抗炎舒缓的苦参提取物及苦参碱类化合物的制备及应用的制作方法

1.本发明涉及苦参提取物以及苦参碱类化合物的制备方法以及苦参提取物、苦参碱类化合物的组合物、苦参碱类化合物 苦参提取物的组合物在抗炎、舒缓、止痒类化妆品或药品中的应用。


背景技术：

2.老年人中常见的皮肤病是皮肤瘙痒症，在治疗老年皮肤瘙痒时，抗组胺药是较为常用的药物之一。研究表明，皮肤瘙痒症患者炎性因子的异常表达，与th1/th2细胞的平衡密切相关，因此，炎性因子的异常表达是皮肤瘙痒症的重要病因，而通过采取抗炎治疗来应对皮肤瘙痒会起到优异的治疗效果。
3.中医药治疗皮肤病历史悠久，中医药不仅可控制反复发作的皮肤病或延长其复发时间，同时也可以减轻或避免化学药的副作用。
4.苦参为豆科植物苦参的干燥根，具有清热、抗菌等功效，苦参提取物和苦参碱常用作杀菌剂等农药。
5.例如，中国专利201310476873.5公开了一种高效、低毒、低残留、由丁子香酚和苦参碱组成的复配杀菌剂，尤其用于防治葡萄霜霉病。其中，植物源化合物丁子香酚与苦参碱有效成分以1:40～40:1进行二元复配的复配剂，抑制葡萄霜霉病菌活性高，并且相对用量少，对作物的安全性好。
6.中国专利201310632926.8公开了一种含苦参碱和鱼藤酮的农药组合物及其应用，该专利含苦参碱和鱼藤酮的农药组合物，其活性组分由0.3～1.5重量份的苦参碱和1～5重量份的鱼藤酮组成，其对蓟马和其他缨翅目昆虫虫害防治效果优异，且植物很难对其产生抗性，成分简单、成本低廉、防治效果好。
7.中国专利201110215809.2公开了一种含有氧化苦参碱和新烟碱类物质的杀虫组合物，该新烟碱类物质为吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺或噻虫胺，其可产生较高的协同增效，减少和延缓有害生物产生抗药性，可用于防治水稻、蔬菜和果树等的多种同翅目、缨翅目等害虫。
8.近年来，人们也在研究和关注苦参碱在其它方面的应用。
9.例如，中国专利201910433332.1公开了一种抗炎舒敏修复组合物及其制备方法和应用，该组合物由仙人掌提取物、燕麦麸皮提取物、苦参提取物、麦冬根提取物、芍药根提取物、黄芩根提取物、丁二醇、戊二醇和水组成。
10.中国专利申请202111508063.4公开了一种抗炎舒敏修护组合物，其包括以下活性成分：仙人掌提取物；燕麦麸皮提取物；苦参提取物；麦冬根提取物；芍药根提取物；黄芩根提取物；鸭皂树提取物。
11.中国专利申请202210107975.9公开了一种抗敏止痒修复植物提取物，是由苦参、蛇床子、甘草、洋甘菊、积雪草、黄连、黄柏、花椒、盐肤木、樟树经粉碎、提取、多级膜分离纯化而得，其主要活性成分为：苦参碱、氧化苦参碱、积雪草苷、甘草酸、α-红没药醇、蛇床子
素、小檗碱、没食子酸和右旋龙脑。该申请强调活性成分间的合理复配、协同增效。
12.上述现有技术中的抗炎舒敏组合物是由多种植物提取物组成的，所含的活性成分也较多。然而，成分越多，所带来的副作用也难以预计。准确确定各活性成分特有的生物活性和药理作用，是准确确定化妆品或药品中合理成分的关键。
13.因此，有必要对苦参碱类物质进行有区别的分离、富集，以开发具有缓解、治疗皮肤瘙痒的化妆品、药品等，以及研究具有生物活性的苦参提取物的协同作用，将具有重要的应用价值。


技术实现要素：

14.本发明的发明目的之一是提供一种苦参提取物及其制备方法；本发明的另一发明目的是提供分离、富集苦参碱类化合物的方法以及这些苦参碱类化合物的组合物；本发明的再一发明目的是提供苦参提取物、苦参碱类化合物的组合物、苦参碱类化合物 苦参提取物的组合物在制备消炎、舒缓类化妆品或药品中的应用。
15.一方面，为了实现上述的发明目的，本发明提供了一种苦参提取物，该提取物是采用如下过程制备的：
16.(1)将新鲜苦参茎粉碎；
