一种锥毛壳属菌株SGSF767及其在防治植物病害中的应用

一种锥毛壳属菌株sgsf767及其在防治植物病害中的应用
技术领域
1.本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种锥毛壳属菌株sgsf767及其在防治植物病害中的应用。


背景技术：

2.真菌资源具有多样性，许多真菌可以作为生防真菌来防治植物病害。根结线虫(meloidogyne spp.)是危害作物最严重的一类植物寄生线虫，它具有分布广泛、寄主种类多，可随雨水传播等特点，是威胁农业生产主要病原物之一。目前防治根结线虫病害还缺少行之有效的绿色防控方法，而生物防治被给予厚望。目前应用于线虫生物防治的真菌主要为厚垣普奇尼亚菌(pochonia chlamydosporia)、淡紫拟青霉(paecilomycs lilacinus)、少孢节丛孢菌(arthrobotrys oligospora)和哈茨木霉(trichoderma harzianum)等。
3.锥毛壳属真菌(coniochaeta sp.)属于粪壳菌纲(sordariomycetes)、coniochaetales目、毛孢壳科(coniochaetaceae)，该属最早建立于1887年，该属目前有113个种，目前未见有关锥毛壳属真菌具有杀线虫活性的报道。


技术实现要素：

4.为了解决防治根结线虫病害缺少行之有效的绿色防控方法等问题，本发明提供了一种锥毛壳属(coniochaeta sp.)的菌株sgsf767，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年3月2日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmcc no.40109。
5.本发明还提供了上述菌株sgsf767在植物线虫病防治中的应用。
6.进一步地限定，所述植物线虫病为南方根结线虫(meloidogyne incognita)引起的根结线虫病。
7.进一步地限定，所述应用是将菌株sgsf767接种于pdb培养基进行发酵，利用获得的发酵液上清防治南方根结线虫病。
8.本发明还提供了上述菌株sgsf767在防治植物致病细菌中的应用。
9.进一步地限定，所述植物致病菌细菌为青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、水稻黄单胞致病菌变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae)中的任意一种。
10.进一步地限定，所述应用是将菌株sgsf767接种于发酵培养基中，获得发酵产物，利用乙酸乙酯对发酵产物进行提取，将获得的提取物用于防治植物致病细菌；防治青枯劳尔氏菌所用发酵培养基为pdb培养基、pdb烟酰胺培养基、yes蛭石培养基、pda培养基中的任意一种，防治丁香假单胞菌和水稻黄单胞致病菌变种时所用的发酵培养基为yes蛭石培养基或pda培养基。
11.本发明还提供了上述菌株sgsf767在防治植物致病真菌中的应用。
12.进一步地限定，所述植物致病真菌为立枯丝核菌(rhizoctonia solani)。
13.进一步地限定，所述应用是将菌株sgsf767接种于发酵培养基中，获得发酵产物，利用乙酸乙酯对发酵产物进行提取，将获得的提取物用于防治立枯丝核菌；所述发酵培养基为yes蛭石培养基。
14.本发明的有益效果：
15.本发明通过对大兴安岭林下凋落物进行分离，得到菌株sgsf767，进一步的测序及系统发育树分析表明该菌株its序列与coniochaeta hoffmannii最接近，相似度为95.77％，与最相近菌株相似度较低，再结合它的系统发育分析及形态学特点，判断菌株sgsf767为锥毛壳属真菌中的一个新种。在二龄幼虫毒力测定试验中，菌株sgsf767的pdb发酵液对南方根结线虫致死率可达到75.00％，说明它具有杀线虫活性。在番茄盆栽防治实验中，菌株sgsf767的pdb发酵液对根结的防治效果可达到50.00％，对卵的防治效果可达到61.75％。并且，菌株sgsf767的发酵提取物还具有抗植物病原细菌活性与抗植物病原真菌活性，对青枯劳尔氏菌、丁香假单胞菌、水稻黄单胞致病菌变种和立枯丝核菌具有抑菌效果。根据以上杀线虫活性与抗菌活性，说明锥毛壳属菌株sgsf767可以作为潜在的生防真菌用作防治植物病害。
附图说明
