一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌的方法

一种利用crispr/cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌的方法
技术领域
1.本发明属于生物与化学领域，涉及一种利用crispr/cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌alternaria alternata(a.alternata，alt)的方法。


背景技术：

2.规律成簇的间隔短回文重复序列(crispr,clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)是许多细菌和古细菌中的一种应对入侵的免疫机制。crispr及crispr相关蛋白(crispr associated proteins,cas)被称为crispr/cas系统。cas12a为第2类v型cas蛋白，它在未激活时无切割活性，当其与特定的crrna结合后，cas12a构象将发生改变，与crrna结合形成cas12a-crrna二元复合物。该复合物能特异性得识别靶标dna，并激活其核酸内切酶活性。当cas12a依次对dna双链进行顺式切割后，该活性位点将持续暴露，展现出反式切割活性，对周围的ssdna进行非特异性切割。针对cas12a的特性，科学家们设计了多种高灵敏度、高特异性的核酸检测平台。
3.杭白菊(chrysanthemum morifolium ramat)为菊科菊属，是我国传统的药用栽培植物和浙江省八大药材“浙八味”之一。目前浙江杭白菊常年种植面积7万亩，年均总产值超过1亿元，约占全国菊花总销量的50％。现代药理研究表明其具有消炎、抗氧化、抗癌，舒血管、降血脂、改善肠道微环境等多种功效。而黑斑病是田间作物的主要病害，侵染发生在潮湿季节，出现圆形或不规则形黑色叶斑，其危害主要发生在叶片上。有时发生在叶柄、茎和花部。在农作物田间染病率为40％左右，严重时可达70％以上。黑斑病的产生严重影响了农产品的经济效益。然而，传统的分离鉴定法检验周期较长，操作步骤繁复，耗时费力，难以满足田间的便捷检测的需求，因此，克服传统分离鉴定方法的局限，引入前沿技术，开发出准确、快速、便捷、灵敏、特异的黑斑病菌alternaria alternata检测技术具有重大意义。
4.现阶段杭白菊黑斑病菌alt的检测技术主要依赖形态学与分子生物学或免疫学检测相结合的方法。形态学鉴定需要在患病植株上经过平板培养法获得病原菌，随后通过显微镜对病原菌进行形态学鉴定，大概周期为7-10天。分子生物学依靠16s rna进行鉴定，来对目的基因进行扩增，再进行测序后通过序列比对确定黑斑病菌a.alternata，由于需要pcr扩增和测序，所需时间为3-5天。同时这两种检测方法对仪器和检测人员的技术要求较高，难以实现现场即时检测；免疫学依靠如免疫标记与菌丝尖端和与新生菌丝相关的无定形物质相结合，通过检测信号达到对该病原菌检测的目的，此类检测方法检测虽然特异性好，但灵敏度较低，耗时较长，成本较高，因此并不适用于基层大批量检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服传统杭白菊黑斑病菌a.alternata检测的技术缺陷，以特异性基因片段为检测目标，提供一种简单、快速、灵敏、特异、便携的检测方法。
6.为此，本发明采用的技术方案如下：
7.利用crispr/cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌alternaria alternata的方法，包括如下步骤：
8.步骤一：借助核酸扩增技术对杭白菊黑斑病菌a.alternata基因组中的特异性目的基因片段进行扩增；
9.步骤二：将扩增的pcr产物加入含crispr/cas体系的反应管中，孵育，所述的crispr/cas体系包括针对目的基因的特异性crrna、crispr/cas12a蛋白和用于酶标仪荧光检测的reporter序列；在crrna的介导下，crispr/cas12a蛋白特异性识别特异性基因片段的扩增片段，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有fam和bhq1的reporter序列，形成fam-ssdna与bhq1-ssdna；
10.步骤三：fam-ssdna与bhq1-ssdna在蓝光投射仪下显现出荧光，实现对于杭白菊黑斑病菌alternaria alternata的可视化检测。
11.作为本发明的优选方案，步骤一中所用的核酸扩增技术为pcr，pcr扩增所用引物序列包括：
12.alt-pcr-f，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
13.alt-pcr-r，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.作为本发明的优选方案，步骤二中，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
15.作为本发明的优选方案，步骤二中所用的针对目的基因的特异性crrna的序列如：seq id no.3所示。
16.作为本发明的优选方案，所述reporter序列为用于酶标仪荧光检测的ssdna fq reporter，其序列如下：5
’‑
fam-nnnnn-bhq1-3’，nnnnn指任意碱基序列。
17.作为本发明的优选方案，步骤二中，cas12a浓度为100nm，cas12a与crrna的浓度比为1:1-1:5，reporter序列的浓度为250-2000nm。
18.作为本发明的优选方案，步骤一中，pcr程序为：95℃预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共循环30次；后72℃延伸10min。