17.(2)粉碎后的苦参茎用乙醇-水进行渗漉提取；
18.(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；
19.(4)用水溶解步骤(3)所得的浸膏，得到混悬液，用hcl调节ph至弱酸性；
20.(5)步骤(4)所得的混悬液中加入氯仿使分层；
21.(6)将步骤(5)所得的水层用nh3·
h2o调ph至弱碱性，再用氯仿萃取，得到浸膏，制得所述的苦参提取物。
22.在上述的制备过程中，步骤(1)所使用的苦参茎可以是新鲜的或半干，优选为新鲜的苦参茎。
23.优选地，在上述的制备过程中，步骤(2)中所采用的乙醇-水为65％-85％的乙醇，优选为70％-80％的乙醇，例如75％的乙醇；步骤(4)中所述的弱酸性为ph＝4-6.8，优选ph＝5-6.5，例如ph＝6；步骤(6)中所述的弱碱性为ph＝8-11.5，优选ph＝8.5-10，例如ph＝9。
24.此处，所说的乙醇浓度为体积浓度，例如75％的乙醇是指乙醇与水的体积比为75:25。
25.另一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种苦参碱类化合物的制备方法，该方法包括：
26.a、按上述的方法制备苦参提取物；
27.b、将所得的苦参提取物经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，获得若干个馏分；
28.c、构建2,4-二硝基氯苯暴露人永生化角质形成细胞(hacat)氧化、炎性损伤模型，评价步骤b中所得的各馏分的抗炎、抗氧化活性；
29.d、取步骤c中活性最佳的馏分经大孔树脂分离，进一步用乙醇-水进行梯度洗脱，进一步得到不同部位的若干个馏分；
30.e、基于前述构建的2,4-二硝基氯苯暴露人永生化角质形成细胞(hacat)氧化、炎
性损伤模型，评价步骤d中所得的各馏分的抗炎、抗氧化活性；
31.f、取步骤e中活性最佳部位的馏分，经反复硅胶色谱柱、氯仿-甲醇梯度洗脱，再经ods柱色谱及hplc分离纯化，得到如式1、式2、式3、式4以及式5所示的苦参碱类化合物：
[0032][0033]
在上述的制备过程中，步骤b中苦参提取物经硅胶柱色谱分离，所选用的硅胶为80-100目或200-300目或300-400目，优选为200-300目或300-400目，更优选为300-400目。
[0034]
在上述的制备过程中，步骤b中用氯仿-甲醇(100∶1
→
1∶100)梯度洗脱，步骤d中用氯仿-甲醇(50∶50)梯度洗脱组分经d101大孔树脂分离，进一步用乙醇-水(100∶1
→
1∶100)进行梯度洗脱。
[0035]
在上述的制备过程中，步骤f中将具有最佳保护活性的组分(苦参提取物经硅胶(300-400目)柱色谱分离、氯仿-甲醇(50∶50)梯度洗脱组分经d101大孔树脂乙醇-水(30∶70)洗脱组分)经反复硅胶色谱柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，再经ods柱色谱及hplc分离纯化，得到式1、式2、式3、式4、和式5所示的苦参碱化合物，分别命名为苦参碱-1、苦参碱-2、苦参碱-3、苦参碱-4、苦参碱-5。
[0036]
在本发明中，苦参碱可以从新鲜苦参(茎)中基于活性追踪方法分离提取得到，为苦参碱的制备提供了一个新的途径。
[0037]
再一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种抗炎、抗氧化的苦参碱类化合物的组合物，该组合物包括上述方法制备的如式1、式2、式3、式4以及式5所示的化合物；其中，在该组合物中，式1、式2、式3、式4、式5所示化合物的质量比的较佳范围为1:1-100:1-100:1-100:1-100。
[0038]
