一种利用β-谷甾醇调节牛乳腺合成乳蛋白和乳脂的方法与流程

一种利用
β
‑
谷甾醇调节牛乳腺合成乳蛋白和乳脂的方法
技术领域
1.本发明涉及奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白和乳脂合成的技术领域，具体是一种利用β
‑
谷甾醇调节牛乳腺合成乳蛋白和乳脂的方法。


背景技术：

2.奶牛是我国畜牧养殖业中重要的经济动物之一，虽然我国奶业日渐壮大，各方面均已达到国际标准，但是相较奶业发达的国家来说，还是有提升空间。β
‑
谷甾醇的多重药理作用，也使其作为一种新型绿色添加剂被广泛研究，我国农业部于2008年将植物甾醇列为“新型功能性饲料添加剂”允许其添加在家禽和生长育肥猪的养殖中，但是在奶牛养殖中作为饲料添加剂使用还未被允许。β
‑
谷甾醇作为植物甾醇的一种，已被允许添加在生长育肥猪以及家禽的养殖中，然而，单一性成分的β
‑
谷甾醇在奶牛养殖方面的应用鲜有报道。
3.现有的奶牛养殖过程中，还无法判断不同浓度的β
‑
谷甾醇添加到奶牛乳腺上皮细胞对乳合成的影响效果如何，因而不利于相关工作人员根据需要，将β
‑
谷甾醇作为饲料添加剂进行使用，从而降低了牛奶的产量和品质，因此，针对以上现状，迫切需要开发一种利用β
‑
谷甾醇调节牛乳腺合成乳蛋白和乳脂的方法，以克服当前实际应用中的不足。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供β
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谷甾醇在促进奶牛泌乳中的应用效果，揭示其增强奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能的机制，使β
‑
谷甾醇可以作为新型饲料添加剂应用于奶牛或奶山羊的泌乳生产中。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用β
‑
谷甾醇调节牛乳腺合成乳蛋白和乳脂的方法，包括以下步骤：步骤1：将mac
‑
t细胞接种在含生长培养基的培养皿中，于37℃细胞培养箱中培养；步骤2：将mac
‑
t细胞进行分化诱导三天，同时加入不同浓度β
‑
谷甾醇，三天后提取收集rna及蛋白；步骤3：通过qpcr、western blot方法检测β
‑
谷甾醇对乳腺上皮细胞β
‑
酪蛋白、信号通路pi3k/akt/mtor、jak2
‑
stat5以及乳脂合成相关酶的调控作用；步骤4：通过qpcr、western blot方法初步探讨β
‑
谷甾醇对乳腺上皮细胞泌乳功能的调控机理。
6.综上所述，本发明具有以下有益效果：通过利用实时荧光定量检测乳脂乳蛋白合成相关基因的表达水平以及利用蛋白质印迹检测相关蛋白，发现0.1
‑
10μm浓度的β
‑
谷甾醇促进奶牛乳腺上皮细胞中β
‑
酪蛋白的合成，增强奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能，且β
‑
谷甾醇通过调控gh
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igf1轴、hif
‑
1α激活pi3k/akt/mtor、jak2
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stat5以及促进相关细胞因子表达，改善奶牛乳腺的泌乳机能，增加经济效益，因而证实了低浓度的β
‑
谷甾醇可以促进奶牛乳腺上皮细胞中β
‑
酪蛋白的合成和改善乳脂合成基因和蛋白表达，具有增强奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能的作用，另一方面，
高浓度（30μm以上）的β
‑
谷甾醇可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的乳合成，并且促进脂肪合成基因表达，抑制乳合成，从而可以揭示β
‑
谷甾醇可以作为饲料添加剂或饲料原料中含有成分可以应用于奶牛饲养过程，在牛泌乳盛期促进乳的合成，而在泌乳末期可以抑制乳合成，促进快速干奶，有利于提高牛奶的产量和品质，为相关工作人员提供了便利，值得推广。
附图说明
7.图1为本发明实施例中不同浓度β
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谷甾醇对牛乳腺上皮细胞β
‑
酪蛋白表达的影响示意图。
8.图2为本发明实施例中不同浓度β
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谷甾醇对牛乳腺上皮细胞细胞内pi3k/akt1/mtor、jak2
‑
stat5信号通路的影响示意图。
9.图3为本发明实施例中不同浓度β
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谷甾醇对牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关因子的影响示意图。
10.图4为本发明实施例中不同浓度β
‑
谷甾醇对牛乳腺上皮细胞gh
‑
igf1轴表达的影响示意图。
11.图5为本发明实施例中不同浓度β
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谷甾醇对牛乳腺上皮细胞hif
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1α及下游因子epo表达的影响示意图。
12.图6为本发明实施例中不同浓度β
‑
谷甾醇对牛乳腺上皮细胞中socs家族表达影响示意图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
15.请参阅图1
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6，本发明实施例提供的一种利用β
‑
谷甾醇调节牛乳腺合成乳蛋白和乳脂的方法，包括以下步骤：步骤1：将mac
‑
t细胞接种在含生长培养基的培养皿中，于37℃细胞培养箱中培养；步骤2：将mac
‑
t细胞进行分化诱导三天，同时加入不同浓度β
‑
谷甾醇，三天后提取收集rna及蛋白；步骤3：通过qpcr、western blot方法检测β
‑
谷甾醇对乳腺上皮细胞β
‑
酪蛋白、信号通路pi3k/akt/mtor、jak2
‑
stat5以及乳脂合成相关酶的调控作用；步骤4：通过qpcr、western blot方法初步探讨β
‑
谷甾醇对乳腺上皮细胞泌乳功能的调控机理。
16.通过利用实时荧光定量检测乳脂乳蛋白合成相关基因的表达水平以及利用蛋白质印迹检测相关蛋白，发现0.1
‑
1μm浓度的β
‑
谷甾醇促进奶牛乳腺上皮细胞中β
‑
酪蛋白的合成，增强奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能，低浓度的β
‑
谷甾醇可以促进奶牛乳腺上皮细胞中β
‑
酪蛋白的合成和改善乳脂合成基因和蛋白表达，高浓度（30μm以上）的β
‑
谷甾醇可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的乳合成，从而可以揭示β
‑
谷甾醇可以作为饲料添加剂或饲料原料中
含有成分可以应用于奶牛饲养过程，在牛泌乳盛期促进乳的合成，而在泌乳末期可以抑制乳合成，促进快速干奶，有利于提高牛奶的产量和品质，为相关工作人员提供了便利，值得推广。
17.在本发明的一个实施例中，在步骤1中，奶牛乳腺上皮细胞的培养具体步骤为：将mac
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t细胞置于生长培养基中进行培养，生长培养基为dmem，10�s，5μg/ml胰岛素，1μg/ml氢化可的松，1%青霉素
‑
链霉素，传代2
‑
3次后，将mac
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t细胞接种于含有2ml分化培养基的六孔板中进行分化诱导3天，分化培养基为dmem，10�s，5μg/ml胰岛素，1μg/ml 氢化可的松，5μg/ml催乳素，1%青霉素