16.图1为菌株sgsf767的菌落形态特征图；其中，图1中的a-f的培养基依次为pda、pca、sna、mea、oa和cma；
17.图2为菌株sgsf767的多基因(its、lsu和tef-1a)系统发生树；图中通节点数字(％)只显示75％以上的自展值(bootstrap)，“*”表示为模式菌数据。
具体实施方式
18.以下通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
19.本发明涉及的培养基及其组成如下：
20.(1)pda培养基(potato dextrose agar，pda)：200g马铃薯，20g葡萄糖，19g琼脂，1l蒸馏水。
21.(2)马铃薯胡萝卜琼脂培养基(carrot potato agar，pca)：40g马铃薯，40g胡萝卜，19g琼脂，1l蒸馏水。
22.(3)合成低营养琼脂培养基(synthetic low nutrient agar，sna)：1g磷酸二氢钾，1g硝酸钾，0.25g硫酸镁，0.5g氯化钾，0.2g葡萄糖，0.2g蔗糖，15g琼脂，1l蒸馏水。
23.(4)麦芽浸粉培养基(malt extract agar，mea)：40g麦芽浸粉，19g琼脂，1l蒸馏水。
24.(5)燕麦培养基(oatmeal agar，oa)：30g燕麦，19g琼脂，1l蒸馏水。
25.(6)玉米粉琼脂培养基(corn meal agar，cma)：2.0g玉米浸粉，15.0g琼脂粉，1l蒸馏水。
26.(7)pdb培养基(potato dextrose broth，pdb)：200g马铃薯，20g葡萄糖，1l蒸馏水。
27.(8)yes蛭石培养基(yeast extract saccharose with vermiculite，yes 蛭石)：20g酵母浸粉，0.5g硫酸镁，150g蔗糖，1l蒸馏水，加入适量蛭石用于吸附液体培养基。
28.(9)yma培养基(yeast malt agar，yma)：10g麦芽浸粉，2g酵母浸粉，19g琼脂，1l蒸馏水。
29.(10)pdb烟酰胺培养基(potato dextrose broth supplemented with nicotinamide，pdb ni)：200g马铃薯，20g葡萄糖，1l蒸馏水，100mg/l烟酰胺。
30.实施例1：菌株sgsf767的分离与鉴定
31.(1)菌株sgsf767的分离
32.本实验主要运用颗粒涂布平板法，将5g取自大兴安岭森林的林下凋落物研磨成1-3mm左右的颗粒状，将研磨好的颗粒用无菌水进行冲洗，并放入离心机中2000r/min离心10min，去除上清液，反复清洗3次后，加入无菌水配置成5ml悬浮液。吸取200μl悬浮液至pda平板上，涂布器涂抹均匀，在25℃下培养5-7d。待颗粒上有真菌菌落长出时，用接种针转移到另一pda平板，进行纯化培养得到真菌sgsf767等菌株。
33.(2)不同温度和ph值对菌株sgsf767生长的影响
34.取菌株sgsf767的6mm菌饼，接入pda培养基中，设置15℃、20℃、25℃、30℃，4个处理，每个处理3次重复。用1mol/l的hcl和1mol/l的naoh配置ph值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的pda培养基，打取菌饼放置平板中央，每个处理3次重复。均培养14d，每培养2d后观察菌落生长状况，十字交叉法测量菌落直径。结果表明温度对菌株sgsf767的生长直径有一定影响，菌株sgsf767在温度15℃至30℃均能生长，并且在25℃时菌丝生长最快。菌株sgsf767在ph5至ph9均能生长，ph7时生长的最快。
35.(3)菌株sgsf767的形态学鉴定
36.yma培养基上培养14d的无性形态，菌丝透明，菌丝壁光滑，其菌丝宽度可达到1.1-1.8μm。产生大量分生孢子，分生孢子梗为圆柱形，宽度为1.7-2.4μm，长度为3.0-11.7μm。分生孢子透明、平滑、呈圆柱形、棍棒形略有弯曲，大小为(3.7-)4.5-4.7(-5.5)
×
(0.8-)1.1-1.2(-1.6)μm。观察到“孢子至孢子”的微循环，主要从分生孢子的一侧开口形成次生分生孢子，并且有厚垣孢子形成。
