超声波在诱导毛囊细胞和毛发生长中的应用的制作方法

1.本发明涉及生发技术领域，具体涉及超声波通过细胞增殖和抗凋亡作用诱导毛囊细胞和毛发生长中的应用。


背景技术：

2.雄激素性脱发或男性型脱发是一种由双氢睾酮(dht)介导的脱发疾病，双氢睾酮是一种活性类型的睾酮，可诱导毛囊(hf)收缩并将终毛转化为毳毛。如果不进行治疗，患者会逐渐脱发。男性型脱发是脱发的最常见原因，其发病率随着年龄的增长而增加。在80岁以上人群中，约73％的男性和约57％的女性患有男性型脱发，约58％的50岁以上男性患有男性型脱发。男性型脱发会对男性和女性造成负面的心理影响，包括强迫性的自我怀疑、与衰老相关的焦虑和嗜睡。此外，这些影响在女性中更为明显。
3.目前，米诺地尔(mnx)和非那雄胺是唯一获得美国食品和药物管理局(fda)批准的治疗脱发的显著疗效药物。然而，据报道米诺地尔会引起瘙痒和接触性皮炎；非那雄胺会在少数患者中引起性功能障碍。由于担心口服给药的全身副作用，例如头痛、头晕、皮疹和性功能障碍，患者也不愿使用非那雄胺；对严重秃发人群来说，毛发移植术是唯一真正意义上的长策。过程大致为从头发浓密的后脑勺截取移植的头发或摘取单个毛囊，移植到秃发的区域。大部分患者需要一到两次治疗。治疗费用会根据移植的方法和移植毛囊数量的差别而不同。花费的时间多，也更昂贵。或者，低能量激光疗法(lllt)是一种经fda批准的脱发治疗，具有显著的脱发抑制功效。然而，之前的研究已经描述了这种治疗的局限性。因此，与口服脱发药物相比，lllt的成功率较低。因此，研究人员正专注于寻找更有效且副作用更少的治疗方法。
4.超声波在医疗和工业领域以各种方式应用。在医学上，超声波被用作体内对比诊断技术以及提高药物输送效率(超声导入)、骨折治疗和肿瘤治疗。一般来说，当超声波作用于人体时，会使用凝胶等介质来提高其传输效率。然而，已有的研究证明，通过空气传播给受试者的超声波的频率刚好高于可听声音的频率(500-4000hz)，可能会改变受试者的脑电波和荷尔蒙水平。此外，这些影响不是通过耳朵发生的，而是只有超声波传递到皮肤时才会发生。另一项研究表明，当超声波直接到达伤口区域时，小鼠的伤口恢复速度会加快。这些数据表明，超声波会影响皮肤表面，进而影响整个身体。
5.在本发明中，我们研究超声波对人真皮乳头细胞(hdpcs)的影响，并研究了超声波是否可以抑制在hdpcs中双氢睾酮产生的脱发信号。通过观察用超声波处理的hf器官培养物中毛发生长速率的变化来评估超声波治疗人类头皮的功效。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供超声波在诱导毛囊细胞和毛发生长中的应用，30khz的超声波显著诱导人毛乳头细胞(hdpc)和外根鞘角质形成细胞的增殖和抗凋亡作用。
7.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供超声波在诱导毛囊细胞和毛发生长中的应用，其特征在于，利用30khz超声波抑制双氢睾酮诱导的脱发诱导因子dkk1和tgf-β1的分泌水平，诱导人毛乳头细胞hdpc和外根鞘角质形成细胞的增殖和抗凋亡作用进行脱发治疗。
9.本发明的有益效果在于：本发明的结果表明，通过用双氢睾酮处理人毛乳头细胞来诱导脱发信号，然后观察超声波是否抑制了由双氢睾酮诱导的脱发诱导因子dkk1和tgf-β1的分泌水平。结果表明，超声波可以显著抑制人外根鞘(ors)角质形成细胞中dkk1和tgf-β1诱导的细胞凋亡，这通过细胞活力测定、tunel测定和凋亡相关基因bcl-2和bax的mrna表达水平来确定。此外，结果表明，用超声波直接治疗人类毛囊会加速头发的生长速度，ki-67(基质细胞的增殖标志物)的蛋白质表达在毛球中也显著增加。
10.基于这些结果，我们可以得出结论，30khz的超声波对治疗脱发有效，具有治疗脱发的潜力，可用于开发新的脱发治疗方法。
具体实施方式
11.下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
12.实验内容：
13.1.超声波照射细胞：
14.使用函数发生器和放大器组生成电正弦波。输出功率和频率分别为24vrms和30khz。使用压电扬声器产生超声波。在1厘米距离处产生的声压级为144db。细胞在37℃的加湿培养箱中暴露于超声波中，在95％o2和5％co2的加湿培养箱中，在补充有l-谷氨酰胺和丙酮酸钠培养基的无血清低葡萄糖dmem中保持4小时。从培养基上方超声波的声音照射细胞。
