人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药制备技术领域，尤其涉及一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法。


背景技术：

2.人白细胞介素-5(interleukin-5，il-5)是1980年由takasu等人首先发现的一种分泌型细胞因子，它主要由激活的辅助性t细胞2(t helper 2cell，th2)、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生。人白细胞介素-5对嗜酸性粒细胞的生长、成熟、分化、活化、迁移起着最主要的作用，并可以通过抑制凋亡延长嗜酸性粒细胞的生存；在单独或与转化生长因子b联合作用的条件下，人白细胞介素-5可以通过体液免疫应答促进活化的b细胞产生iga。
3.现有的人白细胞介素-5重组蛋白主要通过昆虫杆状病毒系统与cho细胞表达系统生产获得，昆虫杆状病毒系统与cho细胞表达系统的表达周期长，从获得表达质粒到完成蛋白表达需要1个月甚至更长的时间，在上述真核系统中得到的人白细胞介素-5重组蛋白是完全糖基化的活性蛋白。但是研究表明，真核系统的糖基化过程对人白细胞介素-5重组蛋白拥有生物活性是非必要的，其生物活性主要是与其c端残基和二聚体结构有关，所以使用原核系统表达也能够得到具有完全生物活性的人白细胞介素-5重组蛋白。而在现有的使用原核系统进行人白细胞介素-5重组蛋白表达案例中，普遍通过3-4种凝胶层析柱纯化才能获得较高纯度的目的蛋白。
4.因此，有必要开发一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法，解决了现有技术中在原核系统中制备人白细胞介素-5重组蛋白需采用多步纯化才能得到较高纯度的目的蛋白的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
7.s1：将序列如seq id no:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；
8.s2：将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体；
9.s3：将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；
10.s4：将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；
11.s5：将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如seq id no:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素-5重组蛋
白。
12.本发明所述的人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法的有益效果在于：将序列如seq id no:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体，所述重组载体有利于实现人白细胞介素-5重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达；将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如seq id no:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素-5重组蛋白，该方法只需将所述蛋白溶解液经过一次柱纯化和复性后即可得到较高纯度的目的蛋白，本发明解决了现有技术中在原核系统中制备人白细胞介素-5重组蛋白需采用多步纯化才能得到较高纯度的目的蛋白的问题，同时本发明的制备方法具有步骤简单、成本低和回收率较高的优点。
13.可选的，所述大肠杆菌表达载体包括pet21a( )。
14.可选的，所述步骤s1中，将序列如seq id no:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体的步骤包括，使用限制性内切酶分别酶切所述核酸分子和所述pet21a( )以得到酶切核酸分子和酶切pet21a( )，将所述酶切核酸分子插入所述酶切pet21a( )中以得到所述重组载体。
15.可选的，所述限制性内切酶为bamhi限制性内切酶和xhoi限制性内切酶。
16.可选的，所述转化的方法为化学转化。
17.可选的，所述大肠杆菌表达系统包括大肠杆菌宿主菌，所述大肠杆菌宿主菌为bl21(de3)。
18.进一步可选的，所述变性裂解液包括0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素、浓度为4～6毫摩尔/升的咪唑、浓度为0.5～1.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和浓度为0.5～1.5毫摩尔/升的苯甲基磺酰氟，所述变性裂解液的ph值为7.5～8.5。其有益效果在于：所述变性裂解液能够将溶液中的所述目的蛋白尽量溶解并防止所述目的蛋白降解，从而提高所述目的蛋白的收率。
19.可选的，所述变性清洗的变性清洗液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素和浓度为30～100毫摩尔/升的咪唑，所述变性清洗液的ph值为7.5～8.5。其有益效果在于：所述变性清洗液能够尽量将其他蛋白清洗掉，柱上只保留所述目的蛋白。