优选地，在上述的抗炎、抗氧化的组合物中，式1、式2、式3、式4、式5所示化合物的质量比为1:1-50:1-50:1-50:1-50。
[0039]
另外，本技术的发明人令人惊异地发现，若在上述苦参碱类组合物中加入上述的苦参提取物，则所得的混合物具有更加出色的抗炎、抗氧化活性。
[0040]
因此，更优选地，在本发明的抗炎、抗氧化的组合物中，进一步含有上述提取过程制备的苦参提取物，该组合物中，式1、式2、式3、式4、式5所示的化合物与提取的苦参提取物的质量比为1:1-100:1-100:1-100:1-100:1-10000，优选为1:1-50:1-50:1-50:1-50:1-5000，更优选为1:1-3:1-3:1-3:1-3:80-120。
[0041]
又一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了上述苦参提取物、苦参碱类化合物的组合物、或苦参碱类化合物 苦参提取物的组合物在制备消炎、舒缓类化妆品或药品中的应用。
[0042]
在本发明上述的应用中，该应用是通过抑制hacat细胞炎性细胞因子分泌、或者通过抑制hacat细胞炎性细胞因子基因的转录而实现的。
[0043]
或者，在本发明上述的应用中，该应用是通过抑制hacat细胞nf-κb信号通路的激活、或者通过缓解hacat细胞抗氧化通路相关蛋白表达的抑制而实现的。
[0044]
在本发明上述的应用中，所采用的消炎、舒缓类化妆品或药品可以为外用制剂，其形式可以为喷剂、慕斯、乳剂、或液体制剂。
[0045]
在本发明上述的应用中，所涉及的炎症可以是指皮炎、湿疹等皮肤病的炎症。
[0046]
令人惊异的是，无论是在抑制hacat细胞炎性细胞因子分泌试验中，还是在抑制hacat细胞炎性细胞因子的基因转录的试验中，或者是在抑制hacat细胞nf-κb信号通路激活的试验中，抑或是在缓解hacat细胞抗氧化通路相关蛋白表达抑制的试验中，均发现了苦参碱类化合物与苦参提取物之间具有显著的协同作用。
[0047]
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及有益效果：本发明通过活性追踪法制得了苦参碱类的化合物，并确定了化合物的结构；本发明通过构建的2,4-二硝基氯苯暴露人永生化角质形成细胞(hacat)氧化、炎性损伤模型，发现苦参提取物、苦参碱类化合物的组合物、以及苦参碱类化合物与苦参提取物的组合物，能够抑制hacat细胞相关炎性因子分泌，抑制相关炎症信号通路激活及抑制相关炎症信号通路蛋白表达；而且本发明发现，苦参碱类化合物与苦参提取物之间具有显著的协同作用。
[0048]
下面将结合具体实施方式和附图对本发明技术方案进行清楚、完整描述。本领域技术人员可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅是本发明一部分的实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的精神，本领域的普通技术人员可以在不作出创造性劳动的前提下进行相应的替换、变换、改变或改进，但这些替换、变换、改变或改进，仍属于本发明的保护范围。
附图说明
[0049]
图1是苦参碱-1的esi-ms谱图；
[0050]
图2是苦参碱-1的1hnmr谱图；
[0051]
图3是苦参碱-1的
13
cnmr谱图；
[0052]
图4是苦参碱-1的dept谱图；
[0053]
图5是苦参碱-2的esi-ms谱图；
[0054]
图6是苦参碱-2的1hnmr谱图；
[0055]
图7是苦参碱-2的
13
cnmr谱图；
[0056]
图8是苦参碱-2的dept谱图；
[0057]
图9是苦参碱-3的esi-ms谱图；
[0058]
图10是苦参碱-3的1hnmr谱图；
