抗ROR1抗体及其制备方法与应用与流程

抗ror1抗体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种抗ror1抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ror1)属于受体酪氨酸激酶家族，该家族包括ror1和ror2。两种ror受体在胎儿和胚胎发育过程中大量表达，但在健康成人的组织中表达程度降低。已知ror1和ror2通过激活平面细胞极性(planar cell polarity,pcp)和来自非典型wnt信号的ca
2
途径来调节多种细胞过程，包括细胞分裂、增殖、迁移和趋化性。两种ror受体具有共同的分子结构，由细胞外结构域(extracellular domain,ecd)、跨膜结构域和细胞内结构域(intracellular domain,icd)组成，其中ecd由免疫球蛋白样、富半胱氨酸结构域(ig-like,cysteine rich domain)和克林格结构域(kringle domain)组成，icd由酪氨酸激酶样结构域和两个位于icd末端富含脯氨酸的结构域两侧的丝氨酸/苏氨酸结构域组成。尽管还需要对不同细胞模型中的ror同源或异源二聚化机制进行更多研究，来自非典型wnt途径的wnt5a已被证明会与ror1和ror2结合，并诱导受体异二聚化。除此之外，其他wnt配体已被证明在各种细胞环境中能够与ror1或ror2相互作用，例如tcf3-pbx1 b细胞急性淋巴细胞白血病中的wnt16-ror1相互作用。
3.尽管ror1在正常胚胎和胎儿发育过程中表达，但其在大多数成熟组织中不表达，仅在脂肪组织中可观察到低水平的ror1表达，以及在胰腺、肺和部分中间b细胞中有较低程度的表达。然而，在许多血液瘤和恶性实体瘤中观察到ror1的表达，例如慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)，以及卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和结直肠癌。肿瘤细胞中ror1的高表达有助于提高细胞存活率、增殖率、迁移率和趋化性，wnt5a配体的结合导致ror1受体二聚化和各种衔接蛋白的募集，触发下游rho/rac1 gtpases、pi3k/akt和hippo-yap/taz途径的激活，最终导致肿瘤进展及对化疗药物产生耐药性。
4.肿瘤转移和耐药是癌症治疗面临的挑战，最近，有力的证据表明ror1的表达与癌症干细胞(csc)、上皮间质转化(emt)和耐药性有关，成为肿瘤转移和复发的关键因素。有趣的是，在乳腺癌等肿瘤中，ror1蛋白表达上调促进yap/taz转录和/或多梳复合蛋白bmi-1的表达，从而促进肿瘤发生，这表明由wnt5a-ror1参与的非典型wnt途径能够导致肿瘤恶性转变(karvonen et al.,cells,2019 aug 2；8(8))。
5.ror1在癌症发展和转移中的重要作用促使研究人员探索ror1在癌症中的功能，开发针对ror1的靶向癌细胞的免疫疗法。因此，ror1是一个肿瘤相关/肿瘤特异性抗原，抗ror1单克隆抗体可做为有潜力的抗癌疗法。针对ror1最重要的策略之一是开发针对该受体的单克隆抗体，该抗体已被证明具有良好的临床前功效。
6.综上所述，本领域需要更有效的治疗方法可以有效抑制ror1活性同时对人类不良反应较弱的抗ror1抗体。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种特异性结合ror1和/或有效抑制ror1活性的抗ror1抗体或其抗原结合片段。
8.本发明基于抗ror1抗体，该抗体可用于靶向表达ror1的细胞以达到治疗和诊断目的。
9.第一部分，本发明提供了包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的多肽序列选自：
10.a.seq id nos：2、3、4、6、7、8；或
11.b.seq id nos：16、17、18、20、21、22；或
12.c.seq id nos：30、31、32、34、35、36；
13.其中，抗体或其抗原结合片段特异性结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)，优选人ror1；以及
14.任一上述多肽序列还包括由1-5(或1、2、3)个氨基酸任选地添加、删除、修饰和/或取代形成，并且能够保留ror1结合亲和力的衍生序列。
15.本发明还提供了包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的多肽序列选自：
16.a.seq id nos：9、10、11、12、13的第1-2位氨基酸(da)、14；或
17.b.seq id nos：23、24、25、26、27的第1-2位氨基酸(da)、28；或
18.c.seq id nos：37、38、39、40、41的第1-2位氨基酸(da)、42；
19.其中，抗体或其抗原结合片段特异性结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)，优选人ror1；以及
20.任一上述氨基酸序列还包括由1-5(或1、2、3)个氨基酸任选地添加、删除、修饰和/或取代形成，并且能够保留ror1结合亲和力的衍生序列。
21.在优选的实施方案中，本发明的抗体重链还包括重链恒定区和/或轻链还包括轻链恒定区。
22.在优选的实施方案中，本发明衍生抗体对ror1的亲和力f1与相应非衍生抗体对ror1的亲和力f0之比(f1/f0)为0.5-2，优选为0.7-1.5，更优选为0.8-1.2。
23.在优选的实施方案中，本发明抗体的3个hcdr和3个lcdr中添加、删除、修饰和/或取代的氨基酸数目为1-5个(例如1-3个，优选为1-2个，更优选为1个)。
24.在优选的实施方案中，本发明的抗体的重链可变区进一步包含人或人源化框架，和/或抗体的轻链可变区进一步包含人或人源化框架。
25.在优选的实施方案中，本发明的抗体是双链抗体或单链抗体。
26.在优选的实施方案中，本发明的抗体是全长抗体蛋白或抗原结合片段。
27.在优选的实施方案中，本发明的抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
28.在优选的实施方案中，本发明的抗体是药物偶联物的形式。
29.在优选的实施方案中，本发明分离的单克隆抗体或其抗原结合片段的多肽序列选自：
30.a.具有seq id no：1的多肽序列的重链可变区和具有seq id no：5的多肽序列的轻链可变区；或
31.b.具有seq id no：15的多肽序列的重链可变区和具有seq id no：19的多肽序列的轻链可变区；或
32.c.具有seq id no:29的多肽序列的重链可变区和具有seq id no：33的多肽序列的轻链可变区。
33.在优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
34.在优选的实施方案中，本发明分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。
35.在优选的实施方案中，本发明分离的单克隆抗体是人抗ror1抗体。
36.在优选的实施方案中，本发明的抗体是能够结合ror1的免疫球蛋白样结构域或克林格结构域的ror1特异性抗体。
37.在优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no：1、15或29至少(≥)85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽序列的重链可变区；或具有与seq id no：5、19或33至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽序列的轻链可变区。
38.在优选的实施方案中，ror1特异性抗体的vh链和v
l
链分别与seq id no：1(vh)和seq id no：5(v
l
)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％的序列同一性。
39.在优选的实施方案中，ror1特异性抗体的vh链和v
l
链分别与seq id no：15(vh)和seq id no：19(v
l
)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％的序列同一性。
40.在优选的实施方案中，ror1特异性抗体的vh链和v
l
链分别与seq id no：29(vh)和seq id no：33(v
l
)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％的序列同一性。
41.在优选的实施方案中，ror1特异性抗体是iga、igd、ige、igg或igm。
42.在优选的实施方案中，ror1特异性抗体选自：(i)单链抗体、单链可变区片段(scfv)、缺乏铰链区的单价抗体或微型抗体(minibody)；(ii)fab、fab'或f(ab')2片段；(iii)完整抗体；(iv)包含人igg fc结构域的抗体。
43.在优选的实施方案中，ror1特异性抗体是选自igg1、igg2、igg3、igg4和合成的igg。
44.第二部分，本发明提供了一种重组蛋白(或多肽)，其包含：
45.(1)本发明第一部分的抗体或其抗原结合片段；和
46.(2)辅助表达和/或纯化的可选标签序列。
47.在优选的实施方案中，标签序列包含6his标签。
48.在优选的实施方案中，重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
49.在优选的实施方案中，重组蛋白是单体、二聚体或多聚体。
50.第三部分，本发明提供了编码本发明第一部分中单克隆抗体或抗原结合片段、或本发明第二部分中重组蛋白的分离核酸。
