一种具有促进苜蓿生长作用的根瘤菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有促进苜蓿生长作用的根瘤菌及其应用。


背景技术：

2.紫花苜蓿 (medicago sativa )为豆科苜蓿属多年生草本植物，其适应性广、生活力强、产量高、品质优良，是世界上栽培面积最广的主要牧草，被誉为“牧草之王”。紫花苜蓿草质优良，富含粗蛋白质、维生素和无机盐等多种营养物质，常被用作家畜的优质饲草，在解决我国优质饲草短缺等方面起着重要的作用。2017年和2019年中央1号文件、国家“粮改饲”政策等均明确提出扩大苜蓿种植面积的指导政策，推动了紫花苜蓿产业的快速发展。
3.紫花苜蓿能够与土壤中根瘤菌形成根瘤，进行生物共生结瘤固氮，从而增加氮素吸收，减少施用氮肥造成的污染，同时提高苜蓿的成苗率、幼苗结瘤率、增加苜蓿产草量和蛋白质含量。因此，为紫花苜蓿接种高效根瘤菌，是提高其产量和品质最重要的方法之一。接种根瘤菌可以使紫花苜蓿从空气中固氮的总量达到200～400 kg /hm2，可提供其生长所需46%～92%的氮素。并且，使用根瘤菌的投入较小，根瘤菌接种剂的成本每亩只需3元左右，但产草量可增产20%-60%。
4.目前已经从豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草的根际土壤或根瘤筛选到一系列的苜蓿根瘤菌，对苜蓿的结瘤率、产量、蛋白含量有显著的增益作用。但是，现有的紫花苜蓿根瘤菌促进苜蓿结瘤的能力不高，盆栽或田间试验接种根瘤菌60天，苜蓿单株平均结瘤数仅有1.0~23.2个/株。另外，由于根瘤菌具有地区性的生态适应性，根瘤菌接种剂的效果受当地气候和土壤环境的影响，因此要因地制宜地筛选适合特定土壤和特定品种的根瘤菌来提高紫花苜蓿固氮效率。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种具有促进苜蓿生长作用的根瘤菌及其应用。本发明中提供的根瘤菌，其具有结瘤能力强的特性，接种该根瘤菌能够显著促进紫花苜蓿根的生长及快速、高效结瘤可用于苜蓿常规栽培接种的优良根瘤菌菌剂，有助于种植业发展，缓解畜牧业饲草不足的问题。
6.本发明中首先提供了一种根瘤菌，所述根瘤菌为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04，来源于苜蓿。所述根瘤菌保藏于中国微生物保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号cgmcc no.22805，保藏时间为2021年6月30日。
7.其中，所述草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04在yma固体培养基上生长良好，不吸红，菌落呈圆形，乳白色，半透明，粘质多。
8.本发明中还提供了上述草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04的分离方法，具体包括如下步骤：
（1）将生长于苜蓿的根瘤，表面杀菌消毒后压碎，加入无菌水，然后涂布于yma固体培养基上培养；（2）挑取培养得到的单菌落在yma固体培养基上划线培养，得到纯系菌株；（3）将纯系菌株接种于lb液体培养基中培养，然后加入甘油，混合后冷冻保存；（4）将得到的纯系菌株通过侵染苜蓿幼苗验证其结瘤能力后，鉴定，并保存菌种，其中一株分离纯化所得的根瘤菌命名为hy04。
9.本发明中还提供了上述根瘤菌的应用，所述应用为用于制备微生物菌剂或肥料。
10.本发明中还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04。
11.本发明中还提供了一种肥料，所述肥料含有上述草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04。
12.本发明中还提供了上述根瘤菌、微生物菌剂、肥料在促进苜蓿生长中的应用。
13.进一步的，所述促进苜蓿生长体现为促进苜蓿幼苗根部快速、高效结瘤。
14.本发明中还提供了上述根瘤菌、微生物菌剂、肥料在苜蓿的育苗中的应用。
15.本发明中还提供了一种促进苜蓿幼苗快速、高效结瘤的方法，具体包括：用草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）发酵原液hy04或含草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04的菌剂或含草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04的肥料灌根、侵染、施肥。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供的草木犀中华根瘤菌来源可靠，通过紫花苜蓿西叶20 品种捕捉自江苏省扬州地区土壤中的根瘤菌。
17.本发明所述根瘤菌，可快速与长江中下游种植的特有紫花苜蓿建立高度匹配的专一性共生关系，促生其根部快速、高效结瘤，对提高紫花苜蓿产量有良好的应用前景，在苜蓿的产业化种植中有重要的应用潜力。
