一种应用于生猪养殖碳减排的噬菌体的制作方法

1.本发明属于农业微生物技术应用领域，特别涉及一种应用于生猪养殖碳 减排的噬菌体。


背景技术：

2.噬菌体是一种靶向侵染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的 病毒。使用噬菌体技术不仅可以防治畜禽细菌性疾病，还可以改善动 物肠道健康，提高饲料转化率，减少有机物的排出，有效降低畜禽养 殖过程中温室气体的排放，符合我国当前实现碳减排的系列政策。
[0003][0004]
申请cn111481574a公开了一种用于治疗仔猪腹泻的噬菌体组合制剂，其 可以减少仔猪的腹泻率，提高成活率，减少由于腹泻对仔猪造成的肠道损伤 及体重减轻。
[0005]
葛龙等2020的研究表明，在基础日粮中加入噬菌体，能显著降低白羽肉 鸡料肉比，腹泻率和死淘率。
[0006]
李培培等2017的研究表明改善猪日粮组成或加入营养添加剂、改进粪便 储存和处理方式是温室气体减排的主要途径。已有研究表明，当猪的日粮组 成发生变化，其营养成分的代谢途径、粪便成分等都随之变化，进而影响温 室气体的排放。
[0007]
另外，樊霞等2006的研究证明，营养添加剂的使用，可提高畜禽日增 重10％～30％，而相对减少单位畜产品的ch4排放量10％～40％。
[0008]
因而在保持猪生产性能稳定的情况下，通过优化日粮组成、使用营养添 加剂、提高饲料利用率等，可降低其温室气体的排放。而噬菌体不仅在细菌 性疾病的防治方面表现出优良的性质，其对猪肠道健康的调理也具有明显的 作用，可以提高饲料的转化率，降低料肉比，减少饲料的浪费和有机物的排 出，从而减少温室气体的排放，为此，本发明提出一种应用于生猪养殖碳减 排的噬菌体。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的之一是提供一种大肠杆菌噬菌体gdcp17和沙门氏菌噬菌体 gsmp2233的组合物；
[0010]
本发明的目的之二是将所述的组合物应用于应用于生猪养殖碳减排。
[0011]
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种 噬菌体组合物包括大肠杆菌噬菌体10株和沙门氏菌噬菌体5株，上 述菌株保藏时间为：2020年10月30日，保藏地址：中国.武汉.武 汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，其中包含大肠杆菌噬 菌体gdcp17(escherichia coli phage gdcp17)，其保藏编号为： cctcc no:m 2020664，沙门氏菌噬菌体gsmp2233(salmonella sppphage gsmp2233)，保藏编号为：cctcc no:m 2020661。
[0012]
进一步的，通过最佳感染条件测定和发酵制备，发现该15株噬菌体均能 发酵较高
效价，适用于大规模工业发酵生产和应用。
[0013]
进一步的，经裂解谱测定，15株噬菌体的组合物可裂解96株猪源的大肠 杆菌和沙门氏菌中的93株，裂解率为96.88％，说明15株噬菌体的组合物具 有很宽的宿主谱，可以防治由大肠杆菌和沙门氏菌引起的猪的细菌病，保护 肠道健康。
[0014]
进一步的，通过噬菌体包被及微胶囊制备技术，使噬菌体制剂在经过饲 料高温制粒时仍能保持较高活性。温度高达80℃时，处理时间30min噬菌体 活性保持在80％以上。
[0015]
进一步的，通过动物实验，发现噬菌体可提高猪的饲料利用率，减少饲 料的浪费和有机物的排出，降低料肉比，从而减少生猪养殖碳排放。
[0016]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0017]
本发明提供了一种包含15株噬菌体的噬菌体组合物，15株噬菌体均能发 酵较高效价，适用于大规模工业发酵生产和应用。
[0018]
本发明所述的噬菌体组合物能够提高猪的饲料转化率，降低料肉比，减 少生猪养殖中饲料的浪费和有机物的排出，减少碳排放。
具体实施方式
[0019]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解， 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0020]
实施例1：噬菌体最佳感染条件测定及发酵制备
[0021]
取噬菌体组合物及其对应的宿主菌，挑取宿主菌单个菌落，接种到盛有 3ml tsb培养液的试管中，于37℃过夜摇培，得到宿主菌悬液。将菌悬液以 1:100比例转接到l00ml tsb培养液中，将噬菌体稀释至一定的浓度并计数， 与宿主菌按照不同比例混合培养。培养结束后5000rpm离心l0min并收集上 清过滤除菌，测定噬菌体效价。实验重复3次。
[0022]
结果如表1所示，大肠杆菌噬菌体浓度为10
5-107pfu/ml，宿主菌od
600
为0.08-0.1之间发酵效价较好，达10
10
pfu/ml以上，沙门氏菌噬菌体浓度 为10
5-107pfu/ml，宿主菌od
600
为0.15-0.25之间发酵效价较好，达10
10
pfu /ml以上。
[0023]
表1最佳感染条件下噬菌体的发酵效价
[0024]
噬菌体编号噬菌体浓度宿主菌od
600
发酵效价gdcp17106pfu/ml0.0679.5x10
10
gdcp04106pfu/ml0.0815.7x10
10
gdcp05105pfu/ml0.0706.3x10
10
gdcp07107pfu/ml0.0627.2x10
10
gdcp10106pfu/ml0.0813.6x10