51.第四部分，本发明提供了一种载体，其包含编码本发明第一部分单克隆抗体或抗原结合片段、或本发明第二部分重组蛋白的分离核酸。
52.在优选的实施方案中，载体包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或其他载体。
53.第五部分，本发明提供了一种工程化宿主细胞，其基因组中包含第三部分的核酸、或第四部分的载体。
54.在优选的实施方案中，宿主细胞包括免疫细胞，优选t细胞或nk细胞。
55.第六部分，本发明提供了一种抗体偶联物，其包含：
56.(1)选自本发明第一部分的抗体或其抗原结合片段、本发明第五部分的重组蛋白、或其组合；和
57.(2)偶联至抗体的偶联部分，该偶联部分选自可检测标记、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶或其组合。
58.在优选的实施方案中，抗体部分和偶联部分通过化学键或铰链偶联。
59.第七部分，提供了表达本发明第一部分中的抗体或其抗原结合片段的免疫细胞。
60.在优选的实施方案中，抗体作为细胞膜蛋白暴露，其中，抗体作为细胞外元件。优选地，抗体是scfv的形式。
61.在优选的实施方案中，免疫细胞包括nk细胞和t细胞。
62.在优选的实施方案中，免疫细胞是自体或同种异体的。
63.在优选的实施方案中，免疫细胞是car-t细胞。
64.第八部分，本发明提供一种药物组合物，其包含：
65.(1)第一部分中分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二部分的重组蛋白、第三部分的分离核酸(特别是dna或rna)、第四部分的载体、第六部分的抗体偶联物、第七部分的免疫细胞、或以上的组合，以及
66.(2)药学上可接受的载体。
67.在优选的实施方案中，药物组合物是液体制剂。
68.在优选的实施方案中，药物组合物是注射剂。
69.第九部分，本发明提供一种活性成分的用途，包括：
70.(1)用于制备诊断试剂或试剂盒；和/或
71.(2)用于制备预防和/或治疗与ror1异常表达或功能异常相关疾病的药物，其中，活性成分选自第一部分的分离单克隆抗体或其抗原结合片段、第二部分的重组蛋白、第三部分的分离核酸(特别是dna或rna)、第四部分的载体、第六部分的抗体偶联物、第七部分的免疫细胞，以及其组合。
72.在优选的实施方案中，诊断试剂是测试条或测试盘。
73.在优选的实施方案中，与ror1的表达或功能异常相关的疾病包括癌症。
74.在优选的实施方案中，上述癌症是ror1阳性癌症。
75.在优选的实施方案中，上述癌症包括非实体瘤。
76.在优选的实施方案中，上述癌症是血液恶性肿瘤。
77.在优选的实施方案中，上述血液恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(cll)或急性淋巴细胞白血病(all)。
78.在优选的实施方案中，上述癌症包括实体瘤。
79.在优选的实施方案中，上述实体瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌和肾癌。
80.在优选的实施方案中，诊断试剂或试剂盒用于：
81.(1)检测样品中的ror1蛋白；和/或
82.(2)检测肿瘤细胞内源性ror1蛋白；和/或
83.(3)检测表达ror1蛋白的肿瘤细胞。
84.在优选的实施方案中，抗体是抗体-药物偶联物(adc)的形式。
85.第十部分，本发明提供一种样品中ror1蛋白的体外检测(包括诊断性或非诊断性检测)方法，步骤包括：
86.(1)使样品在体外与本发明第五部分的抗体接触；
87.(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，复合物的形成说明样品中存在ror1蛋白。
88.第十一部分，本发明提供一种试剂盒，包括：
89.(1)第一容器，其含有本发明的抗体作为第一抗体；和
90.(2)第二容器，其含有针对本发明第一抗体的第二抗体。
91.第十二部分，本发明提供一种重组多肽的制备方法，包括：
92.(1)在适合表达的条件下培养本发明第五部分中的工程化宿主细胞；
93.和
94.(2)从培养物中分离重组多肽，其中，重组多肽是第一部分的单克隆抗体或其抗原结合片段，或第二部分的重组蛋白。
95.第十三部分，本发明提供一种药物组合，包括：
96.(1)第一活性成分，其选自第一部分的分离单克隆抗体或其抗原结合片段、第二部分的重组蛋白、第三部分的分离核酸(特别是dna或rna)、第四部分的载体、第六部分的抗体偶联物、第七部分的免疫细胞，以及其组合；
97.(2)作为第二抗体或化疗剂的第二活性成分。
98.在优选的实施方案中，上述第二抗体选自ctla4抗体、pd-1抗体、pd-l1抗体、4-1bb抗体，以及其组合。
99.在优选的实施方案中，上述化疗剂选自多西紫杉醇、卡铂或其组合。
100.第十四部分，本发明提供一种治疗与ror1表达异常或功能障碍相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的第一部分的分离单克隆抗体或其抗原结合片段、第二部分的重组蛋白、第三部分的分离核酸(特别是dna或rna)、第四部分的载体、第六部分的抗体偶联物、第七部分的免疫细胞、第八部分的药物组合物或其组合。
101.在优选的实施方案中，与ror1表达异常或功能障碍相关的疾病是癌症。
102.在优选的实施方案中，上述方法进一步包括：在施用第一活性成分之前、期间和/或之后向受试者施用安全有效量的第二抗体。
103.在优选的实施方案中，上述癌症包括非实体瘤。
104.在优选的实施方案中，上述癌症是血液恶性肿瘤。
105.在优选的实施方案中，上述血液恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(cll)或急性淋巴细胞白血病(all)。
106.在优选的实施方案中，上述癌症包括实体瘤。
107.在优选的实施方案中，上述实体瘤是乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌或肾癌。
108.第十五部分，本发明提供一种确定受试者体内ror1水平的方法，包括：
109.(1)从受试者获得样品；
110.(2)将样品与本发明的分离单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
111.(3)确定受试者的ror1水平。
112.优选地，样品是组织样品或血液样品，并且组织样品可以是癌组织样品。
附图说明
113.图1为人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)的结构示意图，包括ror1的免疫球蛋白样(ig-like)结构域、卷曲(frizzled)域和克林格(kringle)结构域、ror1衍生的细胞外结构域片段，以及ror1的跨膜和细胞内酪氨酸激酶结构域。
114.图2包含图2a和图2b，显示了使用ror1抗体进行elisa结合分析的结果。图2a显示抗体对人ror1具有结合能力；图2b显示抗体也具有与鼠ror1结合的能力。
115.图3显示cho-k1-ror1的facs结合分析的结果。
116.图4显示使用fortebio测试得到的ror1抗体kd值。
117.图5包括图5a和5b，显示了单克隆抗体与不同ror1细胞外结构域的结合。图5a显示抗体克隆g6与ror1的免疫球蛋白样结构域结合；图5b显示了抗体克隆c3和g3与ror1的克林格结构域结合。
118.图6和图7表示抗体克隆c3的vh和v
l
氨基酸序列，其中cdr部分添加下划线。
119.图8和图9表示抗体克隆g3的vh和v
l
氨基酸序列，其中cdr部分添加下划线。
120.图10和图11表示抗体克隆g6的vh和v
l
氨基酸序列，其中cdr部分添加下划线。
121.图12显示抗ror1抗体克隆c3的抗肿瘤活性结果。
具体实施方式
122.发明人通过深入研究和广泛筛选意外获得了一组具有全新氨基酸序列的全人源ror1抗体，该ror1抗体与人ror1蛋白具有极高的亲和力，并且对人的免疫原性极低甚至无免疫原性，可用于治疗肿瘤等ror1相关疾病，本发明是在此基础上完成的。
123.定义：
124.除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。在其他情况下，本文使用的某些术语会在说明书中阐明其含义。
125.须注意，除非上下文另外明确指出，在本发明的说明书和权利要求书中所使用单数的“一个”、“一种”和“该”包括其复数含意。
126.除非另有说明，任何数值如本文所述的浓度或浓度范围，在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包含所述值的
±
10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同理，浓度范围为1％至10％(w/v)便包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。本文的数值范围明确地包括所有可能的子范围、范围内的所有单个数值，以及该范围内的整数和分数。
127.除非另有说明，在一系列要素中的术语“至少”应理解为包含该系列中的每个要素。本领域技术人员能够认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的发明具体实施方式或许多等同方案。本发明涵盖这样的等同内容。
128.本文中所使用的术语“包括”、“包含”、“具有”或任何其他相似词将被理解为包括所陈述的整数或整数组合，但不排除任何其他整体或整体的组合，并且意为非排他性的或开放式的。例如，组合物、混合物、制成、方法、物品或设备，这些词不需要仅限于字词上的元素，而是可以在这些词语上包括未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确指出相反的意思，否则“或”是指包含的“或”而非排他的“或”。举例来说，条件a或b满足以下任一条件：a为真(或存在)且b为假(或不存在)、a为假(或不存在)且b为真(或存在)、a和b都为真(或存在)。