[0059]
图11是苦参碱-3的
13
cnmr谱图；
[0060]
图12是苦参碱-3的dept谱图；
[0061]
图13是苦参碱-4的hr-esi-ms谱图；
[0062]
图14是苦参碱-4的1hnmr谱图；
[0063]
图15是苦参碱-4的
13
cnmr谱图；
[0064]
图16是苦参碱-4的dept谱图；
[0065]
图17是苦参碱-5的esi-ms谱图；
[0066]
图18是苦参碱-5的1hnmr谱图；
[0067]
图19是苦参碱-5的
13
cnmr谱图；
[0068]
图20是苦参碱-5的dept谱图；
[0069]
图21显示了苦参碱组(ksa)、苦参提取物组(kse)、苦参碱 苦参提取物组(kae)，对经2,4-二硝基氯苯处理的hacat细胞的细胞活力的提升，其中，空白组标记为con，2,4-二硝基氯苯组标记为dcnb；
[0070]
图22显示了苦参碱组(ksa)、苦参提取物组(kse)、苦参碱 苦参提取物组(kae)，对经2,4-二硝基氯苯处理的hacat细胞的炎性细胞因子分泌的抑制，其中，空白组标记为con，2,4-二硝基氯苯组标记为dcnb；
[0071]
图23显示了苦参碱组(ksa)、苦参提取物组(kse)、苦参碱 苦参提取物组(kae)，对经2,4-二硝基氯苯处理的hacat细胞的炎性细胞因子基因转录的抑制，其中，空白组标记为con，2,4-二硝基氯苯组标记为dcnb；
[0072]
图24显示了苦参碱组(ksa)、苦参提取物组(kse)、苦参碱 苦参提取物组(kae)，对经2,4-二硝基氯苯处理的hacat细胞的nf-κb信号通路的激活，其中，空白组标记为con，2,4-二硝基氯苯组标记为dcnb；
[0073]
图25显示了苦参碱组(ksa)、苦参提取物组(kse)、苦参碱 苦参提取物组(kae)，对经2,4-二硝基氯苯处理的hacat细胞的抗氧化通路相关蛋白表达的抑制，其中，空白组标记为con，2,4-二硝基氯苯组标记为dcnb。
具体实施方式
[0074]
本发明具体实施方式中所采用的主要试验仪器和主要材料来源为：化合物的核磁检测用bruker av-500或bruker av-400mhz核磁共振仪测定核磁(nmr)，并以tms为内标(德国bruker公司)；用agilent 6210 lc/msd tof型质谱仪测定高分辨质谱；用thermo finnigan lcq advantage max质谱仪(美国thermo公司)测定质谱(esi-ms)；hplc采用dionex型高效液相色谱仪(美国dionex公司)；phplc采用varian制备型高效液相色谱仪(美国varian公司)和agilent 1100lc/msd型高校色谱仪(美国agilent公司)；cosmosil c-1(8250mm
×
4.6mm,5μm)色谱柱。sephadex lh-20层析填料购于pharmacia公司；ods柱色谱材料购于德国merck公司；柱色谱用硅胶购于青岛海洋化工厂；核磁用氘代试剂购自美国cil公司；所用试剂均为分析纯和色谱纯。
[0075]
实施例1：苦参提取物的制备
[0076]
①
新鲜苦参茎20kg，粉碎，用75％乙醇的渗漏提取，合并减压浓缩提取液，得浸膏1014g。用水溶解浸膏得混悬液，用hcl调ph到6，并加入氯仿使分层。水层用nh3·
h2o调ph到8，再用氯仿萃取得316g浸膏，标记为苦参提取物-1。
[0077]
②
新鲜苦参茎20kg，粉碎，用75％乙醇的渗漏提取，合并减压浓缩提取液，得浸膏1002g。用水溶解浸膏得混悬液，用hcl调ph到6，并加入氯仿使分层。水层用nh3·
h2o调ph到9，再用氯仿萃取得227g浸膏，标记为苦参提取物-2。
[0078]
③
