果如图2所示，nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737和evacetrapib(ly2484595)在2μm和20μm浓度下均可明显抑制hepg2细胞生长。
[0059]
实施例3：四种筛选药物/化合物对三种肝癌细胞ic
50
测定
[0060]
为了进一步探究四种化合物对肝癌细胞的活性，我们进行了细胞ic
50
测定。具体地：
[0061]
1)在96孔板中分别种入8000/孔hepg2，plc及97l三种肝癌细胞，在dmem含10％胎牛血清培养基中，37℃，5％co2培养环境中培养12～24h，待细胞长到70％左右，开始加入稀释好的药物。
[0062]
2)分别将上述四种药物由10mm稀释至100μm，50μm，25μm，10μm，5μm，1μm，100nm，10nm，1nm，0十个浓度点。
[0063]
3)移去旧的培养基，分别将稀释好的药物(培养基配的)加入含hepg2，plc及97l三种肝癌细胞的96孔板并做好标记，每个浓度三组重复。
[0064]
4)37℃，5％co2培养环境中继续培养24-48h后加入10μl/孔cck-8试剂，继续培养
1h。
[0065]
5)将孵育好的样品于酶标仪450nm处测吸光值，收集整理数据，并在graphpad prism 9.0中进行分析作图。
[0066]
几种药物在三种细胞中测得ic
50
如图3～图6所示，在较低的药物浓度下均表现出良好的抑制细胞生长效果。
[0067]
实施例4：药物对细胞胆固醇稳态测定
[0068]
本实施例主要用于探究四种化合物对肝癌细胞胞内胆固醇影响，所用方法为菲律宾菌素iii胞内胆固醇染色(cholesterol cell-based detection assay kit,no.10009779)。其原理是菲律宾菌素iii可以与膜上胆固醇结合并发出蓝光而显色。而soat1是细胞内重要的胆固醇稳态调节蛋白，它可以将胆固醇转化为胆固醇酯，当soat1被抑制，胞内胆固醇向胆固醇酯转化被限制，胞内胆固醇将会升高。本实验探究药物对细胞胆固醇影响。具体地：
[0069]
1)在96孔板中种入8000/孔hepg2，在dmem含10％胎牛血清培养基中，37℃，5％co2培养环境中培养12～24h，待细胞长到70％左右，开始加入稀释好的药物。
[0070]
2)分别将上述nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737，evacetrapib(ly2484595)和avasimibe稀释至1μm，200nm，400nm，20μm和10μm(各药物对hepg2的ic
50
二倍剂量)。
[0071]
3)移去旧的培养基，分别将稀释好的药物(培养基配的)加入含细胞的96孔板并做好标记，每个浓度三组重复。
[0072]
4)37℃，5％co2培养环境中继续培养12h～24h(细胞长到约70％～80％观察效果最佳)后按照胆固醇菲律宾菌素iii醇染色试剂盒说明书进行染色。
[0073]
5)将上述养好的细胞去除培养基后，室温，100转/分钟的摇床，pbs清洗3次，每次50μl pbs缓冲液，震荡5分钟。
[0074]
6)将清洗后的hepg2细胞用细胞固定液(item no.10009866)，室温，固定15分钟。再置于100转/分钟的摇床，清洗3次，每次50μl pbs缓冲液，震荡5分钟。
[0075]
7)将菲律宾菌素iii储液按1：100稀释(item no.10009868)，每孔加入100μl稀释好的溶液，避光孵育30-60min(注意此后步骤尽量避光操作)。再置于100转/分钟的摇床，清洗3次，每次50μl pbs缓冲液，震荡5分钟。
[0076]
8)将洗好的样品置于20倍显微镜下观察，激发波长为340-380nm，发射波长为385-470nm，收集整理数据。
[0077]
如图7所示，几种药物在对应浓度下均可明显影响胞内胆固醇含量。且与soat1蛋白敲低组(基因敲低实验，用sh-rna干扰soat1蛋白表达，sh-rna购自美国sigma-aldrich公司(http://www.sigmaaldrich.com).the soat1 sh-rna的序列如下所示：5
’‑
ccggtggtccatgactggctatattctcgagaatatagccagtcatggaccattttttg-3’)结果一致，这表明，药物靶向soat1蛋白可引起了胞内胆固醇变化。
[0078]
综上所述，我们公开的四种药物nilotinib(amn-107)，ramipril(altace)，abt-737，evacetrapib(ly2484595)可通过与soat1结合从而抑制胆固醇向胆固醇酯转化，升高胞内胆固醇水平。它们可明显抑制肝癌细胞生长，并且得到了优于阳性药avasimibe的ic
50
值(图8)。本发明从靶向soat1蛋白影响胆固醇稳态的角度，提供了新的肝癌治疗靶向药物，
为肝癌的临床治疗提供了新方向。