129.本文中所使用多个列举的元素之间的结合术语“和/或”，应理解为涵盖单独元素和组合元素。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一种适用选项是指有第一个元素而没有第二个元素；第二种适用选项是指有第二个元素但没有第一个元素的情况；第三种适用选项是指第一和第二元素皆有。这些任一选项或适用一个以上选项的状况应被认定在上述含义内，并且满足本文使用术语“和/或”的标准。
130.在本说明书和权利要求书中使用的术语“由
……
组成”或其他相似词，表示包括任何所述元素的整体或整体的组合，但不能将额外的元素或整体的组合添加到指定的方法、结构或组合中。
131.在本说明书和权利要求书中所使用“基本上由
……
组成”或其他相似词，表示包括任何列举的整体或整体的组合，并且可选择地包含任何不会实质改变特定方法、结构或组成的基本或新颖性质的整体或整体的组合。
132.本文中的“受试者”是指任何动物，较佳选择为哺乳动物，最合适者为人类。如本文所示，术语“哺乳动物”泛指任何哺乳动物，例子包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠、猴子、人类等，但最佳的选择为人类。
133.本文所使用的术语“右”、“左”、“下”和“上”表示参考附图中的方向。
134.当提及该发明要件的尺寸或特性时，与本领域的技术人员普遍所理解的一致，本文所使用的术语“大约”、“大致”、“基本上”、“实质上”和相似术语，这些词语并非严格限定所描述的尺寸/特性范围或参数，但不排除其在功能上相同或相似的微小变动。至少在本领域公认的数学和工业原理(例如四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)使用数字参数的此类引用包含变量，但并不会改变最低有效数字。
135.在两个或多个核酸或多肽序列(例如抗ror1抗体和编码它们的多核苷酸、ror1多肽和编码它们的ror1多核苷酸)的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当使用序列比对算法或目视检查进行比较和对齐以获得最大一致时，两个或多个序列或子序列其相同或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比。
136.序列比对通常用一个序列充当参考序列与测试序列进行比较。使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时设定子序列坐标，并设定算法程序参数，然后，序列比对算法基于设定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
137.可用于进行比较的最佳序列比对方法包括smith&waterman,adv.appl.math.2:
482(1981)的局部同源算法、needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源比对算法、pearson&lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似性法，通过计算机实现这些算法(gap,bestfit,fasta,and tfasta in the wisconsin genetics software package,genetics computer group,575science dr.,madison,wi)，或通过目视检查实现(参见generally,current protocols in molecular biology,f.m.ausubel et al.,eds.,current protocols,a joint venture between greene publishing associates,inc.and john wiley&sons,inc.,(1995supplement)(ausubel))。
138.适合用来确定序列同一性百分比和序列相似性的实施例是blast和blast 2.0算法，其在altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul et al.(1997)nucleic acids res.25:3389-3402中分别有描述。执行blast分析的软件可由国家生物技术信息中心(ncbi)公开获得，该算法首先通过识别查询序列中长度为w的短片段(word)来识别高分值片段对(high scoring sequence pairs,hsps)，当与数据库序列中相同长度的片段对齐时，这些片段匹配或满足某个正阈值分数t，t被称为邻域片段(neibourhood words)得分阈值(altschul et al.，同上)，这些初始邻域片段命中(hits)作为启动搜索寻找包含它们在内更长的hsp的种子(seeds)，然后沿着每个序列向两个方向扩展片段命中，直到累积对齐分值增加。
139.对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；》0)和n(错配残基的惩罚分数；《0)计算累积分值。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积分值。在下列情况下，片段命中在各个方向的扩展将停止：累积对齐分值从其最大实现值下降了数量x；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分值变为零或更低；或到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度，blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用片段长度(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链的对照。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用片段长度(w)为3、期望值(e)为10，以及bloseim62打分矩阵(参见henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.etsa 89:10915(1989))。
140.除了计算序列同一性百分比外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见如karlin&altschul,proc.natt.acad.sci.etsa 90:5873-5787(1993))，blast算法提供的一相似性计算是最小总概率(p(n))，它指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率，例如假设测试核酸与参考序列的比较中，最小总概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
141.如下所述，两个核酸序列或多肽基本相同的进一步指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽在免疫学上交叉反应，由此，该多肽通常与第二多肽基本相同，例如两个肽仅在保守取代上不同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。
142.本文中所用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链，并且核酸是核苷酸的聚合物，因此本文使用的核酸和多核苷酸是可互换使用的。本领域技术人员公知核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”，单体核苷酸可以水解成核苷。本文所称的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，包括但不限于重组方式，即从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列、使用普通克隆技术和pcr
tm
等，以及通过合成手段。
143.本文中所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由肽键共价连接的
氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的氨基酸最大数目没有限制。本文所使用的上述术语包含长链和短链，短链在本领域通常也称为肽、寡肽和寡聚体；而对于较长的链，在本领域通常被称为蛋白质，其包含许多类型，例如，“多肽”包括生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。
144.本文所用的术语“抗原结合片段”是指包含与目标抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链至少一个cdr的多肽片段，在本文特别优选的实施方案中，上述抗原是受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)。本文所述抗体的抗原结合片段可包含来自结合ror1的抗体vh和/或v
l
序列上的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个cdr。本文所述的ror1特异性抗体的抗原结合片段能够结合ror1，在其他实施方案中，抗原结合片段的结合阻止或抑制ror1配体与ror1受体结合，中断原本由配体与受体结合而导致的生物反应。在某些实施方案中，抗原结合片段特异性结合和/或抑制或调节ror1的生物活性。
145.术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(例如抗体)结合的分子或蛋白分子的一部分，并且还能够施用于动物以产生能够结合该抗原表位的抗体。一个抗原可能具有一个或多个表位。