15.2.人真皮乳头细胞(hdpcs)和人外根鞘(ors)角质形成细胞的分离和培养：
16.从三名男性患者(年龄分别为32、34和37岁)的非秃顶枕头皮区域获得了头发活检标本毛发移植过程中的雄激素性脱发。
17.如前所述分离和培养毛囊(hf)，从表皮和真皮解剖包括下部毛囊的头皮皮肤的皮下脂肪。然后使用带镊子的双目显微镜分离毛囊，并在24孔板中保持6个毛囊单位/孔，并在37℃的5％加湿培养箱中在williamse培养基中生长二氧化碳。不迟于第3代培养的hdpc和ors角质形成细胞用于随后的实验，并在5％co2的加湿培养箱中保持在37℃。hdpcs在补充有l-谷氨酰胺和丙酮酸钠的低葡萄糖dmem中生长，补充有10％fbs。ors角质形成细胞在含有60μm钙的epilife培养基中生长，并补充有epilife定义的生长补充剂。
18.3.hdpc活力测定：
19.使用cellcountingkit-8(cck-8)测定法确定细胞活力。将hdpc以1.5x105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，并在5％co2的加湿培养箱中于37℃下培养24小时。随后，在37℃的加湿培养箱中，在5％co2的加湿培养箱中，用20和30khz的超声波频率在无fbs培养基中处理细胞4小时。48小时后，使用cck-8测定法估细胞活力，并在添加cck-8溶液并将细胞在37
°
下孵育后使用酶标仪分析450nm处的吸光度c在5％co2的加湿培养箱中培养2小时。测定
细胞存活率并表示为对照值(未处理细胞)的百分比。
20.4.逆转录定量pcr(rt-qpcr)：
21.使用rneasyminikit分离总rna，使用iii逆转录酶将2μgrna逆转录成互补dna。使用abi7500ht快速系统和taqman
tm
universalpcrmastermix进行qpcr，以确定以下基因的表达：bcl-2(测定id：hs00608023_m1)、bax(hs00180269_m1)、vegfa(hs00900055_m1)和核糖体蛋白侧柄亚基p0(rplp0、hs00420895_gh)。使用以下热循环条件：95℃初始变性5分钟；然后在95℃下进行40个循环扩增15秒，在65℃下退火30秒，然后在72℃下延伸30秒。使用2-δδcq方法量化mrna表达水平。rplp0被用作管家基因以标准化数据。
22.5.分泌因子分析：
23.使用商业elisa试剂盒对vegf、dkk-1和tgf-β1的分泌进行量化。为了评估用超声波处理的人真皮乳头细胞(hdpcs)分泌的因子，将hdpcs(第3代)以1.5x105个细胞/孔的密度在37℃的5％co2加湿培养箱中过夜铺板到6孔板中。将细胞用pbs洗涤两次，然后添加到不含fbs的培养基中。对于vegf的定量，然后将细胞在37℃下在5％co2的加湿培养箱中用30khz的超声波处理4小时后孵育48小时。为了量化dkk-1和tgf-β1的参与，在超声波处理后，用100nmdht处理细胞。随后分析培养基中vegf、dkk-1和tgf-β1的浓度。简而言之，用pbs中的1％bsa封闭96孔微孔板(包括在试剂盒中)包被的捕获抗体，并在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤3次后，加入从用超声波处理的细胞或未处理的对照获得的条件培养基，并在室温下进一步培养细胞2小时。然后将板用洗涤缓冲液洗涤3次并加入检测抗体并将细胞在室温下孵育2小时。洗涤3次后，加入链霉亲和素-hrp溶液，样品在室温下孵育20分钟。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，然后加入底物溶液，并将板在室温下孵育20分钟。添加终止溶液以终止酶反应。使用synergy
tm
2elisa读数器在450nm处评估光密度。
24.6.抗凋亡作用测定：
25.dkk-1(分泌型糖蛋白)和tgf-β1(转化生长因子β1蛋白))，称为脱发诱导剂，已知可诱导人外根鞘(ors)角质形成细胞凋亡并抑制细胞活力。为了分析超声的抗细胞凋亡作用，将ors角质形成细胞以3x105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，并在37℃的5％co2的加湿培养箱中培养24小时。在处理之前，将培养基更换为不含edgs的培养基。随后将细胞在37℃下在5％co2的加湿培养箱中用超声波处理4小时后，加入50ng/mldkk-1和50ng/mltgf-β148小时。使用cck-8测定法确定任何抗细胞凋亡作用的功效。在5％co2的加湿培养箱中用cck-8溶液在37℃下处理细胞2小时后，使用读板器评估450nm处的吸光度。使用光密度读数确定细胞存活率，并表示为对照值(未处理的细胞)的百分比。