新鲜苦参茎20kg，粉碎，用75％乙醇的渗漏提取，合并减压浓缩提取液，得浸膏1005g。用水溶解浸膏得混悬液，用hcl调ph到6，并加入氯仿使分层。水层用nh3·
h2o调ph到10，再用氯仿萃取得203g浸膏，标记为苦参提取物-3。
[0079]
④
新鲜苦参茎20kg，粉碎，用75％乙醇的渗漏提取，合并减压浓缩提取液，得浸膏1014g。用水溶解浸膏得混悬液，用hcl调ph到6，并加入氯仿使分层。水层用2％nh3·
h2o调ph到11，再用氯仿萃取得221g浸膏，标记为苦参提取物-4。
[0080]
构建2,4-二硝基氯苯暴露人永生化角质形成细胞(hacat)氧化、炎性损伤模型，评价苦参提取物-1，苦参提取物-2，苦参提取物-3，苦参提取物-4抗炎、抗氧化活性。
[0081]
实验结果显示，苦参提取物-2具有最佳抗炎、抗氧化活性，能够显著提高hacat细胞活力，故本发明中所述苦参提取物主要是指苦参提取物-2。
[0082]
实施例2：苦参碱类化合物的制备及结构鉴定
[0083]
苦参提取物-2(100g)经硅胶(300-400目)柱色谱分离，用氯仿-甲醇(100∶1
→
1∶100)梯度洗脱获得5个馏分(fr.1-5)。基于前期构建的2,4-二硝基氯苯暴露人永生化角质形成细胞(hacat)氧化、炎性损伤模型，评价fr.1-5抗炎、抗氧化活性。
[0084]
活性最佳组分fr.2经d101大孔树脂分离，用乙醇-水(100∶1
→
1∶100)梯度洗脱，得到10％部位、30％部位、50％部位、70％部位、95％部位5个馏分。基于前期构建的2,4-二硝基氯苯暴露人永生化角质形成细胞(hacat)氧化、炎性损伤模型，评价此5个馏分抗炎、抗氧化活性。
[0085]
活性最佳组分30％部位经反复硅胶色谱柱，氯仿-甲醇(100∶0
→
0∶100)梯度洗脱，再经ods柱色谱及hplc分离纯化，得到苦参碱-1(624.5mg)，苦参碱-2(447.3mg)，苦参碱-3(589.2mg)，苦参碱-4(712.3mg)，苦参碱-5(480.1mg)。
[0086]
苦参碱-1(式1)的结构鉴定：
[0087]
请结合参阅附图1-4。苦参碱-1为白色粉末，碘化铋钾显色呈阳性，正离子esi-ms显示m/z 265[m h]

，提示该该化合物分子量为264，且给出了苦参碱的特征裂解碎片m/z 247([m-oh]

),205,177。结合1h nmr和
13
c nmr数据推断化合物的分子式为c
15h24
n2o2，不饱和度为ω＝5。
[0088]
13
c nmr(100mhz,cd3od)谱和dept 135谱总共显示有15个碳，包括10个亚甲基、4个次甲基和1个季碳。其中包括1个酰羰基信号(δ
c 172.8)，2个与杂原子相连的次甲基碳信号(δ
c 67.9,55.0)和3个与杂原子相连的亚甲基碳信号(δ
c 70.0,69.5,43.4)。1h nmr(400mhz,cd3od)谱在显示23个质子信号，包括苦参生物碱的c-17、c-11的特征氢信号[δ
h 4.92(1h,m),4.26(1h,dd,j＝12.0,4.4hz),4.03(1h,t,j＝8.4hz)]，最终鉴定化合物为式1所示化合物。
[0089]1h nmr和
13
c nmr数据汇总如下：1h nmr(400mhz,cd3od)δ:4.92(1h,m,h-11),4.26(1h,dd,j＝12.0,4.4hz,h-17),4.03(1h,t,j＝8.4hz,h-17),3.03-3.20(5h,m,h-10,2,6),2.00-2.55(5h,m,h-14,12,8,9),1.55-1.83(10h,m),1.30(1h,m)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ:172.8(c-15),70.0(c-10),69.5(c-2),67.9(c-6),55.0(c-11),43.6(c-7),43.3(c-17),35.8(c-5),33.7(c-14),29.4(c-12),26.6(c-4),25.2(c-8),19.3(c-13),18.4(c-3),18.2(c-9)。