146.术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或t细胞受体特异性结合的任何决定簇，优选为多肽决定簇。表位是被抗体结合的抗原区域，在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的目标抗原时，该抗体被称为特异性结合抗原。根据某些实施方案，当抗体-抗原结合的平衡解离常数小于或等于10-6
m，或小于或等于10-7
m，或小于或等于10-8
m时，可以说抗体特异性的结合抗原。在一些实施例中，平衡解离常数可以小于或等于10-9
m，或小于或等于10-10
m。
147.术语“载体”指用于将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适合转化宿主细胞，并带有直接和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体，如果存在内含子，表达包括但不限于转录、转译和rna剪接等过程。
148.抗体
149.本发明总体上涉及分离的抗ror1抗体、编码该抗体的核酸和表达载体、含有该载体的重组细胞和包含该抗体的组合物，还提供了制备抗体的方法，以及使用抗体治疗包括癌症在内的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种所需的功能特性，包括但不限于与ror1高亲和力结合、对ror1的高特异性，以及当单独给药或与其他抗癌疗法联合给药时在有需要的受试者和动物模型中抑制肿瘤生长的能力。
150.一般来说，本发明涉及特异性结合ror1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
151.本文所用的术语“抗体”是广义的用法，包括免疫球蛋白或抗体分子，抗体分子包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链，其结构是众所周知的，根据重链恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类别(即iga、igd、ige、igg和igm)，iga和igg进一步细分为同种型iga1、iga2、igg1、igg2、igg3和igg4，因此，本发明的抗体可以是五个主要类别或相应亚类中的任何一种。优选地，本发明的抗体是igg1、igg2、igg3或igg4。基于其恒定
域的氨基酸序列，脊椎动物物的抗体轻链可归为两种明显不同的类型，即κ和λ，因此，本发明的抗体可包含κ或λ轻链恒定域。根据具体实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区，除了重链和轻链恒定域外，抗体还包含一个抗原结合区，由轻链可变区和重链可变区组成，每个重链可变区都包含三个结构域(即互补决定区1-3；cdr1、cdr2和cdr3)，轻链可变区结构域也称为lcdr1、lcdr2和lcdr3，重链可变区结构域也称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。
152.本文所用的术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与ror1特异性结合的分离的抗体基本上不含不与ror1结合的抗体)，并且，分离的抗体基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
153.本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，意即除了可能少量存在的天然突变之外，构成群体的单个体抗体是相同的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组dna法制备，例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物如转基因小鼠或大鼠获得的b细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
154.本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双特异性抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv1)、二硫键稳定的双特异性抗体、单链抗体分子(scfv)、单域抗体(single domain antibody,sdab)、scfv二聚体(二价双特异性抗体)、由包含一个或多个cdr的抗体其一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或任何其他与抗原结合但不包含完整抗体结构的抗体片段。抗原结合片段能够结合亲本抗体或亲本抗体片段所结合的相同抗原。根据特定实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的fd区段。根据其他特定实施方案，抗原结合片段包含fab和f(ab')。
155.本文所用的术语“单链抗体”是指本领域常规的单链抗体，其包含由约15至20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用的术语“单域抗体”是指本领域常规的单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或仅包含重链可变区。
156.本文所用的术语“人抗体”是指人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备具有与人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体，人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一条人重链和/或轻链多肽的抗体。
157.本文所用的术语“人源化抗体”是指经修饰增加人抗体同源性序列的非人抗体，从而保留抗体的抗原结合特性，同时降低其在人体内的抗原性。
158.本文所用的术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子氨基酸序列源自两种以上物种的抗体。轻链和重链的可变区通常对应源自一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和亲和能力的抗体的可变区，而恒定区对应源自另一种哺乳动物(例如人类)的抗体序列，以避免在该物种中引发免疫反应。
159.本文所用的术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变区序列的抗体，其中，多个免疫球蛋白可变区序列中的第一个免疫球蛋白可变区序列对第一个表位具有结合特异性，且第二个免疫球蛋白可变区序列对第二个表位具有结合特异性。在一实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白的亚基)。在一实施例
中，第一和第二表位重叠或基本重叠。在一实施方案中，第一和第二表位不重叠或基本不重叠。在一实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基)。在一实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五个免疫球蛋白可变区。在一实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
160.本文所用的术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两种抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于包含对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变区序列，以及对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变区序列。在一实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白的亚基)。在一实施例中，第一和第二表位重叠或基本重叠。在一实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基)。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变区序列和轻链可变区序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scfv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scfv或其片段。在一实施方案中，第一表位位于ror1上，第二表位位于pd-1、pd-l1、lag-3、tim-3、ctla-4、egfr、her-2、cd19、cd20、cd33、cd47、cd73、apelin、dll3、claudin18.2、tip-1、cd3和/或其他肿瘤相关免疫抑制因子或表面抗原。
161.本文所用“特异性结合ror1”的抗体是指结合ror1的抗体，优选人ror1，具有1
×
10-7
m或更小，优选1
×
10-8
m或更小，更优选5
×
10-9
m或更小、1
×
10-9
m或更小、5
×
10-10
m或更小、1
×
10-10
m或更小的kd值。术语“k
d”是指解离常数，是从kd和ka的比率(即kd/ka)获得，并以摩尔浓度(m)表示。本技术可以使用本领域的方法确定抗体kd值，举例来说，抗体的kd可以通过使用表面等离子体共振来确定，例如通过使用生物传感器系统(系统)，或通过使用生物层干涉技术，例如octet red96系统。
162.抗体的kd值越小，抗体与目标抗原结合的亲和力越高。