26.7.tunel检测：
27.根据制造商的方案使用tunel试剂盒(原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素；)来评估凋亡细胞。简而言之，将2x104个细胞/200μl的人外根鞘(ors)角质形成细胞接种到8室载玻片中。粘附后，将细胞培养基更换为不含生长补充剂的培养基。随后，将细胞在37℃的加湿培养箱中用5％co2处理4小时，然后在37℃的加湿培养箱中用50ng/mldkk-1和50ng/mltgf-β1处理细胞5％co224小时。然后将这些细胞在室温下固定在4％多聚甲醛中10分钟。用pbs洗涤后，将细胞与0.1％柠檬酸钠中的0.1％tritonx-100在室温下孵育1小时。用pbs洗涤后，用tunel试剂处理细胞，并在37℃的加湿培养箱中避光孵育1小时。用pbs洗涤后，将细胞
用dapi染色并使用fluoroshield与dapi固定，通过添加3-4滴将其应用于溶液，然后盖上盖子安装玻璃并将样品在室温下放置5分钟。dapi染色用于显示细胞核。使用荧光显微镜(放大倍数，x100)捕获代表性图像。
28.8.毛囊(hf)器官培养和头发伸长评估：
29.生长期毛囊(hf)是从人类头皮皮肤标本中获得的。将24孔板中的每孔6个毛囊在37℃的加湿培养箱中培养，加湿培养箱中含有5％co2，500μlwilliamse培养基添加10μg/ml胰岛素，10ng/ml氢化可的松、2mml-谷氨酰胺、0.1％菌带、10μg/ml链霉素和100u/ml青霉素。每个实验组包含至少30个来自三个不同患者的生长期hf。毛囊在37℃下在5％co2的加湿培养箱中用30khz超声波处理4小时，每天一次。培养培养基每两天更新一次。使用立体显微镜在培养2天和5天时直接分析hf伸长率。
30.9.ki-67免疫组化：
31.为了确认超声治疗对头发的影响，将毛囊在37℃的5％co2的加湿培养箱中用30khz超声波处理4小时，每天一次，持续3天。3天后，将毛囊放入最佳切割温度(oct)冷冻化合物中，并使用低温恒温器制备冷冻的6μm切片。低温恒温器的温度保持在-15到-23℃之间。然后将毛囊冷冻切片并在室温下在10％多聚甲醛中固定10分钟。使用含0.1％tween-20(tbst)的tbs中的4％bsa在室温下封闭样品30分钟，然后用tbst洗涤。然后将样品与ki-67单克隆抗体在4℃下孵育过夜。洗涤后，加入alexafluor
tm
488抗大鼠二抗；并在室温下孵育1小时。随后将样品固定并用上述dapi复染。使用荧光显微镜(放大倍数，x100)对样品进行成像。
32.10.结果：
33.(1)超声波刺激人毛乳头细胞(hdpc)中的细胞增殖和毛发生长相关因子的表达；
34.为了确定超声波对hdpcs增殖的潜在影响，在用20和30khz超声波处理4小时后2天进行cck-8测定。结果表明，与未处理的对照(nt)相比，超声以频率依赖性方式显著增强了hdpc增殖。后续实验选择了30khz的频率，因为它使hdpc增殖超过20khz。为了确认超声波对hdpc增殖的影响，进行了rt-qpcr和elisa检测。vegf是一种典型的促进毛发生长的生长因子。结果表明，与对照组相比，超声波处理显著增加了hdpc中vegf的mrna表达水平和浓度。
35.(2)超声波消除了双氢睾酮(dht)诱导的人毛乳头细胞(hdpc)中退行性相关因子的分泌；
36.为了研究超声波频率对抑制hdpc中退行性相关分泌因子(如dkk-1和tgf-β1)的潜在作用，在存在或不存在dht和30khz超声波的情况下治疗后2天进行elisa测定。结果表明，与对照组相比，dht显著增加了hdpc中退行期相关分泌因子dkk-1和tgfβ1的浓度，而超声波显著降低了dkk-1和tgfβ1的浓度。这些结果表明，与毛发生长增加相反，在dht处理的hdpc中用超声波处理后，与退行性相关的分泌因子的抑制可能是导致脱发增加的机制。
37.(3)超声波抑制dkk-1和tgf-β1介导的细胞凋亡并调节人外根鞘(ors)角质形成细胞凋亡相关基因的表达；