‑
链霉素，同时加入不同浓度β
‑
谷甾醇进行培养，β
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谷甾醇的浓度分别为0.01μm、0.1μm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm。
18.在牛乳腺上皮细胞（mac
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t）培养的过程中，生长期乳腺上皮细胞接种至六孔板，每孔采用生长培养液静置培养直至细胞长至70%左右，然后进入下一工序，其中，1%青霉素
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链霉素由100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素配比制成。
19.在本发明的一个实施例中，请参阅图1，在步骤2中，所述含有分化培养基的六孔板，进行如下分组处理：处理组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含不同浓度β
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谷甾醇的分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养3天；对照组：吸弃培养液, 用pbs清洗后加入分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养3天；将各组培养3d后收集奶牛乳腺上皮细胞，提取rna以及蛋白，利用qpcr、western blot检测β
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酪蛋白的表达。
20.处理组和对照组所使用的培养液每天都需要更换，通过利用qpcr、western blot检测β
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酪蛋白的表达，如图1的a所示，结果表明与对照组相比，添加β
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谷甾醇（0.01μm，0.1μm，1μm，5μm，10μm，20μm）的处理组均显著促进β
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酪蛋白mrna的表达（p<0.05），且小浓度β
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谷甾醇（0.1μm，1μm，5μm，10μm）处理组的β
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酪蛋白mrna的表达极其显著提高（p<0.01）。我们选取了0.1μm、1μm、10μm、30μmβ
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谷甾醇药物组与对照组进行β
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酪蛋白蛋白表达上的比对，结果如图1的b所示，与上述所说基因表达情况相一致。结果表明0.1μm、1μm、10μmβ
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谷甾醇可提高牛乳腺上皮细胞（mac
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t）β
‑
酪蛋白的表达。
21.在本发明的一个实施例中，请参阅图2，在步骤3中，β
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谷甾醇对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关通路的影响包括：mac
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t细胞泌乳信号通路jak2
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stat5的qpcr及western blot检测和mac
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t细胞泌乳信号通路pi3k/akt1/mtor的qpcr及western blot检测的方法均为将细胞接种于六孔板，分为5组，分别为对照组、β
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谷甾醇药物组，处理3d，β
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谷甾醇药物组的浓度分别选取0.1μm、1μm、10μm、30μm。
22.qpcr检测5个不同组别中jak2、elf5、stat5基因表达的影响，结果为附图2的a所示，1μmβ
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谷甾醇能极显著提高ak2、elf5、stat5基因表达（p<0.01）；western blot检测5个不同组别中磷酸化的stat5蛋白表达的影响，结果为附图2的c所示，蛋白水平与基因表达相一致；qpcr检测5个不同组别中pi3k/akt1/mtor通路相关基因表达的影响，结果为附图2的b所示，1μmβ
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谷甾醇能显著提高mtor基因表达（p<0.05）；极显著提高s6k1基因表达（p<0.01）。western blot检测5个不同组别中mtor、p
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mtor、s6k1、p
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s6k1蛋白表达的影响，结果
为附图2的d所示，1μmβ
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谷甾醇显著提高mtor、p
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mtor以及p
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s6k1蛋白表达（p<0.05）；这些发现表明，β
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谷甾醇通过激活jak2
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stat5、mtor信号通路，影响磷酸化stat5
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β、p
‑
mtor、p
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s6k1水平，并最终调控β
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酪蛋白表达。
23.在本发明的一个实施例中，请参阅图3，在步骤4中，β
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谷甾醇对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关细胞因子的影响包括：mac