163.本文所用的抗体术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，和来自一物种的抗原特异性结合的抗体也可以和来自一种或多种物种的抗原结合，但是这种跨物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一实施方式中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原，但这种交叉反应本身不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性的结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，表示相互作用取决于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；举例来说，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是蛋白质的一般结构。如果抗体对表位“a”具有特异性，则在含有标记“a”和抗体的反应中，含有表位a(或游离的、未标记的a)的分子的存在会减少标记a与抗体结合的量。
164.在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链cdr集合，分别插入重链和轻链框架区(fr)集合之间，该集合为cdr提供支持并定义了cdr相对于彼此的空间关系。如本文所用的术语“cdr集合”是指重链或轻链可变区的三个高变区，从重链或轻链的n端开始，这些区域分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”，因此，抗原结合位点包括六个cdr，包括来自重链和轻链可变区中的每一个的cdr集合。包含单个cdr(例如cdr1、cdr2或cdr3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。许多抗原-抗体复合物的晶体学分析
表明，cdr的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中与抗原最广泛接触的是重链cdr3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
165.本文所用的术语“fr集合”是指构成重链或轻链可变区的四个位于cdr侧翼的氨基酸序列。一些fr残基可能会接触结合的抗原，然而，frs主要负责将可变区折叠到抗原结合位点，尤其是与cdrs直接相邻的fr残基。在frs中，某些氨基酸残基和某些结构特征是极高度保守的，在这点上，所有可变区序列都包含一个约90个氨基酸残基的内部二硫环。当可变区折叠成结合位点时，cdr呈现为突出的环状模体(motif)，形成抗原结合面。人们普遍认为，无论确切的cdr氨基酸序列为何，fr的保守结构区会影响cdr环折叠成某些“规范的”结构。此外，已知某些fr残基参与稳定抗体重链和轻链相互作用的非共价域间接触。
166.免疫球蛋白可变区的结构和位置可以通过参考kabat,e.a.et.al.,sequences of proteins of immunological interest,4
th edition,us department of health and human services,1987，以及其更新来确定，现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得。
167.本文所用的术语“抗体重链”是指以其天然结构存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中的较大的一种。任何脊椎动物物种的重链都可以归入以下五种不同类别(或同种型)中的一种：iga、igd、ige、igg和igm，这些类别也分别指定为α、δ、ε、γ和μ。igg和iga类别根据序列和功能的差异进一步区分亚类，人类表达以下亚类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。
168.如本文所用的术语“抗体轻链”是指以其天然结构存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种，κ和λ轻链是两种主要抗体轻链同种型。
169.本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为通过合成编码抗体dna分子生成的抗体，并且该dna分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列是使用本领域惯用且众所周知的合成dna或氨基酸序列的技术所获得。
170.在优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3，前述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的多肽序列选自以下组别：
171.a.seq id nos：2、3、4、6、7、8；或
172.b.seq id nos：16、17、18、20、21、22；或
173.c.seq id nos：30、31、32、34、35、36；
174.其中抗体或其抗原结合片段特异性结合ror1，优选人ror1。
175.在优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3，前述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的多肽序列选自以下组别：
176.a.seq id nos：9、10、11、12、13的第1-2位氨基酸(da)、14；或
177.b.seq id nos：23、24、25、26、27的第1-2位氨基酸(da)、28；或
178.c.seq id nos：37、38、39、40、41的第1-2位氨基酸(da)、42；
179.其中抗体或其抗原结合片段特异性结合ror1，优选人ror1。
180.在一优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具
有与seq id no：1、15或29其中之一至少85％、优选90％、更优选95％或以上，例如95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的重链可变区；或具有与seq id no：5、19或33其中之一至少85％、优选90％、更优选95％或以上，例如95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的轻链可变区。
181.在本发明中，本发明的抗体还包括其保守突变体，意即与本发明抗体的氨基酸序列相比，有最多10个，优选最多8个，更优选最多5个，最优选最多3个氨基酸被具有相同或相似特性的氨基酸替换形成的多肽，这些保守突变体多肽优选根据表a的氨基酸置换产生。
182.表a
183.原始残基代表性替换首选替代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
184.本发明涉及编码单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸，本领域技术人员应理解，可以在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下改变(例如替换、删除、插入等)蛋白质的编码序列。因此，本领域技术人员应理解，可以改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。
185.多核苷酸、载体、宿主细胞和制备方法
186.本发明还提供了编码本发明抗体的多核苷酸。
187.本发明还提供包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离核酸的载体。基于本技术公开，可使用本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，例如质粒。载体可包括建立表达载体常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起
点，启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。许多能够将核酸递送至细胞的表达载体是本领域已知并且可在本文中应用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。可使用常规克隆技术或人工基因合成产生基于本发明实施例的重组表达载体，这些技术是本领域技术人员公知的。
188.本发明还提供包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离核酸的宿主细胞。基于本技术公开，本领域技术人员已知的任何宿主细胞均可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌tg1或bl21细胞(用于表达如scfv或fab抗体)、cho-dg44或cho-k1细胞或hek293细胞(用于表达如全长igg抗体)。根据特定的实施方案，重组表达载体通过常规方法如化学转染、热休克或电穿孔转化到宿主细胞中，其稳定地整合到宿主细胞基因组中使得重组核酸被有效表达。
189.本发明还提供一种产生本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码单克隆抗体或其抗原结合片段核酸的细胞，并从细胞或细胞培养物(例如上清液)中回收抗体或其抗原结合片段。表达的抗体或其抗原结合片段可以从细胞中回收，并根据本领域已知的和如本文所述的常规技术进行纯化。
