一种葡萄籽提取物中原花青素C1的测定方法与流程

一种葡萄籽提取物中原花青素c1的测定方法
技术领域
1.本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种葡萄籽提取物中原花青素c1的测定方法。


背景技术：

2.原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，具有抗氧化、消除自由基的作用。2021年中科院院营养与健康研究所发布了关于葡萄籽提取物中的原花青素c1具有定向清除衰老细胞的作用，因此开发测定葡萄籽提取物中原花青素c1的检测方法具有一定的研究意义。
3.《uplc测定桂皮中原花青素b-2和原花青素c-1含量》和《hplc法同时测定金荞麦片中6个多酚类成分》涉及原花青素c1的含量检测。这两篇文献均用液相仪器在280nm/220nm波长下测定原花青素c1含量，而葡萄籽提取物具有多种结构相似的多酚成分，多酚类物质在280nm/220nm均有紫外强吸收，导致现有的检测方法不能很好的适用于葡萄籽提取物中原花青素测定。本技术使用文献《uplc测定桂皮中原花青素b-2和原花青素c-1含量》的方法：c18色谱柱(2.0 mm
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100 mm，2μm)，流动相乙腈-0.2%乙酸水梯度洗脱，检测器波长280 nm，测定定葡萄籽提取物中原花青素c1，结果如图1-1所示。结果表明使用该方法检测葡萄籽提取物会有很多杂峰干扰，不能有效分离原花青素c1和其它多酚类物质，原花青素c1保留时间为11.340min（其中原花青素c1和原花青素c2互为旋光异构体，较难分离）。本技术使用文献《hplc法同时测定金荞麦片中6个多酚类成分》的方法：使用c18色谱柱（250 mm
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4.6 mm，5μm）,流动相为乙腈与磷酸水溶液梯度洗脱,检测波长220 nm测定葡萄籽提取物中原花青素c1，结果如图1-2所示。结果表明使用该方法检测葡萄籽提取物会同样不能有效分离原花青素c1和其他多酚类物质（原花青素c1保留时间为9.819min）。此外，由图1-1和图1-2可得使用文献方法实施测定葡萄籽提取物中原花青素c1均存在基质干扰，基线上抬，原花青素c1专属性不足的问题，导致无法准确定量原花青素c1，因此，需要开发一种专属性强，能准确定量葡萄籽提取物中原花青素c1含量的测定方法。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种葡萄籽提取物中原花青素c1的测定方法，该方法可以消除葡萄籽提取物中其它多酚类物质的基质干扰，专属性强，能准确定量葡萄籽提取物中原花青素c1含量。
5.本发明是通过以下技术方案实现：一种葡萄籽提取物中原花青素c1的测定方法，包括以下步骤：（1）将葡萄籽提取物待测样品加入有机溶剂提取，得供试品溶液；（2）取供试品溶液，采用液质联用仪进行检测，采用外标法定量计算样品中原花青素c1含量；其中色谱条件为：采用五氟苯基色谱柱、苯基色谱柱或c30色谱柱，以质量浓度为0.05-0.5%甲酸为流动相a，甲醇为流动相b进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：
流动相a得起始占比80-95%，保持1min；然后降低流动相a占比，到3min时流动相a占比70-85%；然后进一步降低流动相a占比，至8min时流动相a占比50-65%，然后保持5min；然后13.01min迅速将流动相a占比提高到80-95%，并保持3min。
6.本发明方法采用有机溶剂对葡萄籽提取物待测样品进行提取，提取后供试品溶液用液质联用仪分析，以0.05-0.5%甲酸和甲醇作为流动相进行梯度洗脱，使用五氟苯基色谱柱、苯基色谱柱或c30色谱柱进行原花青素同分异构体分离，并用外标法定量，得到葡萄籽提取物中原花青素c1的含量。
7.本发明通过对色谱柱，流动相及洗脱程序进行优化，不仅可以分离葡萄籽提取物中其他多酚类物质，还可以分离互为旋光异构体的原花青素c1和原花青素c2，排除了原花青素c1以外的其它多酚类物质的基质干扰，从而实现了对原花青素c1的准确定量。
8.优选的，步骤（2）中，梯度洗脱程序为：时间min流动相a%流动相b 551955385158653513653513.0195515955优选的，步骤（1）中，所述有机溶剂为乙醇溶液、甲醇溶液或乙腈溶液，更优选为50-80%乙醇溶液。
