一种根瘤菌的双基因突变体及其应用

1.本发明属于农用微生物领域，具体涉及一种根瘤菌的双基因突变体及其应用。


背景技术：

2.氮元素是限制作物生长的最主要元素之一，但是土壤中能够被植物所利用的氮元素非常有限，主要还是由化学肥料来提供。然而，随着氮肥使用量的不断增加，这不仅抑制根瘤菌与豆科植物间的共生固氮作用，而且给生态环境带来了诸多不利的影响。所以，在无化学肥料供应的情况下，共生固氮可以为豆科植物的生长发育提供足够的氮源。在大豆根系被根瘤菌侵染后会形成共生根瘤，根瘤会通过生物固氮的的方式将空气中的氮气转化成氨为大豆提供氮源。增加大豆与根瘤菌间的固氮能力，既可以大幅度减少氮肥的使用，同时也可以提高大豆产量。因此，提高豆科植物自身的固氮能力对生态环境与农业发展具有重要意义。
3.豆科植物与根瘤菌的共生结瘤过程中有很多信号分子的传导参与，其中根瘤菌的ⅲ型泌出系统分泌的ⅲ型效应因子是最主要的信号分子之一，它影响着根瘤菌与宿主植物之间共生关系的建立。但是ⅲ型效应因子是如何影响植物结瘤的分子机制还不清楚，以及根瘤菌与豆科植物间的互作基因还没有深入的研究。
4.大豆根瘤的数目是影响大豆共生固氮和生长情况的重要的因素，目前控制大豆根瘤菌的数量是没有办法通过人为来控制的，只能通过不断的更换根瘤菌摸索适合于接种大豆的根瘤菌维持稳定的根瘤数量，操作很麻烦并且工程量很大，未知的因素也比较多。现在急需一种可以控制大豆根瘤数量的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。
6.本发明提供一种根瘤菌(sinorhizobium fredii)hh103的双基因突变体，所述双基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的nopt基因和nopp基因进行突变或者沉默获得的。
7.进一步限定，所述nopt基因的序列如seq id no.1所示。
8.进一步限定，所述nopp基因的序列如seq id no.2所示。
9.进一步限定，获得双基因突变体的方法：将nopt基因和nopp基因与pjq200sk载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌hh103中得到根瘤菌hh103的双基因突变体。
10.本发明提供一种减少大豆根瘤数目的试剂，所述试剂的有效成分是权利要求1-3任意一项所述的根瘤菌hh103的双基因突变体。
11.进一步限定，将权利要求5所述的试剂接种过表达gmpbs1基因的大豆幼苗或野生型大豆幼苗。
12.本发明提供一种减少大豆根瘤的方法，在大豆幼苗或过表达gmpbs1基因的大豆幼苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含上述的双基因突变体的菌液，接菌数量为大于2
×
105个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。
13.进一步限定，其特征在于，所述菌液按如下方法制备：
14.(1)将上述的双基因突变体培养活化，控制od
600
为0.65-0.86；
15.(2)将步骤(1)得到的菌液离心，收集菌体并洗涤，再用硫酸镁溶液重悬菌体，使菌液od
600
达到0.2。
16.本发明提供上述的试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，所述试剂适用的大豆品种为绥农14或野生豆zyd00006。
17.本发明提供上述的双基因突变体或上述的方法在大豆育种中的应用。
18.有益效果：本发明通过三亲杂交构建根瘤菌hh103ωnopt&nopp突变体，挖掘ⅲ型效应因子nopt、nopp互作基因。通过pcr鉴定、southern鉴定验证hh103ωnopt&nopp突变体的成功构建，利用sn14、zyd00006进行结瘤鉴定以观察结瘤表型差异。成功构建根瘤菌hh103ωnopt&nopp突变体，结果发现接种根瘤菌hh103ωnopt&nopp导致结瘤数目显著降低。过表达gmpbs1毛状根结瘤数据进一步验证了效应因子对结瘤的影响。
附图说明
19.图1为突变体筛选过程。