[0090]
苦参碱-2(式2)的结构鉴定：
[0091]
请结合参阅附图5-8。苦参碱-2为黄色油状物，碘化铋钾显色呈阳性，
正离子esi-ms显示m/z 249[m h]

，提示该该化合物分子量为248。结合1h nmr和
13
c nmr数据推断化合物的分子式为c
15h24
n2o，不饱和度为ω＝5。
[0092]
13
c nmr(100mhz,cd3od)谱和dept 135谱总共显示有15个碳，包括10个亚甲基、4个次甲基和1个季碳。其中包括1个酰羰基信号(δ
c 172.6)，2个与杂原子相连的次甲基碳信号(δ
c 63.2,61.4)和3个与杂原子相连的亚甲基碳信号(δ
c 54.8,47.9,45.8)。1h nmr(400mhz,cd3od)谱在显示24个氢信号，包括苦参碱c-17位的特征氢信号[δ
h 4.65(1h,m),2.87(1h,m)]，最终鉴定化合物为式2所示化合物。
[0093]1h nmr和
13
c nmr数据汇总如下：1h nmr(400mhz,cd3od)δ:4.65(1h,m,h-17),2.92-3.11(4h,m),2.87(1h,m,h-17),2.31-2.70(2h,m),1.80-2.15(8h,m),1.62-1.73(3h,m),1.40-1.52(3h,m),1.15(1h,m)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ:172.6(c-15),63.2(c-6),54.8(c-10),47.9(c-17),45.8(c-2),37.3(c-5),34.7(c-7),33.6(c-14),28.6(c-12),27.4(c-8),26.4(c-3),23.7(c-4),20.2(c-9),19.8(c-13)。
[0094]
苦参碱-3(式3)的结构鉴定：
[0095]
请结合参阅附图9-12。苦参碱-3为黄色油状物，碘化铋钾显色呈阳性，正离子esi-ms显示m/z 249[m h]

，提示该该化合物分子量为248。结合1h nmr和
13
c nmr数据推断化合物的分子式为c
15h24
n2o，不饱和度为ω＝5。
[0096]
13
c nmr(100mhz,cd3od)谱和dept 135谱总共显示有15个碳，包括10个亚甲基、4个次甲基和1个季碳。其中包括1个酰羰基信号(δ
c 172.7)，2个与杂原子相连的次甲基碳信号(δ
c 63.5,57.7)和3个与杂原子相连的亚甲基碳信号(δ
c 56.6,40.6,48.8)。其中δ
c 172.7显示该化合物有1个酰羰基信号，且其4个次甲基信号(δ
c 63.6,57.7,41.7,30.6)。
[0097]1h nmr(400mhz,cd3od)谱在显示分子包括24个质子，最终鉴定化合物为式3所示化合物。
[0098]1h nmr和
13
c nmr数据汇总如下：1h nmr(400mhz,cd3od)δ:3.35-3.42(2h,m,h-6,10),2.86-3.00(2h,m,h-15,17),2.30-2.41(4h,m,h-11,15,17,10),2.23(1h,m,h-14),2.03(2h,m,h-5,9),1.75-1.95(5h，m,h-4,7,8,13),1.40-1.76(7h，m,h-3,4,14,5,12),1.10(1h,m,h-8)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ:172.2(c-2),63.5(c-1),57.7(c-6),56.6(c-15),50.6(c-17),48.8(c-10),41.7(c-7),33.1(c-3),31.4(c-8),30.6(c-9),28.7(c-12),23.4(c-14),23.0(c-5),22.8(c-13),19.6(c-4)。