9.优选的，步骤（1）中，所述提取方式为超声提取或加热回流提取，优选为超声提取，所述超声提取的温度为25-35℃，提取的时间为5-15min。
10.优选的，步骤（2）中，所述色谱柱的柱长为15cm，内径为4.6mm，粒径为2.6μm。
11.优选的，步骤（2）中，所述甲酸浓度优选为0.1%。
12.优选的，步骤（2）中，所述色谱柱的柱温为25-40℃，流速为0.2-0.6 ml/min。
13.本发明与现有技术相比，具有如下优点：本发明方法运用液质联用仪分析技术进行分析，并通过色谱条件的优化，可以排除葡萄籽提取物中原花青素c1以外的其它多酚类物质的基质干扰，特别是和原花青素c1互为旋光异构体的原花青素c2的干扰，从而能够准确测定葡萄籽提取物中原花青素c1的含量，有利于实现对葡萄籽提取物质量的有效控制。
14.本发明的检测方法专属性强，其线性、精密度、耐用性试验（稳定性）、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度（回收率）试验，均符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，该方法科学有效，能对葡萄糖籽提取物的原花青素c1含量起到质量控制的目的。
附图说明
15.图1-1为根据文献《uplc测定桂皮中原花青素b-2和原花青素c-1含量》方法分析葡萄籽提取物样品色谱图。
16.图1-2为根据文献《hplc法同时测定金荞麦片中6个多酚类成分》方法分析液相中葡萄籽提取物样品色谱图。
17.图2为原花青素c1标准工作曲线图。
18.图3为c18色谱柱分析原花青素c1和原花青素c2混合对照品色谱图。
19.图4为五氟苯基柱分析原花青素c1和原花青素c2混合品对照色谱图。
20.图5为苯基柱分析原花青素c1和原花青素c2混合对照品色谱图。
21.图6为c30柱分析原花青素c1和原花青素c2混合对照品色谱图。
22.图7为乙腈-乙酸水梯度洗脱程序一分析葡萄籽提取物样品色谱图。
23.图8为甲醇-甲酸水梯度洗脱程序一分析葡萄籽提取物样品色谱图。
24.图9-1 为梯度洗脱程序一分析原花青素c1对照品色谱图。
25.图9-2 为梯度洗脱程序一分析原花青素c2对照品色谱图。
26.图10-1为梯度洗脱程序三分析原花青素c1对照品色谱图。
27.图10-2为梯度洗脱程序三分析原花青素c2对照品色谱图。
28.具体实施方式
29.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
30.实施例1：一、仪器与试剂1 仪器电子天平；超声振荡仪；液相质谱联用仪：lc-30a型液相色谱仪( shimadzu，日本) 串联 triple quad 4500 型质谱仪( ab sciex，美国)。
31.试剂除特殊说明，所用试剂均为分析纯。
32.试剂：甲酸（色谱纯），一级用水，甲醇（色谱纯），乙醇。
33.对照品：原花青素c1（来源：成都普思生物，批号:ps011257，纯度:95.11%），原花青素c2（来源：zz stanards，批号:22b200-a1，纯度:99.0%）。
34.二、分析方法2.1 仪器条件与参数：2.1.1 色谱条件色谱柱：菲洛美f5填充剂（柱长15cm，内径4.6mm，粒径2.6μm ）；柱温：40℃；流速：0.4ml/min；流动相：a为0.1%甲酸溶液，b为甲醇，按下表1梯度洗脱；表1 ：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）
095-805-20195-805-20385-7015-35865-5035-501365-5035-5013.0195-805-201595-805-202.1.2质谱条件如下表2和表3：mrm模式：表2：气帘气cur碰撞气cad离子电压is雾化温度tem雾化器gs1辅助加热气gs215855004005050表3：名称电离方式q1q3time（ms）dpce原花青素c1esi 868.0716.0*20010030原花青素c1esi 868.0698.320010032.9*定量离子对2.2 对照品溶液的配制精密称取原花青素c1对照品12.98mg，置于50ml容量瓶中，加入70%乙醇溶液超声溶解定容至刻度，摇匀，即得0.247mg/ml的对照储备液。
35.精密移取1.00ml对照储备液，置50ml容量瓶中，加70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得4.94μg/ml的对照中间液。
