一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素(aflatoxins，afs)是由黄曲霉(aspergillus flavus)、集峰曲霉(aspergillus nominus)和寄生曲霉(aspergillus paraciticus)等产生的一类真菌毒素，主要污染一些农作物，如花生、玉米、小麦等，给世界各国的农业生产造成了很大的经济损失。
3.afb1可通过物理、化学以及生物法降解，但物理方法耗时，且无法保障afb1被完全清除；化学物质的使用虽然能显著降低afb1浓度，但同时导致营养物质的损失，降低食品或饲料质量；直接使用微生物体降解afb1，也会损害产品的感官特性，且降解过程的安全性无法保证。
4.生物法脱毒作为脱毒方式之一，因其绿色、环保、安全等特点，深受人们的青睐。其中，酶具有底物特异性、催化效率高、环境友好的特点，被广泛应用于食品和饲料工业，所以最安全有效的方法是选用特定的酶来降解afb1。
5.漆酶(ρ-二元酚氧化酶，ec 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，具有宽泛的底物谱。2009年，alberts等人第一次发现真菌漆酶可用于黄曲霉毒素的脱毒。但目前关于提高漆酶脱毒afb1效率的定向进化方面的研究较少，因此，对提高漆酶脱毒afb1效率的定向进化研究具有重大研究意义和实际应用价值。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用，其利用定点饱和突变技术，实现对目标漆酶的定向改造，获得的突变漆酶可提高漆酶脱毒afb1效率，在生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物中黄曲霉毒素的同步脱毒中具有很好的实际应用价值。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
8.本发明第一方面提出一种突变漆酶，所述漆酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述seq id no:1中第235位氨基酸由ser变为pro得到突变漆酶，所述突变漆酶的氨基酸序列如seq id no:3所示。
9.有益效果：本发明利用定点饱和突变技术，实现对目标漆酶的定向改造，获得了一种对afb1脱毒效率提高的突变漆酶，其脱毒效率提升至1.34倍，可用于黄曲霉毒素脱毒。
10.优先的，所述漆酶氨基酸编码的核苷酸序列如seq id no:2所示；所述突变漆酶氨基酸编码的核苷酸序列如seq id no:4所示。
11.本发明第二方面提出一种含有上述突变漆酶基因的重组表达载体。
12.优先的，所述重组表达载体为将权利要求3所述突变漆酶基因连接至ppic9k上得到的ppic9k-mlcc5表达载体。
13.本发明第三方面提出一种含有上述重组表达载体的重组菌株。
14.优先的，所述重组菌株为将权利要求3所述重组表达载体转入毕赤酵母中得到的p.pastoris-ppic9k-mlcc5。
15.本发明第四方面提出一种获得上述重组菌株的方法，包括以下步骤：
16.(1)提取漆酶基因模板：对escherichia coli trans1 t1-ppic9k-lcc5进行培养、收集，提取ppic9k-lcc5质粒；
17.(2)克隆突变基因：以所述ppic9k-lcc5质粒为模板，对分子动力学模拟及序列保守性分析获得的潜在有益突变位点分别进行饱和突变，并采用pcr扩增获得突变mlcc5基因；
18.(3)构建重组表达载体：通过酶切连接法，将所述突变mlcc5基因插入到ppic9k启动子aox1下游，构建ppic9k-mlcc5表达载体；
19.(4)获取重组菌株：将所述ppic9k-mlcc5表达载体转化至trans1 t1感受态细胞中，得到trans1 t1-ppic9k-mlcc5；
20.使用限制性内切酶sac i对ppic9k-mlcc5质粒线性化，通过电击转化法将线性化表达载体转入宿主毕赤酵母中得到p.pastoris-ppic9k-mlcc5；
21.(5)筛选饱和突变文库：以p.pastoris-ppic9k、野生型p.pastoris-ppic9k-lcc5为对照组，将对照组、所述p.pastoris-ppic9k-mlcc5分别转接于含bmgy培养基的96孔板中培养，后加入bmm培养基诱导突变漆酶表达；并以afb1为底物测定脱毒效率，筛选afb1脱毒效率优于对照组的突变漆酶p.pastoris-ppic9k-mlcc5。