190.如本领域技术人员应当理解的，多核苷酸可包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列，以及表达或可用于表达蛋白质、多肽、肽等的较小工程基因片段，本领域技术人员可以自然分离或修饰合成此类片段。
191.本领域技术人员也应当认识到，多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链，并且可以是dna(基因组、cdna或合成dna)或rna分子，rna分子可以包括包含内含子并以一对一方式对应于dna分子的hnrna分子，以及不包含内含子的mrna分子。额外的编码或非编码序列可以但不是必需存在于本技术的多核苷酸中，并且多核苷酸可以但不是必需连接至其他分子和/或辅助材料。多核苷酸可以包含天然序列，也可以包含编码此类序列的变体或衍生物的序列。
192.通常，多核苷酸变体可包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地，由变体多核苷酸编码的抗体其结合亲和力相对于本技术具体列出的多核苷酸序列编码的抗体基本上不降低。
193.本文所述的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度如何，都可以与其他dna序列组合，例如启动子、聚腺苷酸化信号、额外的限制酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等，因此它们的总长度可能会有很大差异。因此，可以使用几乎任何长度的核酸片段，优选地，在预期的重组dna方案中，其总长度受制备和使用的容易性所限制，例如，总长度为约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对(包括所有中间长度)的示例性多核苷酸片段被认为是有用的。
194.定点突变允许通过使用编码所需突变的dna序列的特定寡核苷酸序列，以及足够数量的相邻核苷酸来产生突变体，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，在被穿过的删除连接片段两侧形成稳定的双链体。可以在选定的多核苷酸序列中采用突变来改善、修改、减少、修饰或以其他方式改变多核苷酸本身的特性，和/或改变所编码多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
195.抗体-药物偶联物(adc)
196.本发明还提供基于本发明抗体的抗体-药物偶联物(adc)。
197.通常，抗体-药物偶联物包含抗体和效应分子，其中抗体与效应分子缀合，优选化学缀合。优选地，效应分子是治疗活性药物，除此此外，效应分子可以是毒性蛋白质、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
198.本发明的抗体和效应分子可以通过偶联剂偶联，偶联剂可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链和利用二硫键的偶联剂中的任何一种或多种。非选择性偶联剂是指使效应分子与抗体通过共价键连接的化合物，如戊二醛等。利用羧基的偶联剂可以是顺式乌头酸酐(cis-aconitic anhydride)偶联剂和酰基腙(acyl hydrazone)偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的一种或多种。
199.抗体上的某些残基(如cys或lys等)用于连接多种官能基团，包括显像剂(如发色团和荧光团)、诊断剂(如mri造影剂和放射性同位素)、稳定剂(如聚乙二醇)和治疗剂。抗体可以与功能剂偶联以形成抗体-功能剂的偶联物，功能剂(例如药物、检测试剂、稳定剂)与抗体透过共价连接偶联，功能剂可以通过连接子直接或间接连接到抗体。
200.抗体可以与药物偶联形成抗体-药物偶联物(adc)。通常，adc包含药物和抗体之间的连接子，连接子可以是可降解的或不可降解的，通常，可降解的连接子在细胞内环境中容易降解，例如连接子在目标位置降解，从而从抗体上释放药物。合适的可降解连接子包括酶可降解连接子，其包括可被细胞中蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)降解的含肽基的连接子；或糖连接子，例如可被葡萄糖醛酸酶降解的含有葡萄糖醛酸苷的连接子。肽基连接子可包括二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸或缬氨酸-丙氨酸。其他合适的可降解连接子包括ph敏感连接子(例如在低于5.5的ph下水解的连接子，例如腙连接子)和在还原条件下降解的连接子(例如二硫键连接子)。不可降解的连接子通常在抗体被蛋白酶水解下释放药物。
201.在与抗体连接之前，连接子具有能够与某些氨基酸残基反应的反应基团，并且通过反应基团实现连接。优选硫醇特异性反应基团，其包括例如马来酰亚胺化合物、卤代(例如碘-、溴-或氯-取代)酰胺；卤代(例如碘-、溴-或氯-取代)酯；卤化(例如碘-、溴-或氯-取代)甲基酮、苄基卤化物(例如碘、溴或氯化物)；乙烯基砜、吡啶基二硫化物；汞衍生物如3,6-二(甲基汞)二恶烷，其中反离子为ch3coo-,cl-or no3-；以及聚亚甲基二甲硫醚硫代磺酸盐。连接子可以包括通过硫代琥珀酰亚胺与抗体连接的马来酰亚胺连接子。
202.药物可以是任何细胞毒性药物、细胞抑制药物或免疫抑制药物。在一实施方案中，抗体通过连接子与药物连接，并且药物具有可与连接子形成键的官能基团，例如，药物可具有与连接子形成键的氨基、羧基、硫醇基、羟基或酮基。当药物与连接子直接连接时，药物在与抗体连接之前具有反应基团。
203.有用的药物包括，例如抗微管蛋白药物、dna小沟区结合剂、dna复制抑制剂、烷化剂、抗生素、叶酸拮抗剂、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物的例子包括，例如dna小沟区结合剂、dna烷化剂和微管蛋白抑制剂；典型的细胞毒性药物包括，例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素(docamycin/duocarmycins)、依托泊苷(etoposides)、美登素(maytansines)和美登素类(例如dm1和dm4)、紫杉烷类、苯二氮卓类或含苯二氮卓类的药物(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(pbd)、吲哚并苯二氮卓类和恶唑烷类苯二氮卓类)，以及花生物碱类。
[0204]
在本发明中，可以使用药物-连接子以简单的步骤形成adc。在其他实施方案中，双功能连接子化合物可用于在两步或多步过程中形成adc，例如，在第一步中，半胱氨酸残基与连接子的反应部分反应，然后在后续步骤中，连接子上的官能团与药物反应，从而形成adc。
[0205]
通常，选择连接子上的官能基团使其能够与药物部分上合适的反应性基团特异性反应。作为非限制性实例，叠氮化物可用于与药物上的反应性炔基专一性反应，药物通过叠氮化物和炔基之间的1,3-偶极环加成反应共价结合到连接子上。其他可用的官能基团包括酮和醛(适合与酰肼和烷氧基胺反应)、膦(适合与叠氮化物反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺和醇反应)；以及活化酯，例如n-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺和醇反应)。以上这些和其他连接策略，例如在bioconjugation technology(第二版(elsevier))中描述的那些，是本领域技术人员众所周知的。本领域的技术人员应当理解的是，当被选择用于药物部分和连接子之间的选择性反应的反应性官能团的互补对，互补对的每个组成都可以作为连接子，也可以作为药物。
[0206]
本发明还提供一种adc的制备方法，该方法可以包括：在能够形成抗体-药物偶联物(adc)的条件下，将抗体与药物-连接子化合物结合。
[0207]
在某些实施方案中，本发明的方法包括：在能够形成抗体-连接子偶联物的条件下，将抗体与双功能连接子化合物结合。在这些实施方案中，本发明的方法进一步包括：在能够通过连接子将药物部分与抗体共价连接的条件下，将抗体-连接子缀合物与药物部分结合。
[0208]
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物(adc)具有如下结构式：
[0209]
ab-(lu-d)
p
[0210]
其中，ab是抗体；
[0211]
lu是连接子；
[0212]
d是药物；
[0213]
下标p为1到8之间的值。
[0214]
药物组合物及其用途
[0215]
本发明的抗体可以结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)，ror1为一膜受体，具有胞内激酶样结构域和胞外卷曲样富半胱氨酸结构域，这对于wnt家族中的受体是常见的。特别地，本发明的抗体以出乎意料的高亲和力特异性结合ror1，并且在某些实施方案中具有治疗ror1相关疾病的效用，例如与异常或改变ror1的表达，特别是ror1过表达(例如可检测到的ror1表达水平大于正常或无疾病细胞中可检测到的表达水平)相关的疾病，此类疾病包括各种形式的癌症，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)，和其他癌症。示例性抗体或其抗原结合片段或其互补决定区(cdr)的氨基酸序列。
[0216]
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。本文所用术语“药物组合物”是指包含本发明的活性成分以及药学上可接受的载体的产品，其中活性成分选自：本发明第一部分的分离单克隆抗体或其抗原结合片段、第二部分的重组蛋白、第三部分的分离核酸(特别是dna或rna)、第四部分的载体、第六部分的抗体偶联物、第七部分的免疫细胞，或其组合。本发明的活性成分和包
含该活性成分的组合物还可用于制造上文提及的治疗应用的药物。
[0217]