18.本发明所述根瘤菌有较强的根部结瘤的能力，能够使得紫花苜蓿根在短时间内生长及快速、高效结瘤。本发明对所述草木犀中华根瘤菌cgmcc no.22805经盆栽试验发现，接种该菌株4周后紫花苜蓿根部快速生长，鲜重增长率达49.87%，而且单株平均结瘤数达到33.6
±
15.68个/株，比不接菌对照根瘤数增加104.58%。与现有根瘤菌相比，使紫花苜蓿结瘤更快速，结瘤数更高。本发明中提供的为开发相关微生物肥料奠定了基础，对提高紫花苜蓿的产量，促进紫花苜规模化种植有良好的应用前景。
附图说明
19.图1为不同处理下紫花苜蓿根部结瘤情况图；其中a为以无菌水代替草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液的阴性对照组；b为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液接种的处理组；c为根瘤菌商业菌接种的阳性对照组。
20.图2为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04对紫花苜蓿根部结瘤的影响图；图中，a为以无菌水代替草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液的阴性对照组；b为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液接种的处理组；c为根瘤菌商业菌接种的阳性对照组。
21.图3为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04对紫花苜蓿根鲜重的影响图；图中，a为以无菌水代替草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液的阴性对照组；b为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液接种的处理组；c为根瘤菌商业菌接种的阳性对照组。
具体实施方式
22.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
23.本发明实施例中所用紫花苜蓿取自扬州大学试验田的紫花苜蓿西叶02品种，本发明所述西叶02、淮扬2号种子均可通过商业途径直接购买得到。
24.实施例1：草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04的分离培养本实施方式中，草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04是从紫花苜蓿西叶02品种的根中分离到的，其分离方法如下：（1）将紫花苜蓿根部用流水冲洗干净，取淡粉色或者粉色粒大饱满的根瘤20个左右，用质量浓度为70%的酒精冲洗30s，然后无菌水冲洗5次，冲洗后用质量浓度为5%的次氯酸钠浸泡3min，浸泡后无菌水冲洗10次，杀灭表面微生物。
25.（2）将杀灭表面微生物的根瘤置入灭菌后的研钵中，用灭菌后的镊子将根瘤压碎，然后加100μl无菌水混匀后涂布于添加25 mg/l刚果红的yma固体培养基（甘露醇 14g，酵母粉 4.5g，mgso4
·
7h2o 0.1g，k2hpo4 0.4g，nacl 0.3g，cacl2 0.01g，琼脂，20g，水1000ml；ph 7.0（vincent et al.，1970））上，30℃倒置培养48h，挑取不吸红的单菌落在yma固体培养基上反复划线纯化，直到得到纯系菌株为止。
26.（3）将获得的多株纯系菌株接种于yma液体培养基中，30℃培养18h得到菌液，取菌液700μl加入质量浓度为50%的甘油300μl，混合后置于-70℃冰柜中冷冻保存；将其中一株分离纯化所得的根瘤菌命名为hy04，所述苜蓿草木犀中华根瘤菌hy04，具有如下生物学特征：菌落形态特征：在yma固体培养基上生长良好，不吸红，菌落呈圆形，乳白色，半透明，粘质多；部分生理生化特征：可在yma培养基上良好生长，最适生长温度30℃，最适生长ph7.0。
27.根据《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英，科学出版社，2001）记载，本发明的根瘤菌hy04形态特征与草木犀中华根瘤菌属最接近，结合该菌的菌落特征，将该根瘤菌鉴定为草木犀中华根瘤菌属（sinorhizobium meliloti），于2021年6月30号在中国微生物保藏中心保藏，保藏号cgmcc no.22805，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
28.将经上述方法筛选的菌株hy04，用通用引物27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'（seq id no:1） 和1492r：5'-taccttgttacgactt-3'（seq id no:2），产物送生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果如seq id no:3所示。将测序结果在genbank国际数据库中blast分析，分析表明，根瘤菌hy04属于草木犀中华根瘤菌属（sinorhizobium meliloti），命名为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04。