37.将菌株sgsf767接种到6种不同的培养基中，分别为pda、pca、sna、mea、oa、cma。培养两周，观察不同培养基的培养特征(见图1)。菌株sgsf767在pda上的菌落直径可达到15-20mm，菌落近似圆形，表面约有9-15条呈现放射状褶皱，菌落边缘气生菌丝不发达，中心呈现杏黄色。sgsf767在pca、oa和sna上菌落直径可达到13-21mm，菌落呈现奶油色至浅黄色，菌落边缘平整气生菌丝不发达。sgsf767在mea上菌落直径可达到19-22mm，菌落呈现肉色，边缘有气生菌丝。sgsf767在cma上菌落直径达到18-22mm，菌落中心为米白色，中间为姜黄色，边缘浅黄色，有气生菌丝。
38.(4)菌株sgsf767的分子生物学鉴定
39.运用ctab法提取菌株sgsf767的dna，对真菌核糖体rna基因中的内部转录间隔区(internal transcribed spacer region，its)序列进行扩增，引物分别为正向端引物its1和反向端引物its4。序列相似性分析结果表明，菌株sgsf767的its序列(genbank登录号为om838286)与genbank中coniochaeta hoffmannii序列(genbank登录号为mh859265)最为接近，其相似性较低为95.77％。进一步利用mega7.0进行系统发生学分析，发现真菌sgsf767
处于一个独立分枝上(见图2)。综合形态学数据及its序列分析结果，真菌sgsf767隶属于锥毛壳属(coniochaeta sp.)，为该属的一个未被研究过的新物种。
40.正向端引物its1的核苷酸序列如seq id no.1所示(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)；反向端引物its4的核苷酸序列如seq id no.2所示(5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
)。
41.实施例2：利用菌株sgsf767发酵液杀灭培养板中的南方根结线虫二龄幼虫
42.选取pdb培养基进行sgsf767的发酵，每50ml发酵液中打入4个菌饼，放入25℃恒温摇床培养箱中，180rpm培养14d。将发酵好的发酵液取出放入离心机中12000rpm离心10min，取上清液通过0.22μm滤膜过滤，备用。
43.将采集的番茄南方根结线虫病根用清水冲洗干净，用剪刀将病根剪成1cm小块，清洗后加入10％-15％的次氯酸钠浸泡3min，并进行充分震荡，将其倒入三层筛子上(上层为0.35mm，中层为0.09mm，下层为0.025mm)，用强水流冲洗筛子，重复3次，直至洗净次氯酸钠，将最下层剩余物用洗瓶器冲洗下来倒入干净的烧杯中。采用改良的浅盘分离法培养二龄幼虫，使用13.5
×
13.5
×
7.5cm的培养盒，放入28℃恒温培养箱中培养3d至5d得到j2幼虫。将培养得到的二龄幼虫进行蔗糖梯度离心，取上层清液放入25μm筛网中强水流将蔗糖冲洗去除，获得较干净的j2悬浮液。将收集好的j2悬液放入烧杯中，浓缩至10条每微升，备用。
44.设置空白对照，空白对照选用50mg/l链霉素。在48孔平板中每孔加入500μl发酵液上清，加入50mg/l的链霉素，并放入100条线虫。不同菌种的发酵液上清设置3次重复，将48孔板放置在25℃的恒温培养箱中培养24h后统计线虫死亡率。在显微镜下观察记录线虫的死亡数量，并计算死亡率。线虫死亡判定标准：线虫僵直，且用毛针刺激后不活动，判定线虫死亡。
45.死亡率(％)＝(死亡总数/处理总数)
×
100％
46.通过对二龄幼虫的毒力测定结果对根结线虫进行初步筛选，真菌sgsf767的pdb发酵液上清杀线虫活性最高，死亡率可达到75.00％(见表1)，其它菌株没有明显效果，该结果说明菌株sgsf767具有杀线虫能力。
47.表1各菌株发酵液对根结线虫的防治效果
[0048][0049]
注：表中数据为平均值
±
标准差，数据后小写字母表示经duncan检测相互间差异显著(p《0.05)。
[0050]
实施例3：利用盆栽试验检测菌株sgsf767对南方根结线虫的防治效果
[0051]
将35ml的真菌sgsf767的pdb发酵液上清倒入生长1个月的番茄盆栽中。2d后接种南方根结线虫，每株番茄接种5ml二龄幼虫悬浮液(约500条)。每个菌悬液浓度处理4盆，用无菌水代替菌悬液作对照处理。接种线虫后每隔7d浇一次菌株发酵液。接种线虫35d后调查防治效果。待接种线虫35d后，收集番茄根系，放入100mg/l的亮蓝中染色30min，取出后用洗
瓶器冲洗干净，用纸吸干表面水分，观察并计算根结、卵块和卵的数量，并计算病情指数及相对防效。