[0099]
苦参碱-4(式4)的结构鉴定：
[0100]
请结合附图13-16。苦参碱-4为白色粉末，碘化铋钾显色呈阳性，hr-esi-ms显示准分子离子峰m/z 249.1970(calcd for c
15h25
n2o,249.1961)，提示该该化合物分子量为248。结合1h nmr和
13
c nmr数据推断化合物分子式为c
15h24
n2o，不饱和度为ω＝5。
[0101]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)谱和dept 135谱总共显示有15个碳，包括10个亚甲基、4个次甲基和1个季碳。其中包括1个酰羰基信号(δ
c 169.5)，2个与杂原子相连的次甲基碳信号
(δ
c 63.8,53.2)和3个与杂原子相连的亚甲基碳信号(δc57.3,57.2,43.3)。
[0102]1h nmr(400mhz,cdcl3)谱显示c-11、c-17位的特征氢信号[δ
h 4.27(1h,dd,j＝12.8,4.4hz),3.72(1h,dt,j＝9.6,6.0hz),2.92(1h,t,j＝12.8hz)]，最终鉴定化合物为式4所示化合物。
[0103]1h nmr和
13
c nmr数据汇总如下：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:4.27(1h,dd,j＝12.8,4.4hz,h-17),3.72(1h,dt,j＝9.6,6.0hz,h-11),2.92(1h,t,j＝12.8hz,h-17),2.67-2.98(2h,m,h-2,10),2.30(1h,m,h-14),2.12(1h,m,h-14),1.96(2h,m),1.60-1.971(3h,m),1.20-1.55(12h,m)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:169.5(c-2),63.8(c-6),57.3(c-10),57.2(c-2),53.2(c-11),43.3(c-7),41.5(c-17),35.4(c-5),32.9(c-14),27.8(c-12),27.2(c-4),26.5(c-8),21.2(c-9),20.8(c-3),19.0(c-13)。
[0104]
苦参碱-5(式5)的结构鉴定：
[0105]
请结合附图17-20。苦参碱-5为白色粉末，碘化铋钾显色呈阳性，正离子esi-ms显示m/z 245[m h]

，提示该化合物分子量为244。结合1h nmr和
13
c nmr数据推断化合物的分子式为c
15h20
n2o，不饱和度为ω＝5。
[0106]
13
c nmr(75mhz,cd3od)谱和dept 135谱总共显示有15个碳，包括7个亚甲基、6个次甲基以及2个季碳。其中包括1个酰羰基信号(δ
c 122.2)，4个芳香碳信号(δ
c 150.3,141.3,116.6,106.6)，1个与杂原子相连的次甲基碳信号(δ
c 61.6)和3个与杂原子相连的亚甲基碳信号(δ
c 57.9,57.7,45.4)。
[0107]1h nmr(300mhz,cd3od)谱在显示出20个氢质子信号，包括3个烯氢信号[δh7.51(1h,dd,j＝7.5,8.7hz),6.55(1h,dd,j＝7.5hz),6.45(1h,dd,j＝9.0hz)]，最终鉴定化合物为式5所示化合物。