29.实施例2：草木犀中华根瘤菌属（sinorhizobium meliloti）hy04的培养制种及应
用取实施例1中-70℃冷冻保存的草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04菌液，划线接种于yma固体培养基上，30℃恒温箱中倒置培养24～48h，挑取单菌落接种于5ml的yma液体培养基中，30℃震荡培养14～24h，活化菌液。
30.将1ml活化菌液接种于装有100ml yma液体培养基的三角瓶中，30℃、180r/min振荡培养15h，得到od
600
约为1.5的处于对数生长期的发酵液，倒入灭菌的离心管，5000r/min离心5min，倒掉上清，无菌水重悬，配置od
600
为1.5菌悬液本实施例中还探讨了上述得到的处于对数生长期的草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04菌悬液对紫花苜蓿根部结瘤影响，具体步骤为：（1）紫花苜蓿播种：选取颗粒大小均匀的紫花苜蓿品种淮扬2号种子（市售），播种装满50g混合基质（营养土：蛭石=5:3）的盆钵中，每盆5棵，每个处理设置5盆重复；（2）紫花苜蓿的侵染：长至3～4周，用草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04菌悬液灌根侵染，具体操作为：向每盆紫花苜蓿基部加入50ml草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti）hy04菌悬液为实验组，并以无菌水代替菌悬液作为阴性对照，购买的根瘤菌菌液侵染作为阳性对照。
31.（3）紫花苜蓿的培养：将上述实验组与阳性对照、阴性对照放置在25℃，光照强度为10000ix的条件下光照培养（光循环：16小时光照，8小时黑暗），培养3～4周后测根瘤数。
32.图1为不同处理下紫花苜蓿根部结瘤情况图；其中a为以无菌水代替草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液的阴性对照组；b为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液接种的处理组；c为根瘤菌商业菌接种的阳性对照组。从图中可以看出，本发明中所述草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04对紫花苜蓿根部结瘤具有明显的促进作用。
33.图2为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04对紫花苜蓿幼苗根部结瘤的影响图；图中，a为以无菌水代替草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液的阴性对照组；b为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液接种的处理组；c为根瘤菌商业菌接种的阳性对照组。从图中可以看出，实验组中紫花苜蓿4周后单株平均结瘤数达到33.6
±
15.68，比不接菌阴性对照组根瘤数增加104.58%，比阳性对照组增长31.71％。说明接种草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04可促进紫花苜蓿根部快速，高效结瘤。
34.图3为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04对紫花苜蓿根鲜重的影响图；图中，a为以无菌水代替草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液的阴性对照组；b为草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04菌液接种的处理组；c为根瘤菌商业菌接种的阳性对照组。从图中可以看出，实验组紫花苜蓿根鲜重与商业根瘤菌处理无显著性差异，比不阴性对照组增长49.87％。说明接种草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04可促进紫花苜蓿根的生长发育。
35.综上所述，本发明中分离得到的草木犀中华根瘤菌（sinorhizobium melilot）hy04对紫花苜蓿根部结瘤、根的生长发育都有显著的促进作用（图1），实验组紫花苜蓿接种该菌株4周后单株平均结瘤数达到33.6
±
15.68个/株，比不接菌阴性对照组根瘤数增加104.58%。比阳性对照组增长31.71％（图2），实验组紫花苜蓿根鲜重与商业根瘤菌处理无显
著性差异，比不接菌阴性对照组增长49.87％（图3）。
36.所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。