[0052]
病情指数分级如下：0(f)级，根系健康，无根结；1(e)级，根系上有少量根结，占全根系的1％-15％；3(d)级，占全根系的16％-25％；5(c)级，根结的程度中等，26％-50％；7(b)级，根系根结数量很多，占全根系的51％-75％；9(a)级，根系根结数量非常多，占全根系的76％-100％。
[0053][0054]
(注：上式中a-f为对应级别的植株数量，n为调查总植株数)
[0055]
防治效果计算公式：
[0056]
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％
[0057]
与对照组的线虫增长情况相比，真菌sgsf767的各个处理对南方根结线虫均有一定的防治效果。真菌sgsf767防治南方根结线虫的侵入效果达到50.00％，对卵的抑制效果可达到61.75％(见表2与表3)，说明真菌sgsf767具有一定的防治根结线虫病害的效果。
[0058]
表2菌株sgsf767对南方根结线虫(根结)的盆栽防治效果
[0059][0060]
注：表中
“‑”
表示没有数据。
[0061]
表3菌株sgsf767对南方根结线虫(卵和卵块)的盆栽防治效果
[0062][0063]
注：表中数据为平均值
±
标准差，同一栏内数据后小写字母表示经duncan检测相互间差异显著(p《0.05)。
[0064]
实施例4：利用菌株sgsf767防治植物病原细菌
[0065]
将分离得到的菌株sgsf767接入pdb中，每50ml培养基中打入4个菌饼，放入恒温培养震荡箱中25℃，180rpm培养14d。取1ml发酵液接种到发酵培养基中，选取4种发酵培养基对菌株sgsf767进行小量发酵，四种培养基分别为yes蛭石培养基、pdb烟酰胺培养基、pdb培养基、pda培养基。固体发酵放入25℃恒温培养箱中培养14d，液体发酵放入25℃，180rpm恒温培养震荡箱中培养14d。发酵完成取出，加入等体积的乙酸乙酯，提取或萃取24h，减压浓缩获得sgsf767的提取物。
[0066]
采用平板打孔药剂扩散法进行抗细菌活性检测。将提取物溶于20％的dmso(二甲基亚砜)甲醇溶液中制成母液。将细菌与融化的lb培养基混合倒入培养皿，在平板上打孔分别加入10μl母液、200mg/l的金霉素(阳性对照)与20％的dmso甲醇溶液(阴性对照)。培养
24h后观察抑菌圈的大小(见表4)。
[0067]
表4菌株sgsf767的抗细菌活性
[0068][0069]
注：
“‑”
表示无抑制效果；“ ”表示抑制效果在4-6mm；“ ”表示抑制效果在6-8mm；“ ”表示抑制效果在8mm以上。
[0070]
由表4可知，真菌sgsf767的乙酸乙酯提取物具有抗植物病原细菌活性，它对青枯劳尔氏菌、丁香假单胞菌、水稻黄单胞菌致病菌变种和立枯丝核菌具有抑菌效果，且真菌sgsf767的pda发酵提取物与yes 蛭石发酵提取物的抗植物病原细菌能力较强。
[0071]
实施例5：利用菌株sgsf767防治植物病原真菌
[0072]
将分离得到的菌株sgsf767接入pdb中，每50ml培养基中打入4个菌饼，放入恒温培养震荡箱中25℃，180rpm培养14d。取1ml发酵液接种到发酵培养基中，选取4种发酵培养基对菌株sgsf767进行小量发酵，四种培养基分别为yes蛭石培养基、pdb烟酰胺培养基、pdb培养基、pda培养基。固体发酵放入25℃恒温培养箱中培养14d，液体发酵放入25℃，180rpm恒温培养震荡箱中培养14d。发酵完成取出，加入等体积的乙酸乙酯，提取或萃取24h，减压浓缩获得sgsf767的提取物。
[0073]
采用平板打孔药剂扩散法进行抗真菌活性检测。将提取物溶于20％dmso(二甲基亚砜)甲醇溶液中制成母液。将病原真菌接入pda，在病原菌周围均匀的打5个6mm的小孔，以200mg/l的两性霉素作为阳性对照20％的dmso甲醇溶液为阴性对照，吸取母液或两性霉素10μl加入孔中。培养24h后观察抑菌圈的大小(见表5)。
[0074]
表5菌株sgsf767的抗真菌活性
[0075][0076]
注：
“‑”
表示无抑制效果；“ ”表示抑制效果在4-6mm。
[0077]
由表5可知，真菌sgsf767的yes 蛭石发酵提取物对立枯丝核菌具有抗菌活性。
[0078]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。