20.图2为突变体hh103ωnopt&nopp的pcr鉴定结果图，其中，m：trans2kplusdnamarker：1：hh103(nopp-lf-f/r)2:hh103ωnopt&nopp(nopp-lf-f/r)3:hh103(nopt-lf-f/r)4：hh103ωnopt&nopp(nopt-lf-f/r)5:hh103ωnopt&nopp(nopp-f/r)6:hh103ωnopt&nopp(nopt-f/r)note:m：trans2kplusdnamarker：1：hh103(nopp-lf-f/r)
21.2:hh103ωnopt&nopp(nopp-lf-f/r)3:hh103(nopt-lf-f/r)4：hh103ωnopt&nopp(nopt-lf-f/r)5:hh103ωnopt&nopp(nopp-f/r)6:hh103ωnopt&nopp(nopt-f/r)。
22.图3为hh103ωnopt&nopp的southern鉴定结果图，其中，m：dl10000dnaladder1：hh103基因组(xhoⅰ)2：hh103ωnopt&nopp基因组(xhoⅰ)3：hh103基因组(sacⅰ)4：hh103ωnopt&nopp基因组(sacⅰ)
23.note:m：dl10000dnaladder1：hh103基因组(xhoⅰ)2：hh103ωnopt&nopp基因组(xhoⅰ)3：hh103基因组(sacⅰ)4：hh103ωnopt&nopp基因组(sacⅰ)
24.图4为不同突变体接种sn14的结瘤数目及干重结果图，其中，a：sn14接种hh103以及突变体hh103ωnopt、hh103ωnopp、hh103ωnopt&nopp、hh103ωttsi突变体的毛状根表型图，比例尺为1cm。b：结瘤数目及干重的根瘤表型的箱线图，使用student’sttest进行显著性分析，其中“***”代表p《0.001，“**”代表p《0.01。n＝20。
25.图5为不同突变体接种zyd00006的结瘤数目及干重结果图，其中，a：zyd00006接种hh103以及突变体hh103ωnopt、hh103ωnopp、hh103ωnopt&nopp、hh103ωttsi突变体的毛状根表型图，比例尺为1cm。b：结瘤数目及干重的根瘤表型的箱线图，使用student’sttest进行显著性分析，其中“***”代表p《0.001，“**”代表p《0.01。n＝20。
26.图6为fu28-gmpbs1载体构建结果图，其中，m：dnamarker2kplusⅱ；1-3：fu28-gmpbs1。
27.图7为psoy10-35s:gmpbs1:gfp载体构建结果图，其中，m：dnamarker2kplusⅱ；1-3：psoy10-35s:gmpbs1:gfp。
28.图8为psoy10-35s:gmpbs1:gfp毛状根转化植株。
29.图9为psoy10-35s:gmpbs1:gfp毛状根转化植株表型统计，其中，：a：psoy10-35s:gmpbs1:gfp和空载体分别接种hh103以及突变体hh103ωnopt、hh103ωnopp、hh103ωnopt&nopp突变体的毛状根表型图，ev代表psoy10空载，比例尺为1cm。b：毛状根转化并过表达psoy10-35s:gmpbs1:gfp的根瘤表型的箱线图，使用student’sttest进行显著性分析，其中“***”代表p《0.001，“**”代表p《0.01。n＝20。
30.图10为psoy10空载体的载体图。
31.图11为fu28空载体的载体图。
具体实施方式
32.peasy-t1载体，helper(km)载体，pfaj1702(tet)载体和pgwc载体均为商业购买，商业购买。
33.pjq200sk载体(gm)记载在quandt,j.,&hynes,m.f.(1993).versatilesuicidevectorswhichallowdirectselectionforgenereplacementingram-negativebacteria.gene,127(1),15
–
21.doi:10.1016/0378-1119(93)90611-6文献中。
34.全基因组导入系群体(chromosomesegmentssubstitutionlines，cssl)记载在文章_陈庆山，“作物回交导入系的构建与应用”。
35.重组自交系群体(recombinantinbredlines，ril)记载在[1]王宏林.大豆重组自交系群体的构建,鉴定及其主要农艺性状qtl定位的研究[d].南京农业大学,2001.