10
gdcp11106pfu/ml0.0884.9x10
10
gdcp12105pfu/ml0.0715.7x10
10
gdcp14105pfu/ml0.0706.3x10
10
gdcp15107pfu/ml0.0805.2x10
10
gdcp16106pfu/ml0.0812.9x10
10
gsmp2233106pfu/ml0.1802.3x10
11
gsmp02105pfu/ml0.1584.7x10
10
gsmp05106pfu/ml0.1766.6x10
10
gsmp06107pfu/ml0.2113.7x10
10
gsmp07105pfu/ml0.1645..1x10
10
[0025]
实施例2：噬菌体组合物裂解率测定
[0026]
采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱，将上述15株效价高于5.0x109pfu/ml 的噬菌体发酵液，按照1：1的比例混合，制成噬菌体组合物。选取不同血清 型的猪源大肠杆菌61株、沙门氏菌35株，挑取单菌落分别接种于盛有3ml tsb 的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取500μl菌悬液分别与tsb 半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，待凝固后取5μl噬菌体组合物点滴 于平板上。待自然风干后37℃培养6-8h，观察裂解结果。试验重复三次。
[0027]
结果如表2所示，噬菌体组合物具有很宽的宿主范围。可裂解96株不同 血清型的大肠杆菌及沙门氏菌中的93株，裂解率为96.88％。
[0028]
表2噬菌体组合物的裂解谱测定结果
[0029]
[0030]
[0031][0032][0033]
注：“ ”表示可以裂解，
“‑”
表示不能裂解。
[0034]
实施例3：噬菌体微胶囊制备及制剂配制
[0035]
为提高噬菌体在饲料加工过程中的耐高温性，对噬菌体进行包被。选用 玉米淀粉为载体，将其与噬菌体发酵液混合，同时加入10mmol/l cacl2，采 用流化床法进行干燥造粒。以水溶性大豆多糖与明胶为包被材料，水溶性大 豆多糖与明胶混合溶于水中，高速搅拌下混合均匀，加入适量固体干燥的噬 菌体颗粒，使混合溶液中水溶性大豆多糖、明胶、噬菌体的质量比为10:2:1； 继续搅拌，混合均匀后4℃条件下静置24小时，液氮冷冻后用冷冻干燥机干 燥。收集得到的微囊产品，粉碎后过筛。将不同的噬菌体微胶囊按照1:1的 比例混合均匀配配制成噬菌体制剂。
[0036]
温度测定，将噬菌体微胶囊制剂在不同温度下处理30min，结果表明经过 包被的噬菌体可以耐受较高温度，80℃的温度处理30min，仍能保持80％以上 的活性，而未包被组的噬菌体活性不足5％。结果见表3。
[0037]
表3不同温度处理噬菌体活性
[0038][0039]
实施例4：噬菌体制剂对仔猪生产性能的影响
[0040]
选取湖北某规模化猪场25日龄断奶仔猪240头，公母各半，随机分成对 照组与试验组，每组120头，设置为3个重复，每个重复40头，试验组饲料 添加噬菌体制剂(200g/t)，试验周期35天，实验结束后统计各生产指标。
[0041]
结果如表4所示，试验组使用噬菌体后断奶仔猪的料肉比为1.50
±
0.05， 比对照组的1.69
±
0.06低0.19。
[0042]
表4噬菌体对断奶仔猪生长性能的影响
[0043][0044]
实施例5噬菌体制剂对生长育肥猪生长性能的影响
[0045]
选取湖北某规模化猪场98日龄生长育肥猪120头，公母各半，随机分成 对照组与试验组，每组60头，设置为3个重复，每个重复20头，试验组饲 料添加噬菌体制剂(100g/t)，试验周期57天，实验结束后统计各生产指标。
[0046]
结果如表5所示，试验组生长育肥猪用噬菌体后料肉比为3.28
±
0.05， 比对照组的3.45
±
0.07低0.17。
[0047]
表5噬菌体对生长育肥猪生长性能的影响
[0048][0049]
实施例4和5的结果表明，使用噬菌体，可以降低生猪养殖的料肉比， 说明在养殖过程中提高了饲料转化率，减少了饲料的浪费和有机物的排出， 从而减少了温室气体的排放。
[0050]
实施例6：生猪养殖使用噬菌体技术减少的温室气体排放量
[0051]
(1)根据“gb/t 17824.1-2008规模猪场建设”要求，600头基础母猪 标准化规模猪场亚类别猪存栏量见表6。
[0052]
表6规模化猪场各亚类猪存栏数
[0053]
参数断奶仔猪生长育肥猪母猪存栏数(头)13683424600
[0054]
(2)规模猪场温室气体排放因子选择
[0055]
生猪养殖温室气体来源主要包括猪肠道甲烷排放和粪便管理过程中的温室气 体排放。其中肠道甲烷排放因子选择张哲瑜《生猪养殖企业温室气体排放核算方法 研究》中的排放因子缺省值1.32kg ch4/头/年；粪便管理过程甲烷排放因子选择《省 级指南》中中南地区的排放因子缺省值5.85kg ch4/头/年；粪便管理过程氧化亚氮 排放因子选择《省级指南》中中南地区的排放因子缺省值0.157kg ch4/头/年。
[0056]
(3)规模化猪场使用噬菌体技术温室气体减排量
[0057]
根据实施例4的料肉比结果，可得出使用噬菌体后饲养每头断奶仔猪节 约的饲料量可多养对照组断奶仔猪0.112头；根据实施例5的料肉比结果， 可得出使用噬菌体后饲养每头育肥猪节约的饲料量可多养对照组育肥猪 0.049头。因此采用《低碳发展及省级温室气体清单编制培训教材》中的方法 估算使用噬菌体技术每养一头猪温室气体减排量为0.037吨。