36.精密移取1.00ml对照中间液，置10ml容量瓶中，加70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得0.494μg/ml的对照工作液。
37.2.3 标准工作曲线绘制精密吸取工作标准液进样量：0.5μl，1μl，2μl，4μl，8μl与样品供试品溶液进样量：2μl，注入液相色谱-质谱联用仪，建立标准曲线方程。
38.2.4 样品供试液制备精密称取均匀样品约0.2g，置于50ml容量瓶中，加入70%乙醇溶液，室温超声至充分溶解5-15min，取出，用70%乙醇溶液定容至容量瓶刻度，摇匀得样品中间液1。精密移取1ml样品中间液1，置于50ml容量瓶中，加入70%乙醇溶液定容至容量瓶刻度，摇匀得样品中间液2。精密移取1ml样品中间液2，置于10ml容量瓶中，加入70%乙醇溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经滤膜过滤，即得样品供试液。
39.2.5 结果计算：式中： x—试样中原花青素c1的含量，g/100g；c—试样溶液中原花青素c1的浓度，μg/ml；m—试样的质量，g；
v—试样稀释的体积，ml；k—单位转换系数，。
40.三、方法学验证3.1 专属性试验(空白)按2.4试样制备方法处理空白溶液，按2.1色谱条件测定空白溶液，与原花青素c1工作标准液的出峰时间对比。结果显示，空白溶液在原花青素c1的出峰时间处均无峰，表明空白对测定结果基本无干扰。
41.线性范围确认3.2.1工作标准液的试验数据见下表4：表4：3.2.2标准工作曲线图以浓度的为横坐标，峰面积的为纵坐标，绘制标准工作曲线如图2所示。
42.3.2.3线性试验结论线性评价：原花青素c1相关系数r分别为0.9999，所以用该方法测定原花青素c1在浓度为0.124μg/ml至1.976μg/ml之间呈现良好的线性，符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【gb/t27404-2008要求相关系数r≥0.99】。
43.检出限和定量限分析方法的检出限dl和定量限ql由信噪比（s/n）计算。dl定义为s/n=3时对应的待分析浓度，ql定义为s/n=10时对应的待分析浓度。
44.3.3.1检出限当信噪比（s/n）为3时，原花青素c1检出限为0.01μg/ml；样品取样量0.2g，定容25000ml时，方法的原花青素c1检出限为1.25mg/g。
45.3.3.2定量限当信噪比（s/n）为10时，原花青素c1定量限为0.04μg/ml；样品取样量0.2g，定容25000ml时，方法的原花青素c1定量限为4.17mg/g。
46.精密度试验3.4.1 试验方法 称取6份样品，按2.4试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其rsd（%）。
47.3.4.2 试验数据见下表5【试验样品为：葡萄糖籽提取物】表5：
3.4.3 试验结论6份样品原花青素c1含量的rsd为2.4%，表明该方法有较好的精密度，符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【gb/t27404-2008要求rsd≤2.7%】。
48.准确度试验（回收率）3.5.1试验方法加标：精密称取约0.2g样品9份（已知样品的原花青素c1含量：5.61g/100g），分成3组，每组3份，置于50ml容量瓶中，加入70%乙醇溶液，室温超声至充分溶解，约5-15min，取出，用70%乙醇溶液定容至容量瓶刻度，摇匀得样品加标中间液1。精密移取1ml样品加标中间液1置于50ml容量瓶中，每组加入对照储备液（0.247mg/ml）0.6ml、0.9ml、1.2ml，加入70%乙醇溶液定容至容量瓶刻度，摇匀得样品加标中间液2。精密移取1ml样品加标中间液2，置于10ml容量瓶中，加入70%乙醇溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经滤膜过滤，即得样品加标供试溶液，进样量2μl。
49.3.5.2试验数据如下表6【试验样品为：葡萄糖籽提取物】表6 ：测得加入量=加标样品测得量
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样品测得量；回收率(%)=测得加入量/理论加入量
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100%。