[0108]1h nmr和
13
c nmr数据汇总如下：1h nmr(300mhz,cd3od)δ:7.51(1h,dd,j＝7.5,8.7hz),6.55(1h,dd,j＝7.5hz),6.45(1h,dd,j＝9.0hz),4.10(1h,dd,j＝7.2,15.0hz),3.80(1h,dd,j＝12.3,15.0hz),3.50(1h,s),3.10(1h,s),2.65(1h,d,j＝14.1hz),2.21-2.34(4h,m),2.03-2.11(2h,m),1.74-1.79(3h,m),1.51-1.60(3h,m)；
13
c nmr(75mhz,cd3od)δ:166.2(c-15),150.3(c-11),141.3(c-13),116.6(c-14),106.6(c-12),61.6(c-6),57.9(c-2),57.7(c-10),45.4(c-17),39.7(c-7),33.0(c-5),28.8(c-8),27.9(c-4),22.4(c-9),21.4(c-3)。
[0109]
实验例3：苦参碱、苦参提取物组合物的抗炎、抗氧化活性试验
[0110]
hacat-1细胞接种于96孔板，密度为5
×
104细胞/孔，培养12h。加入2,4-二硝基氯苯(5μm)处理细胞12h，然后，收集细胞，冷pbs清洗2遍，加入新的培养基并加入终浓度为10μg/ml的苦参碱、苦参提取物或苦参碱、苦参提取物组合物。室温条件下共培育24h后，分离细胞及上清液备用。本实验部分，苦参碱组标记为ksa(苦参碱-1:苦参碱-2:苦参碱-3:苦参碱-4:苦参碱-5质量比为1:1:1:1:1)，苦参提取物组标记为kse，空白组标记为con，2,4-二硝基氯苯组标记为dcnb，苦参碱、苦参提取物组合物组标记为kae。
[0111]
图21所示的实验结果表明，2,4-二硝基氯苯暴露使细胞活力显著降低，而苦参碱、苦参提取物及苦参碱 苦参提取物的组合物处理后，细胞活力显著提高。同时，分析实验结果发现，苦参碱 苦参提取物的组合物提高细胞活力能力，高于苦参碱或苦参提取物。
[0112]
图22所示的实验结果表明，2,4-二硝基氯苯暴露使细胞炎性细胞因子分泌显著增加，说明细胞活力降低可能是因为2,4-二硝基氯苯暴露诱导的炎性损伤造成的，而苦参碱、苦参提取物及苦参碱 苦参提取物的组合物处理后，细胞炎性细胞因子分泌被抑制。进一步的分析实验结果发现，苦参碱 苦参提取物的组合物对2,4-二硝基氯苯暴露诱导的细胞炎性细胞因子分泌抑制能力，高于苦参碱或苦参提取物单独使用的情况。
[0113]
图23所示的实验结果显示，2,4-二硝基氯苯暴露使细胞炎性因子相关基因转录显著增加，而苦参碱、苦参提取物及苦参碱 苦参提取物的组合物处理后，相关炎性细胞因子基因转录被抑制。进一步的分析实验结果发现，苦参碱 苦参提取物的组合物对2,4-二硝基氯苯暴露诱导的细胞炎性细胞因子相关基因转录的抑制能力，高于苦参碱或苦参提取物单独使用的情况。
[0114]
图24所示的实验结果显示，2,4-二硝基氯苯暴露使nf-κb信号通路激活，而苦参碱、苦参提取物及苦参碱 苦参提取物的组合物处理后，nf-κb信号通路相关蛋白表达被抑制。进一步的分析实验结果发现，苦参碱 苦参提取物的组合物对2,4-二硝基氯苯暴露诱导的nf-κb信号通路激活抑制能力，高于苦参碱或苦参提取物单独使用的情况。
[0115]
图25所示的实验结果显示，2,4-二硝基氯苯暴露使细胞相关抗氧化信号通路相关蛋白表达抑制，而苦参碱、苦参提取物及苦参碱 苦参提取物的组合物处理后，2,4-二硝基氯苯暴露诱发的细胞抗氧化信号通路相关蛋白表达抑制被缓解。进一步的分析实验结果发现，苦参碱 苦参提取物的组合物缓解2,4-二硝基氯苯暴露诱导的细胞抗氧化信号通路相关蛋白表达抑制能力，高于苦参碱或苦参提取物单独使用的情况。