[0036]
sn14、野生豆zyd00006绥农14、charleston、东农594、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、nattosan、黑农44、黑农35和北丰11均是黑龙江常见的品种，来自东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室。
[0037]
快生型费氏中华根瘤菌hh103(源于西班牙塞维利亚大学franciscojavierl
ó
pez-baena实验室，记载在weidners,beckera,bonillai,etal.genomesequenceofthesoybeansymbiontsinorhizobiumfrediihh103[j].journalofbacteriology,2012,194(6):1617.)
[0038]2×
ty液体培养基：胰蛋白胨(bacto-tryptone)16g、酵母提取物(bacto-yeastextract)10g、nacl5g、水1000ml,ph7.2，121℃灭菌30min.
[0039]
fu系列载体包括fu28由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠；植物表达载体psoy10由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠。
[0040]
psoy1(spec)fu系列载体包括fu28由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠；植物表达载体psoy10由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠。
[0041]
下述在途来自于文章lum,chengz,zhangxm,etal.spatialdivergenceofphr-pht1modulesmaintainsphosphorushomeostasisinsoybeannodules[j].plantphysiology,2020.文章的编号在论文中的参考文献中都有对应。载体骨架记载网站：tair-homepage(arabidopsis.org)。
nopt2000ω(pjq200sk-nopt-spec)(mappingof quantitative trait loci underlying nodule traits in soybean(glycine max(l.)merr.)andidentification of genes whose expression is affected by the sinorhizobium fredii hh103 effectorproteins nopl and nopt)pjq200sk-nopt是pjq-nopt2000ω,pjq-nopt2000ω是在 pjq-nopt2000的nopt起始密码子的下游插入了spec抗性编码序列，造成了nopt的编码序列突变。
[0049]
(1)根瘤菌hh103ωnopp，大肠杆菌helper和构建好的pjq200sk-nopt-spec分别涂布在含有利福平rif(50mg/l)抗性，卡那霉素km(50mg/l)抗性和壮观霉素spec/庆大霉素gent(50mg/l)抗性的相应培养基ty固体培养基，lb固体培养基上。培养箱过夜培养直至单克隆长出；
[0050]
(2)挑取以上三种菌的单克隆，于含相应抗生素和液体培养基的1.5ml离心管中进行小摇过夜培养，过夜培养后转移至50ml离心管中并加入相应抗性培养基，培养至od
600
为 0.6～0.8，之后将菌液进行12,000rpm，30s离心，弃上清，向菌块中加入1ml无抗ty液体培养基进行重悬；
[0051]
(3)将重悬好的hh103ωnopp菌液，helper菌液和pjq-nopt2000ω菌液，于1.5ml离心管中分别按照2:1:1的比例进行混合，混合后12,000rpm离心30s，弃上清，向菌块中加入无抗ty液体培养基20μl进行重悬；
[0052]
(4)将重悬好的20μl混合液垂直滴到无抗ty固体培养基平板上，28℃培养箱培养36h；
[0053]
(5)将长出的菌斑涂布于含rif/spec/km抗性的ty固体培养基，至单克隆再次长出，该过程重复3次；
[0054]
(6)将第三次长出的单克隆于含有rif/spec/km抗生素和5％蔗糖的ty固体培养基进行划线筛选(图1所示)，该过程重复3次；
