基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统

基于rna二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统
技术领域
1.本发明属于检测方法技术领域，具体涉及一种基于rna二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统。


背景技术：

2.胶质母细胞瘤(gbm)是成人最常见的原发恶性脑肿瘤，预后较差。即使采用标准治疗，初诊的患者中位生存期仍16为至20个月。由于胶质母细胞瘤的异质性和侵袭性以及传统药物筛选方法的局限性，目前还没有开发出特别有效的抗肿瘤药物。药物筛选的经典模型是在二维平面培养肿瘤细胞系。然而，肿瘤细胞系在二维培养过程中，肿瘤内异质性较差，逐渐失去了亲代肿瘤的特征。这导致了抗肿瘤药物在前期研发过程中遇到很大的局限性。近年来，肿瘤类器官被广泛应用于药物的筛选和疗效评价，以探讨针对患者的个性化治疗策略。国外学者研究发现，患者来源的胶质母细胞瘤类器官可以保持亲代肿瘤的关键特征，包括组织学特征、细胞多样性、基因表达和突变谱。
3.虽然胶质母细胞瘤类器官维持了亲代肿瘤的一些生物学特性，但是目前尚未建立完整的评估体系。rna二代测序可以检测基因在转录组水平的表达。相关研究虽然对胶质母细胞瘤类器官进行rna二代测序，但并未深入挖掘其中的生物学信息，也没有充分利用测序的数据去评估胶质母细胞瘤类器官的生物学特性。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种基于rna二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统。
5.本发明所采用的技术方案为：一种基于rna二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，包括：
6.制备亲代胶质母细胞瘤组织样本和无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本；制备并处理有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本；
7.将所述无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本和有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本在rna二代测序分析模块中进行评估，所述亲代胶质母细胞瘤组织样本作为对照；
8.所述分析模块包括差异基因分析模块、转录组突变分析模块、可变剪切分析模块、免疫浸润分析模块、趋势分析模块、以及在线网址进行分析和作图功能富集分析模块；
9.所述差异基因分析模块为分析样本间rna差异表达的fdr阈值和差异倍数值；
10.所述转录组突变分析模块为分析转录本的突变体；采用annovar进行单核苷酸多态性的功能、基因组位点和突变位点的注释；
11.所述可变剪切分析模块为识别分析样本间的差异可变剪切；
12.所述免疫浸润分析模块为将表达矩阵上传至timer2.0数据库分析样本间的免疫细胞浸润情况；计算样本的肿瘤纯度；
13.所述趋势分析模块为将上述各样本经二代测序后得到的基因表达量矩阵，按时间顺序进行聚类，采用the short time-series expression miner software软件进行处理；
14.所述在线网址进行分析和作图功能富集分析模块为分析所述趋势分析模块中的结果基因，采用假设检验计算、fdr阈值校正。
15.上述差异基因分析模块为采用edger软件进行分析；
16.上述转录组突变分析模块为采用gatk软件进行分析；采用annovar进行单核苷酸多态性的功能、基因组位点和突变位点的注释；
17.上述可变剪切分析模块为采用rmats软件识别分析样本间的差异可变剪切；
18.上述免疫浸润分析模块为将表达矩阵上传至timer2.0数据库分析样本间的免疫细胞浸润情况；采用estimate软件计算样本的肿瘤纯度。
19.作为优选地，所述fdr阈值为低于0.05且差异倍数不低于2。
20.作为优选地，所述制备亲代胶质母细胞瘤组织样本的步骤包括：
21.将离体肿瘤组织样本在4℃无菌pbs缓冲液中冲洗后，在-80℃保存。
22.作为优选地，所述制备无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
23.将离体肿瘤组织样本在4℃无菌pbs缓冲液中冲洗后，用无菌剪将肿瘤组织剪成1-2mm直径的碎片，在-80℃保存。
24.作为优选地，所述制备有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
25.将离体肿瘤组织样本在4℃无菌pbs缓冲液中冲洗并剪成1-2mm直径的碎片后，置于培养基中进行培养，培养完成后用pbs缓冲液重悬后与水凝胶混匀、交联；
26.所述处理有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
