检测新型冠状病毒的肽段探针及其制备方法和应用与流程

技术特征：
1.一种检测新型冠状病毒的肽段探针，其特征在于，肽段探针包括新型冠状病毒s 蛋白检测探针和新型冠状病毒n蛋白检测探针，新型冠状病毒s 蛋白检测探针的序列为fasvyawnr和qiapgqtgk，新型冠状病毒n蛋白检测探针序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的肽段探针，其特征在于，肽段探针通过如下制备方法获得：筛选或分离新型冠状病毒蛋白，从新型冠状病毒蛋白中筛选肽段序列，肽探针标记，对新型冠状病毒蛋白质谱进行检测分析，平行反应检测得到两种含有arg(13c6,15n4)标记的肽段和两种含有lys(13c6,15n2)标记的肽段作为标准品。3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒的肽段探针，其特征在于，所述的新型冠状病毒蛋白（s1和n）中筛选获得。4.根据权利要求2所述的新型冠状病毒的肽段探针，其特征在于，所述的新型冠状病毒蛋白的分离步骤为：s1、选择大肠杆菌，将大肠杆菌细胞在luria-bertani肉汤培养基中于 37
°
c 下稳定生长，同时将终浓度为50
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g/ml的卡那霉素添加到细菌培养基中，培养的大肠杆菌dh5a和bl21-gold 分别用制备质粒dna和蛋白质生产的宿主细胞，得到携带有pet28a-sars-cov-2-s1和pet28a-sars-cov-2-n的大肠杆菌 bl21-gold；s2、sars-cov-2-s1-his6 和 sars-cov-2-n-his6 蛋白的分离：携带有pet28a-sars-cov-2-s1和pet28a-sars-cov-2-n的大肠杆菌 bl21-gold 在 37
°
c 振荡下在500 ml lb培养基稳定生长至od600 nm值为0.5；然后加入iptg，终浓度为0.5 mm，将细菌培养2小时；收获细胞后，用 pbs 洗涤一次，重新悬浮在10 ml pbs 中，并通过超声破碎处理；通过与his-select ni-nta-sefinose柱混合，将全细胞裂解物用sars-cov-2-s1-his6 和 sars-cov-2-n-his6 纯化，用洗脱缓冲液洗脱柱，10%分离凝胶中进行sds-page分析以排除分子量，得到纯化的sars-cov-2-s1-his6和 sars-cov-2-n-his6 蛋白样品，即新型冠状病毒蛋白。5.根据权利要求2所述的新型冠状病毒的肽段探针，其特征在于，所述对筛选新冠肽段探针的具体步骤包括：将新冠蛋白悬浮在含有 50 mm nh4hco
3 的 0.1% w/vrapigest sf 溶液中，并在56
°
c-59下在 5 mm 1,4-二硫苏糖醇中还原30分钟；冷却后，通过与 10 mm 碘化乙酰胺在暗室中孵育30分钟来进行烷基化，之后，加入终浓度 5 mm dtt 并在室温下孵育15分钟；将标记肽与未标记肽按4:1的比例加入溶液中，然后加胰蛋白酶：蛋白质入量比为1:50的测序级修饰胰蛋白酶，胰蛋白酶消化液在37℃孵育过夜消化，消化后，溶液用三氟乙酸酸化并在37
°
c孵育1小时以分解rapigest sf，以13000 g离心10分钟后，将溶液转移到另一管中，真空干燥。6.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒蛋白的肽段探针，其特征在于，所述对新型冠状病毒蛋白质谱进行检测分析的具体步骤包括：使用 q-exactive hf 质谱仪与 ultimate 3000 rslcnano 系统进行 dda（data-independent acquisition，数据依赖性采集） 检测实验，将样品加载到具有0.1% fa 水溶液的捕集柱（100 μm
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2 cm，填充 reprosil-pur c18-aq，3 μm），在 c18 柱上以 300 nl/min 的流速和 4% 至 40% b 相，即0.1% fa 的 80% 乙腈溶液9分钟，40% 至 90% b 相 5 分钟，90% b 相 5分钟，质谱仪在正离子化模式下运行，母体 ms 扫描分辨率为 30000，agc 目标为 3
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106，最大进样时间为 100 ms；前 20 种方法