[0055]
(7)最终筛选确定的突变体命名hh103ωnopt&nopp。
[0056]
2.hh103ωnopt&nopp突变体鉴定：提取hh103ωnopt&nopp及野生型hh103基因组，按照tiangen公司细菌全基因组提取试剂盒(dp302)说明书，对根瘤菌hh103的全基因组进行提取。分别用引物nopt-lf-f/r、nopp-lf-f/r扩增hh103基因组和 hh103ωnopt&nopp基因组，用引物nopp-f/r、nopt-f/r扩增hh103ωnopt&nopp基因组，目的片段扩增方法如下。
[0057]
pcr扩增体系如表1所示：
[0058]
表1
[0059][0060]
反应条件如表2所示：
[0061]
表2
88.2g柠檬酸钠
·
2h2o于800ml的去离子水中充分搅拌溶解，滴加14n hcl调节ph值至 7.0，定容至1l。
[0079]
(5)2
×
洗液(2
×
ssc,0.1％(w/v)sds)(1l)：量取1gsds、100ml20
×
ssc于800ml 的去离子水中，68℃加热溶解，滴加14n hcl调节ph值至7.2，定容至1l。
[0080]
(6)0.5
×
洗液(0.5
×
ssc,0.1％(w/v)sds)(1l)：量取1g sds、25ml 20
×
ssc于 800ml的去离子水中，68℃加热溶解，滴加14n hcl调节ph值至7.2，定容至1l。
[0081]
(7)顺丁烯二酸buffer(0.1m顺丁烯二酸，0.15m nacl，naoh to ph 7.5)(1l)：量取8.77g nacl、11.607g顺丁烯二酸于800ml的去离子水中充分搅拌溶解，用naoh调节ph值至7.5，定容至1l。
[0082]
(8)washing buffer(0.1m顺丁烯二酸，0.15m nacl(20℃)，ph 7.5，0.3％(v/v) tween-20)(1l)：量取3ml tween-20溶解于1l顺丁烯二酸buffer中。
[0083]
(9)detection buffer(0.1m tris-hcl，0.1m nacl，ph 9.5)(1l)：量取12.11g tris 和5.85g nacl于800ml的去离子水中充分搅拌溶解，用naoh调节ph值至9.5，定容至 1l。
[0084]
(10)1
×
blocking solution：10
×
blocking solution(vial 6)用顺丁烯二酸buffer稀释10 倍(现用现配)。
[0085]
(11)antibody solution：每次用之前，10000rpm离心anti-digoxigenin-ap(vial 4)5 min小心从表面吸取所需剂量，用1
×
blocking solution按1:10000(75mμ)稀释 anti-digoxigenin-ap。2-8℃可稳定保存12h。
[0086]
(12)10
×
tbe buffer(500ml)：量取54g tris base、3.72g na2edta
·
2h2o、27.5g 硼酸于400ml的去离子水中充分搅拌溶解，定容至500ml。
[0087]
(13)salmon dna(10mg/ml)(100ml)：量取2g鲑鱼精dna于500ml烧杯中，加入200mlte buffer；磁力搅拌器室温搅拌2-4h，溶解后加入4ml的5m nacl；用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次；回收水相溶液后，用17号针头快速吸打溶液约20次以切断dna；加入两倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀；离心回收dna后，溶解于100ml的水中，测定溶液的od
260
值；稀释dna溶液至10mg/ml，煮沸10min，分装小份于-20℃保存；使用前在沸水中煮沸5min，迅速冰浴冷却。
[0088]
southern操作步骤如下：
[0089]
(1)提取野生型hh103、突变体hh103ωnopt&nopp的基因组。
[0090]
(2)标记探针：
[0091]
设计探针引物为包含目的基因及插入的抗性片段400～600bp，扩增突变体基因组，胶回收片段，取1μg模板dna于离心管中，灭菌水补足至16μl，沸水浴10min,迅速插入冰中。混匀dig-high prime(vial 1)，取4μl到变性的dna，混匀并稍离心，37℃
[0092]
过夜，65℃水浴终止反应，-20℃保存备用。
[0093]
(3)酶切基因组，体系(50μl)如表3：