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t细胞乳脂合成相关细胞因子的qpcr检测和western blot检测的方法均为将细胞接种于六孔板，分为5组，分别为对照组、β
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谷甾醇药物组，处理3d，β
‑
谷甾醇药物组的浓度分别选取0.1μm、1μm、10μm、30μm。
24.qpcr检测5个不同组别中脂肪酸摄取基因（lpl）、活化和转运基因（fasn、acaca、scd）表达的影响；检测其对脂肪酸网络调控基因（srebp1、pparα等）表达的影响，结果为附图3的a所示，10μmβ
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谷甾醇显著提高acc、psma5基因表达水平（p<0.05）；极显著提高scd、srebp1、lpl基因表达水平（p<0.01）；western blot检测5个不同组别中scd、psma5、srebp1、pparα的蛋白水平影响，结果为附图3的b所示，10μmβ
‑
谷甾醇显著提高psma5蛋白水平（p<0.05）；极显著提高scd、pparα蛋白水平（p<0.01）；这些发现表明，β
‑
谷甾醇影响乳脂合成相关酶以及网络调控因子，最终调控乳腺上皮细胞泌乳能力。
25.在本发明的一个实施例中，请参阅图4，在步骤4中，β
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谷甾醇对乳蛋白相关基因表达的影响包括：β
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谷甾醇调控gh
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igf1轴激活jak2
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stat5从而影响乳蛋白相关基因表达，检测方法为将细胞接种于六孔板，分为5组，分别为对照组、β
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谷甾醇药物组，处理3d，β
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谷甾醇药物组的浓度分别选取0.1μm、1μm、10μm、30μm。
26.通过qpcr检测5个不同组别中gh
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igf1轴相关基因表达的影响，结果为附图4所示，1μmβ
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谷甾醇极显著提高gh、ghr、igf1的基因表达（p<0.01）；显著降低igfbp1的基因表达（p<0.05）。
27.在本发明的一个实施例中，请参阅图5，在步骤4中，β
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谷甾醇对乳脂肪合成相关因子表达的影响包括：β
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谷甾醇作用于hif
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1α、上调其下游靶基因epo表达，继而促进mtor信号通路表达影响乳脂肪合成相关因子表达，检测方法为将细胞接种于六孔板，分为5组，分别为对照组、β
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谷甾醇药物组，处理3d，β
‑
谷甾醇药物组的浓度分别选取0.1μm、1μm、10μm、30μm。
28.通过qpcr检测5个不同组别中hif
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1α相关基因表达的影响，结果为附图5的a所示，10μmβ
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谷甾醇极显著提高hif
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1α、epo的基因表达（p<0.01）；显著提高epor的基因表达（p<0.05）。继而通过western blot检测hif
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1α的蛋白水平表达变化，结果为附图5的b所示，10μmβ
‑
谷甾醇极显著提高hif
‑
1α的蛋白表达（p<0.01）。
29.在本发明的一个实施例中，请参阅图6，在步骤4中，β
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谷甾醇对乳脂乳蛋白合成的影响包括：β
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谷甾醇通过抑制socs从而调控细胞因子影响乳脂乳蛋白合成，检测方法为将细胞接种于六孔板，分为5组，分别为对照组、β
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谷甾醇药物组，处理3d，β
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谷甾醇药物组的浓度分别选取0.1μm、1μm、10μm、30μm。
30.通过qpcr检测5个不同组别中socs2、socs3相关基因表达的影响，结果为附图6的a所示，1μmβ
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谷甾醇显著降低socs2、socs3的基因表达（p<0.05）；继而通过western blot检
测socs2、socs3的蛋白水平表达变化，结果为附图6的b所示，1μmβ
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谷甾醇极显著降低socs2蛋白表达（p<0.01），10μmβ
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谷甾醇显著抑制socs3的蛋白表达（p<0.05）。
31.综上所述，本发明将不同浓度的β
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谷甾醇添加到奶牛乳腺上皮细胞（mac
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t）上，并在培养基内进行体外细胞培养，通过qpcr、western blot方法的检测，可以初步得到β
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谷甾醇对乳腺上皮细胞泌乳功能的调控机理，添加0.1
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10μm范围的β
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谷甾醇可以显著提高乳腺细胞乳蛋白的生产能力，提高乳脂合成，改善乳脂构成，高浓度（30μm以上）的β
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谷甾醇可以抑制乳腺细胞中乳蛋白和乳脂合成，抑制乳的合成效果，具有快速干奶效果，且β
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谷甾醇可以抑制socs2和socs3的表达，促进乳蛋白合成，并可促进hif1α的表达，激活hif通路改善乳脂合成。
32.需要说明的是，以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。