19.作为本发明的优选方案，步骤二中，crispr/cas12a体系的反应温度为35-40℃，反应时间为10-90min。
20.作为本发明的优选方案，步骤三中，反应管直接于蓝光透射仪的照射下展现出荧光，实现对于杭白菊黑斑病菌的可视化检测。
21.由上述对本发明的描述可知，本发明提出了一种crispr/cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌alt的新方法。与现有的检测方法相比，该方法具有灵敏度高、特异性强、快速高效、操作便捷、用户友好且价格低廉等优点，是一种具有广泛推广价值的杭白菊黑斑病菌alt即时检测新平台。
附图说明
22.图1为本发明的工作原理图。
23.图2为本发明中阳性样品的检出图。
24.图3为不同杭白菊黑斑病菌alt含量的样品对检测的影响情况；
25.图4为采用凝胶电泳分析后，杭白菊黑斑病菌alt含量与荧光强度之间的关系。
26.图5为本发明对样品的检测可行性实验的结果图。
27.图6为本发明对杭白菊黑斑病菌alt的检测特异性实验的结果图。
具体实施方式
28.以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述：
29.一、crispr/cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌alt
30.利用热裂解法对实际样本进行预处理，无菌条件下，取样品匀液1ml至灭菌离心管中，8000
×
g离心2min，弃上清；用200μl的灭菌去离子水重悬，8000
×
g离心2min，弃上清；加入100μl的灭菌去离子水，于100℃煮沸10min；将热裂解液8000
×
g离心2min，取上清液作为后续扩增反应的底物，图1为具体操作步骤。利用pcr扩增技术对目标片段扩增，特异性基因片段体系所用引物即seq id no.1(alt-pcr-f)和seq id no.2(alt-pcr-r)。
31.具体的，seq id no.1序列：
[0032]5’‑
gtcttttgcgtacttcttgttt-3’；
[0033]
seq id no.2序列：
[0034]5’‑
gaacaggcatgccctttgga-3’。
[0035]
构建crispr/cas12a反应体系，加入250nm cas12a、100nm crrna(seq id no.3：5
’‑
uaauuucuacuaaguguagauguauuccaaagggcaugccuguuc-3’；)、1000nm fam-reporter-bhq1(5
’‑
fam-nnnnn-bhq1-3’；nnnnn代表任意碱基序列)、2μl扩增产物、2μl buffer c(50mm nacl，10mm tris-hcl，10mm mgcl2，1mm dtt，ph 7.9)并用rnase-free水补足20μl。于37℃孵育20min，立即将反应液放至蓝光照射仪下进行检测结果的分析，图2为本发明中阳性样品的检出图。
[0036]
二、本发明方法检测杭白菊黑斑病菌alt的灵敏度表征
[0037]
为考察本发明对杭白菊样品中杭白菊黑斑病菌alt的检测灵敏度，将具有不同含量40ng/μl、4ng/μl、400pg/μl、40pg/μl、4pg/μl、400fg/μl、40fg/μl、4fg/μl、400ag/μl杭白菊黑斑病菌alt含量的样品经本发明的特异性基因片段体系所用引物(即seq id no.1、seq id no.2)pcr扩增后，利用本发明的crispr/cas12a体系可视化检测方法对特异性基因片段体系进行分析。图3展示了不同杭白菊黑斑病菌alt含量的样品对检测荧光强度的影响情况，经裸眼观测可直接识别低至的400fg/μl杭白菊黑斑病菌alt。图4展现了对应的扩增子跑胶分析可知，本发明的方法的检出限为400fg/μl。
[0038]
三、本发明方法检测杭白菊样品中的杭白菊黑斑病菌alt
[0039]
利用该crispr/cas12a体系可视化检测方法分别对最低检出限的400fg/μl杭白菊黑斑病菌alt的不同样品进行检测。如图5展示了对
①
cas12a crrna substrate
②
cas12a crrna
③
cas12a substrate
④
crrna substrate的特异性基因片段体系的荧光检测情况，结果显示，只有含substrate的cas12a以及特异性crrna能够产生可视性荧光。说明该crispr/cas12a体系可视化检测方法具有良好的检测能力。
[0040]
四、本发明方法的检测特异性表征
[0041]
为表征该crispr/cas12a体系可视化检测方法对检测杭白菊黑斑病菌alt的特异性，利用杭白菊黑斑病菌alt分离株及根腐病砖红镰刀菌fusarium incarnatum(fin)、叶枯病球毛壳菌chaetomium globosum(qm)分离株为检测样本进行该方法的检测。通过蓝光照射仪观察，如图6所示，展示了对杭白菊黑斑病菌alt和非杭白菊黑斑病菌alt的荧光检测情
况；利用杭白菊黑斑病菌a.alternata(alt)、根腐病砖红镰刀菌fusarium incarnatum(fin)、叶枯病球毛壳菌chaetomium globosum(qm)临床分离株为检测样本，进行样品预处理、alt特异性基因片段体系所用引物即seq id no.1和seq id no.2进行pcr扩增，利用alt的crrna即seq id no.3进入crispr/cas12a体系可视化检测体系进行分析，经裸眼观测展现，杭白菊黑斑病菌alt临床分离株在蓝光透射仪下检测显示为阳性；对根腐病砖红镰刀菌fin、叶枯病球毛壳菌qm的特异性体系的荧光检测均显示阴性。说明该crispr/cas12a体系可视化检测方法具有良好的准确性和特异性。
[0042]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。