27.将有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本，采用甲基丙烯酸化水凝胶裂解液将样本中的水凝胶裂解，1000-1200rpm离心5-6分钟，再用缓冲液将肿瘤组织碎片重悬，再次1000-1200rpm离心5-6分钟，弃上清，在-80℃保存。
28.作为优选地，所述培养基配制为235ml dmem:f12培养基 235ml神经基础培养基 5ml l-谷氨酰胺添加剂 5ml青霉素/链霉素双抗 5ml n2添加剂 10ml b27添加剂 5ml非必须氨基酸溶液 125ul人胰岛素组成。
29.作为优选地，所述水凝胶由甲基丙烯酸化水凝胶和透明质酸混合而成；
30.所述甲基丙烯酸化水凝胶和透明质酸混合质量份数比为10:0.4-0.5。
31.作为优选地，所述重悬后与水凝胶混匀的胶质母细胞瘤组织样本的体积比为1:1。
32.作为优选地，所述交联时采用400-405nm的紫外光进行交联处理；
33.所述交联时长20-30秒。
34.本发明的有益效果为：
35.本发明提供了一种基于rna二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，该系统是利用rna二代测序结果，可以对胶质母细胞瘤类器官的生物学特性进行评估。
36.该评估系统有助于评估不同方法制作的胶质母细胞瘤类器官是否反映了亲代肿瘤的生物学特性，为不断优化胶质母细胞瘤类器官的制作方法提供生物学上的依据。
附图说明
37.图1为治疗胶质母细胞瘤药物的靶基因在亲代肿瘤和类器官中的表达热图；
38.图2为胶质母细胞瘤类器官和亲代肿瘤中转录组突变和可变剪切分布示意图；
39.图3为免疫细胞浸润和肿瘤微环境分析；
40.图4为胶质母细胞瘤类器官培养过程中的基因变化趋势分析-go富集分析示意图；
41.图5为胶质母细胞瘤类器官培养过程中的基因变化趋势分析-kegg富集分析示意图。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
43.实施例1：针对上述现有技术对rna二代测序数据利用不充分以及不能全面评估胶质母细胞瘤类器官生物学特性的缺点，发明人利用rna二代测序的结果，通过关键基因的差异分析、可变剪切分析、突变分析、免疫浸润分析、趋势分析，全方位去评估胶质母细胞瘤类器官的生物学特性。
44.一、制备胶质母细胞瘤类器官：
45.1、制备亲代胶质母细胞瘤组织样本的步骤包括：
46.将离体肿瘤组织样本在4℃无菌pbs缓冲液中冲洗后，在-80℃冰箱保存。
47.2、制备无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
48.将离体肿瘤组织样本在4℃无菌pbs缓冲液中冲洗后，用无菌剪将肿瘤组织剪成1-2mm直径的碎片，在-80℃冰箱保存。
49.3、制备有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
50.将离体肿瘤组织样本在4℃无菌pbs缓冲液中冲洗并剪成1-2mm直径的碎片后，置于培养基中进行培养，培养完成后用pbs缓冲液重悬后与水凝胶混匀、交联。
51.3.1培养基的配制：235ml dmem:f12培养基(thermo fisher scientific) 235ml神经基础培养基(neurobasal,thermo fisher scientific) 5ml l-谷氨酰胺添加剂(100
×
glutamax,thermo fisher scientific) 5ml青霉素/链霉素双抗(100
×
penstrep,thermo fisher scientific) 5ml n2添加剂(100
×
n2 supplement,thermo fisher scientific) 10ml b27添加剂(50
×
b27 supplement,minus vitamin a) 5ml非必须氨基酸溶液(100
×
neaas，thermo fisher scientific) 125ul人胰岛素(human insulin，sigma)。
52.3.2制备水凝胶：将10％(w/v)的gelma(efl-gm-60，中国苏州)和0.5％(w/v)的ha(efl-ha-150k，中国苏州)的混合物在70℃水浴中加热20分钟。然后立即用0.45um过滤器过滤水凝胶。水凝胶过滤后，在37℃水浴锅中预热。
53.上述将亲代胶质母细胞瘤组织样本作为对照；一组不用水凝胶培养，另外一组加入水凝胶进行培养。
54.上述进行分组的目的：是为了用不同的方法建立类器官，便于进行后续的对比。
55.二、rna二代测序及相关评估流程：
56.2.1rna二代测序：
57.亲代胶质母细胞瘤组织样本和无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官，则直接用pbs重
悬后，1000rpm离心5分钟，弃上清，保存在-80℃的冰箱。