38.为了研究超声波对人外根鞘(ors)角质形成细胞凋亡抑制的潜在作用，在存在或不存在dkk-1、tgf-β1和超声波的情况下，在治疗后1天进行cck-8测定。使用的dkk-1和tgf-β1浓度在初步测试中确定。与未处理的nt组相比，用dkk-1(50ng/ml)和tgf-β1(50ng/ml)处理显著抑制ors角质形成细胞的活力。与nt和dkk1 tgfβ-1组相比，dkk-1和tgfβ-1对ors角
质形成细胞活力的细胞凋亡抑制作用被30khz超声波显著逆转。
39.为了证实超声波对ors角质形成细胞凋亡的抑制作用，进行了tunel测定。结果表明，与nt组相比，当ors角质形成细胞用dkk-1和tgfβ-1处理时，经历凋亡的tunel阳性细胞显著增加。与ntdkk1 tgfβ-1组相比，尽管用dkk-1和tgfβ1共同治疗，但tunel阳性细胞显著减少了30khz超声波。
40.为了进一步研究超声波对dkk-1和tgfβ-1的抗凋亡作用，通过rt-qpcr研究了凋亡相关基因mrna表达水平的变化。与dkk-1和tgf-β1相关的bcl-2和bax基因先前已被证明可在多种细胞类型中诱导细胞凋亡，包括毛囊细胞，因此被用于测量细胞凋亡。用30khz和/或dkk-1和tgfβ-1的组合处理ors角质形成细胞。在ors角质形成细胞中，与未治疗的nt组相比，dkk-1和tgfβ-1的联合治疗显著降低了抗凋亡因子bcl-2的mrna表达水平。此外，与ntdkk1 tgfβ-1组相比，30khz处理显著逆转了dkk-1和tgfβ-1诱导的bcl-2mrna表达抑制。与未处理的nt组相比，dkk-1和tgf-β1也显著诱导促凋亡因子bax的mrna表达。此外，尽管存在dkk-1和tgfβ-1，但与ntdkk1 tgfβ-1组相比，30khz的处理显著抑制了ors角质形成细胞中的baxmrna表达水平。因此，这些结果表明，超声波可以促进ors角质形成细胞的存活并增加bcl-2/bax的比率以抑制细胞死亡。
41.(4)超声波促进人毛囊(hf)器官培养中的hf伸长和毛基质角质形成细胞增殖
42.为了检查器官水平超声波对头发生长的影响，研究了整个人类头皮毛囊(hf)的离体培养物。米诺地尔(mnx)和载体分别作为阳性和阴性对照。观察到在5天时，用30khz超声波处理的hf与nthf相比显著更长，这与用mnx处理的hf的生长相似。
43.为了证实超声波在hf基质角质形成细胞中的细胞增殖促进作用，在人类hf每天暴露于30khz超声波4小时后进行ki-67的免疫荧光染色，持续3天。分析来自三个不同个体的hf切片的毛球中毛囊基质角质形成细胞的增殖。用dapi(蓝色荧光)对细胞核进行复染。对于定量分析，计算ki-67 细胞的数量并将其标准化为dapi染色细胞的数量。ki-67 信号在hdpc上方的矩阵上部特别强。培养3天后，大量nthf进入退行期，因此在此过程中失去增殖性滤泡基质角质形成细胞。然而，与nt相比，30khz听不见声音处理的细胞在hf中显示出显著增强的细胞增殖水平并维持生长期。
44.在本发明中，研究了超声波对人毛乳头细胞(hdpc)和毛囊(hf)毛发生长的影响，以及它是否可以在细胞水平上抑制双氢睾酮(dht)诱导的脱发。尽管dht的分子致病机制尚不清楚，但其在男性型秃发中的作用已得到充分证明。dht等循环雄激素通过毛细血管进入毛囊，与hdpc上的雄激素受体(ar)结合，随后激活靶基因，包括dkk-1和tgfβ1。
45.因此，在本发明中，通过用dht处理hdpc来诱导脱发信号，然后观察超声波是否抑制了由dht诱导的脱发诱导因子dkk1和tgf-β1的分泌水平。结果表明，30khz超声波可以显著抑制ors角质形成细胞中dkk1和tgf-β1诱导的细胞凋亡，这通过细胞活力测定、tunel测定和凋亡相关基因bcl-2和bax的mrna表达水平来确定。此外，结果表明，用超声波直接治疗人类毛囊会加速头发的生长速度，ki-67(基质细胞的增殖标志物)的蛋白质表达在毛囊中也显著增加。
46.总之，本发明表明，超声波促进了毛囊细胞的增殖，并且这种作用抑制了双氢睾酮诱导的脱发信号。本发明为可以替代或补充现有脱发治疗的新治疗方法提供了基础。
47.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精
神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。