[0094]
表3
[0095][0096]
消化好的样品点样于2.0％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，为保证dna均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。同时应该在低电压下如50v左右慢跑，直到溴酚蓝至凝胶的3/4处。
[0097]
(4)电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶。
[0098][0099]
(5)在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。在转印迹槽中，倒入20
×
ssc溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中，底面在上的凝胶，滤膜(与凝胶等大)，滤纸(与凝胶等大)，吸水纸(略小于滤纸，5-8cm高)，400-800g重物。凝胶四周用parafilm膜包围防止短路。滤膜事先做标记，再用2
×
ssc浸湿至少5min，滤纸事先用20
×
ssc浸湿，转膜10-18h。注意：转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净。一旦建立转膜系统后，要防止滤膜和凝胶错位。防止吸水纸倒塌和完全湿透，10h后更换吸水纸。
[0100]
(6)转膜结束后，取出滤膜，于2
×
ssc摇洗5min，用滤纸吸干。
[0101]
(7)用紫外交联照射，正反面各4min(energy 1200)。
[0102]
(8)膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用。
[0103]
预杂交：预热(37℃)一定体积的地高辛预杂交液(dig easy hyb)(10ml/100cm2膜)，将杂交膜放入杂交液37℃1-2h；
[0104]
变性探针：将变性的dna探针沸水浴5min，迅速插入冰中，加探针于杂交液中(3.5 ml/100cm
2 membrane)，混合均匀没气泡。
[0105]
杂交：将预杂交液倒掉，再加入杂交液于杂交瓶中，放入杂交炉。15-20rpm 42℃杂交过夜。
[0106]
(9)杂交后的洗膜处理过程，顺序如下：
[0107][0108]
倒掉detection buffer，将膜取出放入加有200μl5号液和10ml detection buffer的混合液体中，避光30min，观察膜上是否有杂交信号。
[0109]
为了在基因组水平上验证突变体hh103ωnopt&nopp的成功构建，进行了southern鉴定。突变体hh103ωnopt&nopp为实验组，野生型根瘤菌hh103作为对照，分别用xhoⅰ和sacⅰ进行基因组的单酶切。southern杂交结果如图3所示，酶切后突变体的杂交片段比野生型的杂交片段大1200bp左右，证明突变体构建成功。
[0110]
5.hh103ωnopt&nopp突变体结瘤能力鉴定
[0111]
(1)菌株：根瘤菌hh103，hh103ωnopt，hh103ωnopp，hh103ωnopt&nopp， hh103ωttsi。
[0112]
取实验所需大豆品种种子各200粒左右，采用氯气灭菌法对大豆种子表面进行灭菌，时间为12h-16h。在超净工作台内吹去种子表面氯气后，于超净台内将外形完好大小一致的种子种于灭菌后的双层钵中。待幼苗顶到双层钵盖时去盖，并用灭菌的小石子覆盖蛭石表面，防止植物根部接触空气中的真菌，将植株放置于人工气候室中进行培养。
[0113]
将所需菌种划线于相应抗生素的ty固体平板上，28℃培养2～3天后挑取单克隆于1.5 ml离心管中过夜培养。取200μl菌液于30ml的ty液体培养基中，继续培养至od
600
值为0.6-0.8。4000rpm离心10min，弃去上清，用灭菌的10mm mgso4重悬菌块，重复3次。最后用10mm mgso4重悬菌体至菌液的od
600
值为0.2，用来接种大豆。
[0114]
待大豆幼苗三出复叶完全展开时，用注射器在大豆根部1-2cm处接种2ml od
600
值为 0.2的菌液，每种菌种接种各品种25株大豆幼苗。接种后28d后调查结瘤数目及干重。
[0115]