58.对于有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官，先用gelma裂解液将水凝胶裂解，1000rpm离心5分钟，再用pbs将肿瘤组织碎片重悬，再次1000rpm离心5分钟，弃上清，保存在-80℃的冰箱。
59.2.2将上述收集好的各胶质母细胞瘤类器官直接送公司进行rna二代测序。
60.2.3差异基因分析：用edger软件分析两样本间rna差异表达，fdr低于0.05且fold change≥2的基因则是差异表达基因。
61.差异基因分析主要是分析胶质母细胞瘤的关键基因，这些关键基因的表达可以提示该肿瘤是否为胶质母细胞瘤。因此这些关键基因的差异分析可以用于评估胶质母细胞瘤类器官在生物学的本质是否接近真正的胶质母细胞瘤。
62.2.4转录组突变分析：使用gatk软件分析转录本的突变体，进一步使用annovar进行单核苷酸多态性(snp/indel)注释。分析了snp的功能、基因组位点和突变位点。
63.2.5可变剪切分析：
64.rmats软件(版本4.0.1)(http://rnaseq-mats.sourceforge.net/index.html)用于识别可变剪切事件，并分析样本之间的差异可变剪切。最终将fdr《0.05的可变剪切事件作为有显著差异的可变剪切事件。
65.转录组突变分析及可变剪切分析可以反映出影响基因表达的相关因素，这两个分析可以在一定程度上进一步解释为什么胶质母细胞瘤类器官维持了关键基因的表达。
66.2.6免疫浸润分析：将表达矩阵上传至timer2.0数据库，即可分析得到样本的免疫细胞浸润情况。同时用estimate软件计算样本的肿瘤纯度。
67.免疫浸润分析可以评估胶质母细胞瘤类器官微环境是否与亲代肿瘤接近，对利用胶质母细胞瘤类器官探索免疫治疗提供依据。
68.2.7趋势分析：将第0天类器官，也就是亲本类器官，培养第7天类器官以及培养第14天类器官的测序数据进行聚类。然后从聚类结果中挑选符合一定生物学特性(如表达量持续上升)的基因集。通过shorttime-series expression miner软件，输入所有差异基因的表达量，然后选择参数(-pro 20-ratio 1.0000[log2(2)＝1,log2(1.5)＝0.5849625,log2(1.2)＝0.2630344])，进行趋势分析。然后对各个趋势中的基因进行go/kegg功能富集分析，并通过假设检验计算得到p value。得到的p value通过fdr校正之后，以fdr≤0.05为阈值，满足此条件的go term和pathway，定义为在该趋势中显著富集的go term和pathway。go term和kegg pathway是在线网址进行分析和作图(https://www.omicshare.com/tools)。
[0069]
趋势分析主要用于分析在胶质母细胞瘤类器官培养过程中，在转录组水平上，哪些基因可以稳定表达，哪些基因不稳定表达，将有变化趋势的基因作为不稳定表达的基因，将无变化趋势的基因作为稳定表达的基因。对于在胶质母细胞瘤类器官培养过程中可以稳定表达的基因，可以将胶质母细胞瘤类器官作为研究这些基因的体外实验工具。
[0070]
三、具体评估分析流程如下所示：
[0071]
3.1关键基因的差异分析：
[0072]
其中，表1和表2是关键基因的差异表达结果。
[0073]
注：fdr低于0.05，绝对值log2 fold change≥1的基因则是差异基因。"vs"左边是
对照组，"original_gbm"代表亲代肿瘤，"gelma_ha"代表有水凝胶的类器官，"medium"代表无水凝胶的类器官。
[0074]
表1：关键基因差异分析
[0075]
[0076]
[0077][0078]
表2：关键基因差异分析
[0079]
[0080][0081]
[0082]
上述表1和表2中，包括神经发育的相关基因以及药物的靶点基因。胶质瘤干细胞标记基因sox2和olig2、胶质标记基因gfap和s100b、神经祖标记基因nes、hopx和fabp7以及细胞增殖标记基因mki67。
[0083]
表1结果显示：
[0084]
有水凝胶类器官在第7天维持了fabp7、sox2和kmi67的表达水平，而不含水凝胶的类器官仅在第7天维持了kmi67的表达水平。
[0085]
在药物靶基因方面，两种类型的类器官在第7天维持了靶基因pten、tnks、mtor、cdk12和nf1的表达。无水凝胶的类器官在第7天维持from1的表达，但有水凝胶的类器官在第7天没有维持from1的表达。
[0086]
表2结果显示：
[0087]
有水凝胶的类器官在第14天维持了hopx的表达，而没有水凝胶的类器官在这个时间点没有维持hopx的表达。
[0088]
在第14天，两种类器官均维持tnks/crbn表达。无水凝胶的类器官在第14天维持了pten/mtor/cdk12的表达，但有水凝胶的类器官则没有维持这些基因的表达。在第14天，使用水凝胶的类器官维持了egfr的表达，而无水凝胶的类器官在这个时间点没有维持egfr的表达。
[0089]
egfr是治疗胶质母细胞瘤的经典药物靶基因，无论是第7天还是第14天，有水凝胶的类器官中egfr的表达量均高于无水凝胶但的类器官。
[0090]