本文所用的术语“抗肿瘤作用”可表现为肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加，或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗肿瘤作用”还可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体预防肿瘤首次发生的能力来体现。
[0218]
本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或病症至少一种体征或症状的频率或严重性。
[0219]
在一些实施方案中，将抗体配制成适合施用于哺乳动物，例如人类患者的药物组合物，该组合物通常包含一种或多种本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂。术语“药学上可接受的赋形剂”包括与给药方式相容的合适溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。药物组合物还可以包含提供补充、额外或增强治疗功能的其他活性化合物。药物组合物还可与给药说明一起包含在容器、包装或分配器中。
[0220]
本发明的药物组合物配制成与其预期的给药途径相容，给药方法是本领域已知的，可以是静脉、腹膜、肌肉、腔内、皮下、皮内、局部、吸入、经粘膜、直肠或经皮给药。
[0221]
用于皮内或皮下的溶液或悬浮液通常包括以下一种或多种成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，如edta；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的媒介，如氯化钠或葡萄糖。可以根据需要用酸或碱调节ph。这些制剂可封装在安瓿、一次性注射器、玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。
[0222]
适合用于注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末，举例来说，可以通过无菌过滤膜过滤来完成灭菌。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el(basf,parsippany,n.j.)或磷酸缓冲生理盐水(pbs)。优选地，该药物组合物在制造和储存条件下是稳定的，并且保存免受微生物例如细菌和真菌的污染，可通过加入抗菌剂和/或抗真菌剂来避免微生物污染，实施例包括：对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇和氯化钠。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等的溶剂或分散介质，以及其合适的混合物。举例来说，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散的情况下通过维持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可注射组合物的延迟吸收可通过在组合物中添加延迟吸收试剂来实现，例如单硬脂酸铝或明胶。
[0223]
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体，其可封装在明胶胶囊中或压缩成片剂。对于口服给药，抗体可以与赋形剂组合并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。
[0224]
优选地，本发明的组合物是液体制剂，例如水性制剂或注射剂。
[0225]
水性制剂的ph值可以在3到10之间。在本发明的一实施方案中，制剂的ph值为约7.0至9.5。在本发明的另一实施方案中，制剂的ph值为约3.0至7.0。在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性实例包括：精氨酸、天冬氨酸、二辛酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)和三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)-aminomethane)，及其混合物。缓冲剂可以单独
存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定缓冲剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0226]
在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甲醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、亚氨脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞，及其混合物。防腐剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定防腐剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0227]
在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含等渗剂。等渗剂的非限制性实例包括：盐(例如氯化钠)、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(例如甘油、1,2-丙二醇丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如peg400)，及其混合物。等渗剂的另一实施方案包括糖，糖的非限制性实例可以是单糖、二糖、多糖或水溶性葡聚糖，包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-hpcd、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一实施方案是糖醇，其中术语“糖醇”定义为具有至少一个-oh基团的c(4-8)烃。糖醇的非限制性实例包括：甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、半乳糖醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。等渗剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定等渗剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0228]
在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性实例包括：柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(edta)的盐，及其混合物。螯合剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定螯合剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0229]
在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
[0230]
在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中稳定剂为羧基/羟基纤维素及其衍生物(例如hpc、hpc-sl、hpc-l和hpmc)、环糊精、2-甲基硫代乙醇、聚乙二醇(如peg3350)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(如氯化钠)、含硫物质(如单硫代甘油)或巯基乙酸。稳定剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定稳定剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0231]
在本发明进一步的实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水)部分和脂溶性(亲脂)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可以选自例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定表面活性剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0232]
在本发明的另一实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如
edta和/或苯甲脒盐酸。蛋白酶抑制剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的任一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。
[0233]
在某些实施方案中，根据非限制性理论，本说发明的抗ror1抗体可以单独或与其他试剂组合，与癌症干细胞(csc)接触以抑制肿瘤增殖。
[0234]
在一些实施方案中，除了本发明的抗体之外，药物组合物还含有细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、肿瘤靶向剂、免疫刺激剂，或与细胞毒性、细胞生长抑制剂结合的抗体或其他毒性剂。药物组合物可以任选其他治疗方式一起使用，例如手术、化学疗法和放射治疗。
[0235]
本发明组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的常规药学方法来确定，例如测量ld