20.可选的，所述变性洗脱的变性洗脱液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素和浓度为400～600毫摩尔/升的咪唑，所述变性洗脱液的ph值为7.5～8.5。其有益效果在于：所述变性洗脱液能够将所述目的蛋白完全洗脱。
21.可选的，所述柱纯化中使用的柱子是镍柱。
22.可选的，所述低温条件的温度为0～4℃。
23.可选的，所述复性液包括浓度为40～60毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.1～0.2摩尔/升的氯化钠、浓度为0.2～0.4摩尔/升的l-精氨酸、浓度为1.0毫摩尔/升/0.5毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽和浓度为0.5～1.5毫摩尔/升的二硫苏糖醇，所述复性液的ph值为8.5～9.5。其有益效果在于：所述复性液能够保证所述目的蛋
白完成复性并在复性过程中保证所述目的蛋白的稳定性。
24.可选的，所述透析的透析液包括浓度为40～60毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.1～0.2摩尔/升的氯化钠和浓度为0～0.2摩尔/升的l-精氨酸，所述透析液的ph值为8.5～9.5。其有益效果在于：所述透析液能够保证所述目的蛋白在透析过程中保证所述目的蛋白的稳定性，减少沉淀析出，提高所述目的蛋白的收率。
附图说明
25.图1为本发明实施例的目的蛋白的制备方法的流程图；
26.图2为本发明实施例的目的蛋白经纯化后通过sds-page电泳的电泳图照片。
具体实施方式
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
28.图1为本发明实施例的目的蛋白的制备方法的流程图。
29.本发明实施例中，提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法，参照图1，包括以下步骤：
30.s1：将序列如seq id no:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；
31.s2：将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体；
32.s3：将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；
33.s4：将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；
34.s5：将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如seq id no:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素-5重组蛋白。
35.具体的，将序列如seq id no:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体，所述重组载体有利于实现人白细胞介素-5重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达；将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如seq id no:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素-5重组蛋白，该方法只需将所述蛋白溶解液经过一次柱纯化和复性后即可得到较高纯度的目的蛋白，本发明解决了现有技术中
在原核系统中制备人白细胞介素-5重组蛋白需采用多步纯化才能得到较高纯度的目的蛋白的问题，同时本发明的制备方法具有步骤简单、成本低和回收率较高的优点。
36.本发明一些可能实施例中，所述大肠杆菌表达载体包括pet21a( )。
37.本发明又一些可能实施例中，所述步骤s1中，将序列如seq id no:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体的步骤包括，使用限制性内切酶分别酶切所述核酸分子和所述pet21a( )以得到酶切核酸分子和酶切pet21a( )，将所述酶切核酸分子插入所述酶切pet21a( )中以得到所述重组载体。
38.本发明一些可能实施例中，所述限制性内切酶为bamhi限制性内切酶和xhoi限制性内切酶。
39.本发明一些可能实施例中，所述转化的方法为化学转化。
40.本发明一些可能实施例中，所述大肠杆菌表达系统包括大肠杆菌宿主菌，所述大肠杆菌宿主菌为bl21(de3)。
41.本发明一些可能实施例中，所述变性裂解液包括0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素、浓度为4～6毫摩尔/升的咪唑、浓度为0.5～1.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和浓度为0.5～1.5毫摩尔/升的苯甲基磺酰氟，所述变性裂解液的ph值为7.5～8.5。所述变性裂解液能够将溶液中的所述目的蛋白尽量溶解并防止所述目的蛋白降解，从而提高所述目的蛋白的收率。
42.本发明一些具体实施例中，所述变性裂解液包括0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为8.0摩尔/升的尿素、浓度为5.0毫摩尔/升的咪唑、浓度为1.0％的聚乙二醇辛基苯基醚和浓度为1.0毫摩尔/升的苯甲基磺酰氟，所述变性裂解液的ph值为8.0。