这些结果表明，水凝胶和无水凝胶的类器官在维持药物靶基因表达方面存在一定的差异，各有优势。
[0091]
值得注意的是，表1和表2中，水凝胶组中大部分关键基因的表达水平高于或等于无水凝胶组。这些结果表明，有水凝胶类器官中可以较好维持一些神经发育的基因表达。
[0092]
如图1所示，展示了药物靶基因对应的药物以及目前药物在临床中的应用。只要类器官中基因的表达相对于亲代肿瘤是上调或者是无变化的，都说明类器官维持了该基因的表达。
[0093]
3.2可变剪切和转录组突变分析：
[0094]
图2为胶质母细胞瘤类器官和亲代肿瘤中转录组突变和可变剪切分布。其中，(a-d)为亲代肿瘤和类器官中转录组突变类型、位置和可变剪切的组成和比例。(e-h)亲代肿瘤与亲代肿瘤之间可变剪切的差异表达。
[0095]
注："vs"左边是对照组，"original_gbm"代表亲代肿瘤，"gelma_ha"代表有水凝胶的类器官，"medium"代表无水凝胶的类器官。fdr《0.05表示有显著差异的可变剪切事件。
[0096]
图2中结果所示，尽管与亲代肿瘤相比，两种类型类器官中转录组变异类型、变异位置和选择性剪接的数量减少。
[0097]
但除了突变位点(图2的(a))外，类器官中的转录组突变类型以及可变剪切事件的百分比与亲代肿瘤中的百分比相似(图2的(b)-(d))。
[0098]
图2的(e)-(h)结果显示，与亲代肿瘤相比，类器官中约70％-90％的转录组变异以及可变剪切事件没有发生明显变化，这表明类器官维持了可变剪接及部分突变。
[0099]
3.3免疫细胞浸润分析：
[0100]
肿瘤组织中免疫细胞浸润情况可对免疫治疗的免疫应答起到一定的参考作用。
[0101]
如图3为免疫细胞浸润和肿瘤微环境分析。其中，(a)和(b)为timer2.0工具测定的亲代肿瘤和类器官中免疫细胞的比例和浸润情况。(c)-(e)为类器官培养第0天(亲代肿瘤)、第7天和第14天的基质评分、免疫评分和肿瘤纯度评分。
[0102]
图3中的(a)和(b)的免疫细胞浸润分析表明：巨噬细胞在类器官和亲代肿瘤中所占比例最高。然而，在不同的算法中，其他免疫细胞的比例以及浸润程度在亲代肿瘤和类器官之间是不同的。
[0103]
图3中的(c)中，在肿瘤微环境评分中，有水凝胶的类器官免疫评分总体上高于无水凝胶的类器官。
[0104]
图3中的(d)中，但其基质评分低于无水凝胶的类器官。
[0105]
图3中的(e)中，最终的肿瘤纯度评分可以看出，有水凝胶的类器官其肿瘤纯度高于无水凝胶的类器官。
[0106]
3.4趋势分析：将亲代肿瘤作为类器官培养的第0天，将第0天、第7天、第14天的测序数据进行趋势分析。
[0107]
如图4和5为类器官培养过程中的基因变化趋势分析；
[0108]
图4为胶质母细胞瘤类器官培养过程中的基因变化趋势分析-go富集分析示意图；
[0109]
图5为胶质母细胞瘤类器官培养过程中的基因变化趋势分析-kegg富集分析示意图。
[0110]
其中，图4的(a)和(b)有颜色的表示有变化趋势的基因集，没有颜色的表示没有变化趋势的基因集。(c)有水凝胶的类器官中无变化趋势基因的go富集(前20项)。(d)水凝胶的类器官中有变化趋势基因的go富集(前20项)。(e)无水凝胶的类器官中无变化趋势基因的go富集(前20项)。(f)无水凝胶的类器官中有变化趋势基因的go富集(前20项)。
[0111]
图4的(a)和(b)，将有变化趋势和无变化趋势的基因分成两个基因集。图4的(a)-(e)中，无变化趋势的基因用来代表在类器官培养过程中可以稳定表达的基因。而有变化趋势的基因代表在类器官培养过程中不稳定表达的基因。最后发明人通过kegg和go富集分析展示这些基因富集的相关通路和功能。
[0112]
如图5为，(a)有水凝胶的类器官中无变化趋势基因的kegg富集通路(前20项)。(b)水凝胶的类器官中有变化趋势基因的kegg富集通路(前20项)。(c)无水凝胶的类器官中无变化趋势基因的kegg富集通路(前20项)。(d)无水凝胶的类器官中有变化趋势基因的kegg富集(前20项)。
[0113]
图5的(c)-(f)在go富集分析中，类器官无变化趋势的基因主要富集在“biological process”，而有变化趋势的基因主要富集在“cellular component”。
[0114]
图5的(a)中，kegg通路富集分析显示，在有水凝胶的类器官中，无变化趋势的基因主要富集通路为“osteoclast differentiation”和“lysosome”。
[0115]
图5的(c)中，而在无水凝胶的类器官中，无变化趋势的基因主要富集在“cytokine-cytokine receptor interaction”。
[0116]
图5的(b)和(d)中，“calcium signal pathway”是两组类器官中有变化趋势基因富集程度最高的通路。
[0117]
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护
范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。