50.3.5.3试验结论平均回收率为：100.1%， rsd为2.6%；符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【gb/t27404-2008要求回收率为95~105%】。
51.结论通过对原花青素c1的含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验（稳定性）、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度（回收率）试验，均符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对葡萄糖籽提取物的原花青素c1含量起到质量控制的目的。
52.四、色谱柱的优化葡萄籽提取物中原花青素c1的检测难点在于互为旋光异构体的原花青素c1（pcc1）和原花青素c2（pcc2）的分离。本发明研究发现，要解决上述技术问题，色谱柱的选择为关键因素之一。
53.本发明比较c18色谱柱、五氟苯基色谱柱、苯基柱和c30色谱柱。
54.c18色谱柱：一般常规色谱分析实验使用的色谱柱为c18色谱柱，本发明采用c18色谱柱（4.6mm
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150mm，2.6μm）检测pcc1和pcc2的混合对照品，其余检测条件同实施例1，其色谱图如图3所示。其中8.25min为pcc2,8.74min为pcc1,由图可以看出，c18色谱柱不能将原花青素c1和原花青素c2进行有效分离。本发明尝试多次调节流行相梯度比例，但使用c18色谱柱均不能将二者有效分离，从而无法进行原花青素c1定量分析。
55.五氟苯基色谱柱：采用五氟苯基色谱柱（柱长15cm，内径4.6mm，粒径2.6μm ）替代c18色谱柱进行试验，其色谱图如图4所示，其中10.56min为pcc2,11.91min为pcc1。 由图可以看出，五氟苯基色谱柱可以将原花青素c1和原花青素c2进行有效分离，且分离度较好。
56.苯基色谱柱：采用苯基色谱柱（aglent xdb-phenyl柱长15cm，内径4.6mm，粒径2.6μm）替代c18色谱柱检测进行试验，其色谱图如图5所示。其中9.24min为pcc2,9.86min为pcc1。 由图可以看出，苯基色谱柱可以将原花青素c1和原花青素c2进行有效分离，且分离度较好。
57.c30色谱柱：采用c30色谱柱（岛津c30 柱长15cm，内径4.6mm，粒径2.6μm）替代c18色谱柱进行试验，其色谱图如图6所示。其中11.38min为pcc2,12.86min为pcc1, 由图可以看出，c30色谱柱可以将原花青素c1和原花青素c2进行有效分离，且分离度较好。
58.因此，本发明选用五氟苯基色谱柱、苯基色谱柱或c30色谱柱作为本发明的色谱柱。
59.五、色谱条件的优化要实现原花青素c1和原花青素c2的有效分离，流动相及洗脱程序的选择也是关键技术之一。
60.流动相的选择：以乙腈-乙酸水为流动相检测葡萄籽提取物，其余条件同实施例1，其色谱图如为图7（pcc1保留时间6.26min）。结果显示，乙腈-乙酸水不能很好分离样品中原花青素c1峰与其它干扰成分峰。
61.以0.1%甲酸溶液和甲醇为流动相检测葡萄籽提取物，其余条件同实施例1，其色谱图为图8（pcc1保留时间11.87min），结果显示，0.1%甲酸溶液和甲醇可以分离样品中原花青素c1峰与其它干扰成分峰。
62.梯度洗脱程序的优化：梯度洗脱程序一：起始10%甲醇， 5分钟内甲醇由10%递增至80%，80%甲醇保持3分
钟，后立即恢复10%甲醇保持2分钟。原花青素c1对照如图9-1所示，原花青素c2对照如图9-2所示，原花青素c1（保留时间5.97min）和原花青素c2（保留时间5.95min）的保留时间重合。由此可知，甲醇洗脱梯度幅度过大可使原花青素c1和原花青素c2无法分离。
63.梯度洗脱程序二：将梯度洗脱程序调整为起始5%甲醇，保持1分钟，3分钟后，增加至15%甲醇，8分钟后，增加至35%甲醇，35%甲醇保持5分钟后立马恢复5%的甲醇保持2分钟，如图4所示，可有效分离原花青素c1（保留时间11.91min）和原花青素c2（保留时间10.56min）。
64.梯度洗脱程序三：将梯度洗脱程序调整为起始20%甲醇，保持1分钟，3分钟后，增加至30%甲醇，8分钟后，增加至50%甲醇，50%甲醇保持5分钟后立马恢复20%的甲醇保持2分钟，如图10-1,图10-2所示，可有效分离原花青素c1（保留时间8.91min）和原花青素c2（保留时间5.95min）。