43.本发明一些可能实施例中，所述变性清洗的变性清洗液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素和浓度为30～100毫摩尔/升的咪唑，所述变性清洗液的ph值为7.5～8.5。所述变性清洗液能够尽量将其他蛋白清洗掉，柱上只保留所述目的蛋白。
44.本发明一些具体实施例中，所述变性清洗的变性清洗液包括浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为8.0摩尔/升的尿素和浓度为30～100毫摩尔/升的咪唑，所述变性清洗液的ph值为8.0。
45.本发明一些可能实施例中，所述变性洗脱的变性洗脱液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素和浓度为400～600毫摩尔/升的咪唑，所述变性洗脱液的ph值为7.5～8.5。所述变性洗脱液能够将所述目的蛋白完全洗脱。
46.本发明一些具体实施例中，所述变性洗脱的变性洗脱液包括浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为8.0摩尔/升的尿素和浓度为400～600毫摩尔/升的咪唑，所述变性洗脱液的ph值为8.0。
47.本发明的一些可能实施例中，所述柱纯化中使用的柱子是镍柱。
48.本发明的一些可能施例中，所述低温条件的温度为0～4℃。
49.本发明的一些可能实施例中，所述复性液包括浓度为40～60毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.1～0.2摩尔/升的氯化钠、浓度为0.2～0.4摩尔/升的l-精氨酸(arg)、浓度为1.0毫摩尔/升/0.5毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽和浓度为0.5～1.5毫摩尔/升的二硫苏糖醇，所述复性液的ph值为8.5～9.5。所述复性液能够保证
所述目的蛋白完成复性并在复性过程中保证所述目的蛋白的稳定性。
50.本发明的一些可能实施例中，所述复性液包括浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.15摩尔/升的氯化钠、浓度为0.3摩尔/升的l-精氨酸(arg)、浓度为1.0毫摩尔/升/0.5毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽和浓度为1.0毫摩尔/升的二硫苏糖醇，所述复性液的ph值为9.0。
51.本发明的一些可能实施例中，所述透析的透析液包括浓度为40～60毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.1～0.2摩尔/升的氯化钠和浓度为0～0.2摩尔/升的l-精氨酸(arg)，所述透析液的ph值为8.5～9.5。所述透析液能够保证所述目的蛋白在透析过程中保证所述目的蛋白的稳定性，减少沉淀析出，提高所述目的蛋白的收率。
52.本发明的一些具体实施例中，所述透析的透析液包括浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.15摩尔/升的氯化钠和浓度为0.2摩尔/升的l-精氨酸(arg)，所述透析液的ph值为9.0。
53.本发明的另一些具体实施例中，所述透析的透析液包括浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.15摩尔/升的氯化钠和浓度为0.1摩尔/升的l-精氨酸(arg)，所述透析液的ph值为9.0。
54.本发明的又一些具体实施例中，所述透析的透析液包括浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.15摩尔/升的氯化钠和浓度为0摩尔/升的l-精氨酸(arg)，所述透析液的ph值为9.0。
55.实施例
56.本发明中的实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
57.大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；酵母粉(yeast extract powder)和胰蛋白胨(tryptone)均购自oxoid公司；氨苄青霉素购自天根生化科技(北京)有限公司；尿素、十二水磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)、磷酸二氢钾(kh2po4)、氯化钠和氯化钾购自国药集团化学试剂有限公司，咪唑购自sigma公司，还原型谷胱甘肽(gsh)、氧化型谷胱甘肽(gssg)、l-精氨酸(arg)、二硫苏糖醇(dtt)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
58.pierce
tm bca protein assay kit、fastdigest bamhi和fastdigest xhoi均购自thermo fisher公司；high affinity ni-nta resin购自金斯瑞生物科技股份有限公司、biofuraw
tm
快速蛋白染液购自上海天能科技有限公司；2
×
loading buffer、12％sds-page预制蛋白胶和mops电泳缓冲液购自南京艾思易生物科技有限公司。
59.实施例1序列如seq id no:1所示的核酸分子的设计与合成