结果：将根瘤菌hh103、突变体hh103ωnopt、hh103ωnopp、hh103ωnopt&nopp、 hh103ωttsi分别接种于绥农14，野生豆zyd00006进行结瘤表型鉴定。接种之后第30d对结瘤数目及瘤干重进行调查，调查结果如图4、5所示。与接种野生型根瘤菌hh103相比，接种突变体hh103ωnopt使结瘤数目减少、接种突变体hh103ωnopt使结瘤数目增多，突变体hh103ωnopt&nopp在绥农14和野生豆zyd00006均使结瘤数目和结瘤干重显著减少，这些结果说明ⅲ型效应因子nopt在结瘤中起促进作用，nopp在结瘤中起抑制作用，但ⅲ型效应因子nopt和nopp之间存在相互作用导致在缺少这两种效应因子的情况下结瘤数目急剧下降。不同根瘤菌及突变体在不同大豆品种中的结瘤表型差异也反映了不同ⅲ型效应因子对大豆的亲和性，而其中也可能包括不同ⅲ型效应因子的主效互作基因在不同大豆品种中基因型的不同。
[0116]
实施例2.减少大豆根瘤数量的试剂
[0117]
试剂的成分：突变体菌液。
[0118]
使用方法：(1)将根瘤菌hh103ωnopt&nopp突变体突变体进行培养活化，控制od600 为0.65-0.86；
[0119]
(2)将步骤(1)得到的菌液进行4000rpm，10min离心，用10mm的硫酸镁溶液进行重悬洗菌重复4次；将硫酸镁溶液重悬后的菌液od
600
＝0.2；
[0120]
(3)大豆苗生长至对生真叶期，对大豆苗进行接菌，接菌数量为大于2
×
105个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。
[0121]
将结瘤数量过多的大豆品种使用的根瘤菌进行突变，降低结瘤数目，减少共生固氮消耗的能量，保证大豆产量。通过突变体调节接种根瘤菌在大豆上的结瘤数目，保证结瘤数目在合理范围内。
[0122]
根瘤菌hh103ωnopt&nopp突变体以研究ⅲ型效应因子nopt和nopp对大豆结瘤的影响。成功构建构建根瘤菌hh103ωnopt&nopp突变体后我们对其进行了结瘤鉴定实验，统计数据后发现与接种野生型根瘤菌hh103相比，接种突变体hh103ωnopt会使结瘤数目显著减少。
[0123]
实施例3.一种减少大豆根瘤数量的方法
[0124]
1.构建gmpbs1过表达大豆：
[0125]
首先在大豆中使用pbs1-f和pbs1-f扩增目的基因gmpbs1(基因记载在asaf k, wadood s f,min c,et al.effector-triggered inhibition of nodulation:a rhizobial effectorprotease targets soybean kinase gmpbs1-1[j].plant physiology,2022.)，分别使用ecor
ⅴ
、kpn
ꢀⅰ
对入门载体fu28以及克隆出的目的基因片段进行酶切连接，结果如图6，连接完成的载体命名为fu28-gmpbs1。然后通过lr反应连接至psoy10载体上，在gmpbs1基因后面连上gfp基因，结果如图7，连接完成的载体命名为psoy10-35s:gmpbs1:gfp。将 psoy10-35s:gmpbs1:gfp载体转入k599发根农杆菌中以完成毛状根转化实验。
[0126]
2.gmpbs1过表达对结瘤的影响
[0127]
(1)菌株：根瘤菌hh103、hh103ωnopt、hh103ωnopp、hh103ωnopt&nopp、 hh103ωttsi
[0128]
(2)植物材料：dn50。
[0129]
3.为研究gmpbs1对大豆结瘤过程有如何影响以及如何响应ⅲ型效应因子nopt，在此我们构建了gmpbs1过表达大豆植株，通过接种根瘤菌不同hh103及hh103ωnopt、hh103 ωnopp、hh103ωnopt&nopp、突变体以确定其对大豆结瘤的影响以及如何响应ⅲ型效应因子。
[0130]
将psoy10-35s:gmpbs1:gfp毛状根转化植株转入蛭石中培养3d后，分别接种根瘤菌hh103、hh103ωnopt、hh103ωnopp、hh103ωnopt&nopp，接菌后培养24d进行结瘤表型调查。如图8，为psoy10-35s:gmpbs1:gfp毛状根转化植株镜检图片，将非转基因根毛及嵌合体剔除以观察结瘤表型。
[0131]
在剔除所有非阳性根及嵌合体后，对根瘤数目进行统计，如附图9。通过统计我们发现 psoy10-35s:gmpbs1:gfp过表达植株接种hh103结瘤数目相较于ev无明显变化，而相
较于接种hh103ωnopt结瘤数目显著降低，接种hh103ωnopp结瘤数目显著增多，而接种hh103ωnopt&nopp的转基因植株结瘤数目较接种hh103ωnopt也出现稍微减少的情况。在nopt缺失的情况下植株中的pbs1不能被nopt水解，从而增强免疫反应导致结瘤减少。