50
(对50％的群体致死的剂量)和ed
50
(在50％群体中治疗有效的剂量)，毒性和治疗作用之间的剂量比即治疗指数，其可表示为ld
50
/ed
50
比值，优选表现较大治疗指数的组合物。
[0236]
给药量取决于变量，例如欲治疗的疾病或适应症的类型和程度、患者的整体健康状况、抗体的体内效力、药物制剂、抗体的血清半衰期，以及给药途径。
[0237]
给药频率可以调整，这取决于给药途径、剂量、抗体或融合蛋白的血清半衰期以及所治疗的疾病等因素。
[0238]
本发明的药物组合物可用于治疗患有以ror1表达细胞，尤其是ror1表达细胞过多为特征的恶变前或恶性癌症的哺乳动物，例如人类患者，此类疾病常见于血液恶性肿瘤，例如白血病。
[0239]
白血病可以是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征。
[0240]
根据一优选的实施方案，提供本发明的抗ror1抗体用于治疗慢性淋巴细胞白血病(cll)或急性淋巴细胞白血病(all)。
[0241]
本发明的抗体用于治疗的癌症类型包括但不限于非实体瘤(例如血液系统恶性肿瘤)，成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。
[0242]
实体瘤例如乳房、结肠、肝、肺、肾、胰腺、前列腺、肾和卵巢也可以通过本发明的抗体进行治疗。
[0243]
在一些实施方案中，本发明的抗体用于非治疗目的，例如诊断测试和测定。例如，这些抗体可用于区分表达ror1的癌细胞(“ror1癌症”)和正常细胞。例如，提供通过将样品与本发明的ror1特异性抗体接触并检测抗体与样品中的ror1之间的免疫反应性来确认来自受试者的样品中ror1的免疫测定。
[0244]
检测应用和试剂盒
[0245]
根据本发明的抗体或其adc于检测方面的应用，例如用于样品的检测以提供诊断信息。
[0246]
在本发明中，使用的样本(标本)包括细胞、组织样本和活检样本。本发明中使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有类型活检，因此，本发明中使用的活检样本可以包括：肿瘤的切除样本，以及通过内窥镜方法、器官穿刺或针穿刺活检制备的组织样本。
[0247]
本发明中使用的样本包括固定或保存的细胞或组织样本。
[0248]
本发明还提供了仅包含本发明所述抗体(或其片段)的试剂盒；在本发明一优选实施方案中，试剂盒还包括容器、说明书、缓冲液等。在优选的实施方案中，本发明的抗体可以固定在测试板上。
[0249]
在另一实施方案中，通过检测样品中ror1蛋白的存在或数量来诊断受试者的ror1癌症。
[0250]
本发明提供了一种用于预测或诊断ror1癌症预后的试剂盒，该试剂盒包含抗ror1抗体。本发明的试剂盒还可以包括本领域已知的用于elisa的工具和/或试剂。根据需求，本发明的试剂盒还可包括用于混合各组分的管、孔板、描述如何使用的使用说明书等。
[0251]
本发明的主要优势包括：
[0252]
(a)本发明的抗体具有优良的生物活性和特异性，对细胞表面ror1具有良好的结合亲和力，可作为ror1靶向抗体；
[0253]
(b)本发明的全人源抗体不仅具有与免疫抗体相当的活性，并且免疫原性较低；
[0254]
(c)本发明的抗体和adc均具有显着的抗肿瘤活性，并且对哺乳动物本身无明显毒副作用；
[0255]
(d)本发明的抗体和adc不仅在肿瘤模型中具有显着的治疗效果，并且适用于其他与ror1高表达相关的疾病。
[0256]
以下实施例将进一步阐述本发明。应当理解本实施例仅用于描述本发明，并非限制本发明的范围。实施例的实验方法，若没有点出具体条件，则通常是根据常规条件进行，例如sambrook et al.,molecular cloning:laboratory manual(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)描述的条件，或根据制造商推荐的条件进行。除非另有说明，实施例中提及的百分比和其他数值是指重量百分比和重量。细胞系为市售或购自atcc的常规产品，所有质粒均为市售产品。
[0257]
细胞系：
[0258]
cho-k1细胞系获取自atcc(ccl-61
tm
)，于含有10％fbs的f-12k培养基中培养。
[0259]
实施例1：使用噬菌体展示系统生成抗ror1特异性抗体
[0260]
使用噬菌体展示系统合成抗ror1抗体，这些抗体是通过使用专有增强型人源性噬菌体文库(promab biotechnologies,inc.)生成的，该抗ror1抗体结合的表位横跨ror1蛋白细胞外结构域的全长(图1)。抗ror1抗体克隆c3、g3和g6为三株高亲和力的抗体，其vh和v
l
的氨基酸序列见表1和图6-11。
[0261]
表1抗ror1抗体克隆c3、g3和g6的氨基酸序列。
[0262]
[0263]
[0264]
[0265][0266]
表2抗体vh、v
l
和cdr的序列id
[0267][0268][0269]
实施例2：抗ror1抗体与人ror1和小鼠ror1的结合
[0270]
来自从人源性噬菌体文库筛选的不同克隆的vh和v
l
序列被克隆到pcdna 3.1载体，
生成全长人igg1抗体。elisa板在4℃下用人ror1或小鼠ror1(每孔100ng)包被过夜，然后在室温下用2％bsa-pbs封闭1小时，接着在室温下与纯化的人单克隆抗体(mab)稀释液混合1小时。用pbs-tween 20洗涤后，加入辣根过氧化物酶(hrp)偶联的山羊抗人igg(1:10000稀释，ab97225)，室温孵育1小时，然后洗涤。使用过氧化物酶底物tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，sangon biotech，c520026)检测结合的抗体。试验结果确认这些抗体不仅与人ror1结合，而且还与小鼠ror1发生交叉反应(图2)。
[0271]
实施例3：抗ror1抗体对ror1表达细胞系的结合能力测试
[0272]
cho-k1细胞系用携带人ror1的慢病毒载体进行转导。cho-k1-ror1细胞在facs缓冲液中重悬，其fc受体在与纯化的ror1单克隆抗体孵育之前被封闭。将100μl含有5
×
105个细胞的facs缓冲液等分到单独的管中并加入纯化的单克隆抗体，抗体浓度为约30μg/ml至约0.000508μg/ml。细胞在4度下孵育1小时，然后用过量的facs缓冲液冲洗两次。将细胞重悬于100μl facs缓冲液中，并向样品中加入0.5μg抗人igg-fc(pe)二抗(ab98596)，孵育30分钟后用过量的facs缓冲液冲洗两次。结果显示这些抗体能够与表达人ror1的cho-k1细胞结合(图3)。
[0273]
实施例4：测定抗ror1抗体的kd值
[0274]
使用fortebio的仪器(fortebio octet red96)测定抗ror1抗体的亲和力。将人ror1-ecd在kb缓冲液(0.1％bsa，0.05％tween 20，1
×
pbs，ph 7.4)中稀释至各浓度(从约500nm到约62.5nm)，接着mab也在kb缓冲液中稀释到10μg/ml。将单克隆抗体加到抗higg fc capture(ahc)生物传感器(pall，fortebio)，稀释的人ror1-ecd与单克隆抗体结合，然后在kb缓冲液中解离。使用fortebio date analysis 7.1软件(pall，fortebio)，基于1:1langmuir结合模型计算结合(k-on)和解离(k-off)速率常数。
[0275]
三个克隆对人ror1的亲和力如图4所示。
[0276]
实施例5：抗ror1抗体和ror1之间相互作用的表位作图
[0277]
elisa板用小鼠抗his抗体(genscript，a00186)包被(每孔100ng，4℃过夜)，然后在室温下用2％bsa-pbs封闭1小时。随后，将人ror1的免疫球蛋白(ig)样结构域、卷曲(frizzled)或克林格(kringle)结构域(acro、ro1-h5221、ro1-h5222、ro1-h5223)添加到elisa板上并在室温下孵育1小时。用pbs-tween 20冲洗后，加入人单克隆抗体，并在室温下孵育1小时。用pbs-tween 20冲洗后，将抗体与hrp偶联的山羊抗人igg fc多克隆抗体(ab98596)在室温下孵育1小时。用pbs-tween 20冲洗后，加入辣根过氧化物酶(hrp)偶联的山羊抗人抗体(biolegend,652504)，并在室温下孵育1小时，然后用pbs-tween 20冲洗。使用过氧化物酶底物tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(sangon biotech，c520026)检测结合的抗体。结果显示，c3和g3与ror1的克林格结构域结合，g6与ror1的ig样结构域结合(图5)。
[0278]
实施例6：抗ror1的抗癌作用
[0279]
nod.cg-prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nsg)小鼠通过尾静脉接种3
×
106jeko-1-luc细胞，接种三天后，静脉注射10mg/kg抗ror1抗体(克隆c3)或同型抗体(对照)，每3天注射一次抗体。将小鼠放置在photonimager optima系统(biospace实验室)的成像室中测量肿瘤负荷，采集生物发光以获取动物的色阶照片。在动物图像上绘制感兴趣的区域以及没有信号的区域上用作背景读数，使用光子/秒(rlu)量化光强度，并用m3 vision软件(biospace实验室)叠加所有研究取得的色阶照片和数据图像。结果显示，与同型对照组相比，抗ror1抗
体(克隆c3)显着抑制了jeko-1的生长(图12)。
[0280]
本发明提及的所有文献皆以同等内容引用至本技术文件作为参考。此外还应理解，本领域技术人员在阅读本发明的内容之后，可以对本发明进行各种修改或调整，这些等同方式也会一并落于本技术权利要求书所限定的范围内。