60.以ncbi已公开的人白细胞介素-5的mrna序列(ncbincbi reference sequence登录号：nm_000879.3)作为优化对象，选取序列如seq id no:3所示的ile20-ser134，按照大肠杆菌表达系统密码子偏好性，选择使用频率最高的密码子，重新设计编码序列，获得所述序列如seq id no:1所示的核酸分子，并进行人工合成。
61.实施例2含有目的蛋白菌体的获得
62.使用bamhi限制性内切酶和xhoi限制性内切酶酶切所述核酸分子(seq id no:1)后，用takara fragment purification kit纯化回收；将回收的编码基因插入同样经bamhi
限制性内切酶和xhoi限制性内切酶酶切的所述pet21a( )中，构建所述重组载体；
63.取所述bl21(de3)感受态细胞于冰上缓慢融化，加入约40ng所述重组载体轻柔混合，继续冰浴20min；
64.将加入所述重组载体后的感受态细胞于42℃水浴锅中热激90s，迅速转移至冰上2min-5min；
65.在无菌工作台内向含所述重组载体的感受态中加入500ullb培养液(无抗性)，37℃条件下，低速培养0.5h；
66.在无菌工作台中取200μl培养液滴氨苄抗性的lb固体培养基上，使用一次性无菌涂布棒把培养液涂布均匀，倒置于37℃恒温孵箱中培养12-16小时，次日长出的菌落即为蛋白为人白细胞介素-5重组工程菌；
67.将长出的所述蛋白为人白细胞介素-5重组工程菌单克隆接种至氨苄抗性的lb培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，得到种子液；
68.以1:100的比例将种子液加入氨苄抗性2yt液体培养基进行扩大培养，37℃、220rpm条件下培养至od600≈1后，加入终浓度0.5mm的iptg进行诱导，37℃、220rpm条件下继续培养4h；
69.培养完毕后，经离心仪(所述离心仪的离心转速为12000rpm，所述离心仪的离心时间为5min)离心后，弃去上清，获得含有目的蛋白的所述菌体。
70.实施例3蛋白溶解液的获得
71.将100ml所述菌体和10ml所述变性裂解液混合，加入终浓度为1毫摩尔/升的苯甲基磺酰氟(pmsf)，充分混匀后置于冰水混合物中；使用超声破碎仪进行超声破碎，所述超声破碎仪的功率为300w，所述超声破碎仪的工作时间为5s后会暂停5s，依次循环，所述超声破碎仪的总工作时间为5min；超声后的菌液在离心仪(所述离心仪的转速为12000rpm，所述离心仪的离心时间为5min)离心后，保留上清液，使用0.45μm的聚偏二氟乙烯(pvdf)滤膜过滤，过滤液即为所述蛋白溶解液。
72.实施例4蛋白洗脱液的获得
73.取2ml镍柱填料装柱，使用10倍柱体积的变性结合液平衡镍柱，将过滤后的超声上清缓慢上柱，收集柱后液；分别使用5倍柱体积的所述变性清洗液和2倍柱体积的所述变性洗脱液进行洗脱，收集清洗液和洗脱液，洗脱液中即为纯化后的所述蛋白洗脱液。
74.实施例5目的蛋白的获得
75.采用稀释复性的方法，按照1:50稀释比例，将所述蛋白洗脱液逐滴缓慢滴入含有浓度为0.3摩尔/升的l-精氨酸(arg)的所述复性液中，低温持续搅拌36h；使用3kd超滤管对充分复性后的所述蛋白洗脱液进行浓缩以得到蛋白复性浓缩液，所述离心仪的温度为4℃，所述离心仪的离心转速为5000g；使用透析方法对所述蛋白复性浓缩液分别在含有浓度为0.2摩尔/升的l-精氨酸(arg)透析液、含有浓度为0.1摩尔/升的l-精氨酸(arg)透析液、含有浓度为0摩尔/升的l-精氨酸(arg)透析液中进行梯度置换，最终获得所述目的蛋白。
76.实施例6目的蛋白的sds-page和目的蛋白的浓度测定
77.分别取20μl上述提到的所述超声上清、所述柱后液、所述清洗液、所述蛋白洗脱液，与20μl 2
×
上样缓冲液(loading buffer)混匀，于金属浴中100℃煮沸10min；经离心仪(所述离心仪的离心转速为10000rpm，所述离心仪的离心时间为5min)离心后，取10μl上清
用12％ace梯度预制胶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，120v运行1h。
78.图2为本发明实施例的人白细胞介素-5重组蛋白纯化后通过sds-page电泳的电泳图照片。
79.结果见图2，其中，泳道1为纯化前样品，泳道2为柱后收集液，泳道3为洗涤收集液，泳道4为洗脱收集液，泳道5为蛋白marker。
80.从图2中可以看出，纯化的表达产物在13kda处有明显的条带，与预计的人白细胞介素-5单体分子量大小(13kda)相符，所述目的蛋白的纯度》95％。
81.将复性浓缩后的人白细胞介素-5采用thermo pierce
tm bca protein assay kit测定纯化后蛋白的浓度，为0.176mg/ml，100ml细胞表达量可获得近0.704mg较高纯度的所述目的蛋白。
82.实施例7目的蛋白的活性分析
83.取复性浓缩后的所述目的蛋白使用赛基生物免疫荧光法细胞因子联合检测试剂盒(注册证编号：赣械注准20192400359)进行活性检测。
84.将纯化后的所述目的蛋白采用细胞因子联合检测试剂盒中的标准品稀释液分别稀释至100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml后，使用流式荧光法进行活性检测。结果显示，所述目的蛋白稀释至1ng/ml时荧光值为183737，标准品1.25ng/ml时的荧光值为206386，证明本发明得到的所述目的蛋白的活性和人白细胞介素-5蛋白标准品的活性相当。
85.虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。