用于在 ms 和 ms/ms 扫描之间自动切换， dda 原始文件通过 proteome discoverer 2.2分析：选择胰蛋白酶作为消化酶，最大遗漏裂解位点为 2，前体质量耐受性为 10 ppm，片段质量耐受性为 0.02 da，氨基甲酰甲基化半胱氨酸处设置为静态修饰，蛋氨酸处的氧化设置为动态修饰，使用基于过滤器的过滤结果为fdr < 1%。7.根据权利要求2所述的新型冠状病毒的肽段探针获得方法，其特征在于，所述平行反应检测的具体步骤包括：使用配备 ultimate 3000 lc 系统的 q-exactive hf 质谱仪prm分析 ，将每个样品加载到具有 a 相（0.1% fa 水溶液）的捕集柱上，捕集柱为100 μm
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2 cm，肽分离在 c18 柱（填充75 μm
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12 cm reprosil-pur c18-aq、3 μm）上进行，流速为 300 nl/min，梯度为 4% 至 40% ，b 相（0.1% fa 乙腈）溶液9 分钟，40% 至 90% b 相 5 分钟，90% b 相 5 分钟，以30000的分辨率、3
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106的agc目标和100 ms的最大注入时间执行全扫描；在hcd单元中，以30000的分辨率、1.0 m/z的隔离宽度、5
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105的agc目标、500 ms的最大注入时间和27%的标准化碰撞能量执行prm扫描，获得候选肽段；prm数据使用skyline daily（64位）19.1.9.350进行分析，从dda采集生成的数据集中获取参考ms/ms光谱的光谱库，根据保留时间、转变和ms/ms光谱手动检查峰，每个肽至少考虑5次转换，最终得到候选 的肽探针。8.一种如权利要求1所述的肽段探针用于检测环境中新型冠状病毒蛋白残留的检测方法，其特征在于，具体步骤为：（1）采集环境样品，将 500 μl 环境样品溶液加入 nh4hco
3 和 1,4-二硫苏糖醇至终浓度分别为 50 mm 和 5 mm，并加热至 95℃ ，5 分钟，冷却后，通过与 10 mm 碘化乙酰胺 (iaa) 在暗室中孵育30分钟来进行烷基化，然后，加入终浓度 5 mm dtt 并在室温下孵育15分钟，添加测序级修饰胰蛋白酶至终浓度为0.01 μg/μl，胰蛋白酶消化液在 37℃孵育过夜，消化后，溶液用三氟乙酸酸化并真空干燥，将干粉溶解在 250 μl 的 h2o、0.1% fa 中，然后与等体积的靶向病毒肽混合；（2）环境样本的检测：将13c标记的肽标准品，即序列为fasvyawnr和qiapgqtgk的新型冠状病毒s 蛋白检测探针，序列为npannaaivlqlpqgttlpk和gpeqtqgnfgdqelir的新型冠状病毒n蛋白检测探针加入环境样品中，目标肽鉴定的质量标准是标记和未标记肽之间的保留时间差异以及skyline中的点积分数，保留时间差异≤0.1 min，阳性结果的标准设置为点积分数值≥0.9，最终模拟病毒在消化后加入肽反应，从 0.1 fmol 到 100 fmol 柱上评估，在不同环境样品一式三份地分析样品，一次包含预柱与柱平衡、进样、肽段分离的运作在30分钟内完成，采集窗口为20分钟，用于快速检测和后续定量；（3）数据分析：将prm 结果导入 skyline 以进行靶向提取离子色谱图分析， 对于每个目标肽，根据碎片离子强度、信噪比的视觉测定以及天然和重标记肽信号的共洗脱，选择了五个碎片离子跃迁， 在prm 方法中，每个蛋白质的一个肽序列用于绝对定量，第二个用于确认身份和特异性。9.如权利要求1-7所述的肽段探针在识别、筛选、检测新型冠状病毒蛋白检测中的应用。

技术总结
本发明涉及一种新型冠状病毒（SRAS-Cov-2）检测的肽段探针及其制备方法和应用，通过从新型冠状病毒蛋白中筛选肽段探针，对新型冠状病毒蛋白进行质谱检测分析，得到序列为FASVYAWNR和QIAPGQTGK的新型冠状病毒S蛋白（刺突糖蛋白，Spike Protein）的检测探针、序列为NPANNAAIVLQLPQGTTLPK和GPEQTQGNFGDQELIR的新型冠状病毒N蛋白（核衣壳蛋白，Nucleocapsid Protein）的检测探针，并将其应用到检测环境中新型冠状病毒的方法中，解决了现有技术中检测新型冠状病毒的方法较少、RNA稳定性不如蛋白质的技术问题，从而提高了残留的检出效率。的检出效率。的检出效率。


技术研发人员：徐喜媛 杨德志 杨敬平 王慧 武敏 卜宝英 田红军 宣鹏飞 王宏燕 李文娟
受保护的技术使用者：内蒙古自治区国际蒙医医院
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2022/8/16