22.有益效果：本发明以在pichia pastoris中异源表达的漆酶为基础，通过定点饱和突变，并在p.pastoris中异源表达突变漆酶基因，构建了一个“小而精”的饱和突变体文库；最终通过筛选获得了一株重组毕赤酵母突变菌株，其发酵产生的酶蛋白脱毒afb1的效率提升至1.34倍，突变体蛋白可应用于生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1的同步脱毒。
23.优先的，所述步骤(3)中酶切连接法包括：采用snabⅰ和notⅰ两种限制性内切酶分别对所述突变mlcc5基因和ppic9k空载进行双酶切，然后通过t4连接酶将载体与突变基因连接。
24.本发明第五方面提出一种上述重组菌株在黄曲霉毒素脱毒中的应用，包括以下步骤：以afb1为底物，向其中加入乙醇、突变漆酶发酵液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，在30～32℃、800～1000rpm反应20～24h；其中，afb1终浓度为0.1～0.15μg/ml，乙醇终浓度为15～20％，酶液终浓度为0.2～0.25u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足余量。
25.本发明第六方面提出一种上述重组菌株在生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物中黄曲霉毒素的同步脱毒中的应用。
26.本发明的优点在于：
27.1.本技术利用定点饱和突变技术，实现对目标漆酶的定向改造；
28.2.本技术获得一种对afb1脱毒效率提高的突变漆酶，其脱毒效率提升至1.34倍；3.本技术获得的突变漆酶可用于黄曲霉毒素脱毒。
附图说明
29.图1为本技术实施例1中采用琼脂糖凝胶电泳检测饱和突变基因的扩增结果图。
30.图2为本技术实施例1中突变基因表达载体构建示意图。
31.图3为本技术实施例1中底物筛选结果图。
具体实施方式
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
34.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
35.实施例1
36.本实施例提供一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用，包括以下步骤：
37.1.提取漆酶基因模板
38.将来源于现代生物制造安徽省重点实验室的escherichia coli trans1 t1-ppic9k-lcc5取出，于lb平板培养基(含amp)上划线，并在37℃下培养箱培养8～12h；然后挑取单克隆，接种于含lb液体培养基(含amp)的试管中，并在37℃下摇床过夜培养；收集菌体，按照质粒提取试剂盒操作说明提取ppic9k-lcc5质粒，得到漆酶基因模板。
39.经测定，漆酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，漆酶氨基酸编码的核苷酸序列如seq id no:2所示。
40.2.克隆突变基因
41.以lcc5质粒为漆酶基因模板，使用snapgene软件设计引物，引物序列见表1，并选择毕赤酵母偏好的密码子，对分子动力学模拟及序列保守性分析获得的潜在有益突变位点分别进行饱和突变。采用pcr扩增获得突变mlcc5基因，pcr扩增操作参考hs dna polymerase说明书，各反应程序的反应条件见表2，反应体系中各组分用量见表3。
42.表1引物设计
[0043][0044]
表2 pcr反应条件
[0045][0046]
表3 pcr反应体系(50μl)
[0047][0048][0049]
pcr扩增结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测饱和突变基因的扩增情况，结果如图1所示，图1a为突变位点上、下游片段扩增结果，图1b为全长突变基因扩增结果，该检测结果显示，扩增条带大小正确。
[0050]
3.构建重组表达载体
[0051]
①
如图2所示，采用snab
ꢀⅰ
和not
ꢀⅰ
两种限制性内切酶，分别对将pcr扩增获得的突变mlcc5基因和ppic9k空载进行双酶切，双酶切反应体系中各组分用量见表4，酶切于37℃反应60min。酶切完成后，产物以1％的核酸胶进行纯化回收。
[0052]
表4双酶切反应体系(50μl)
[0053][0054]
②
在t4连接酶作用下，按照摩尔比为1:6的用量，将酶切后的突变mlcc5基因插入到ppic9k空载的启动子aox1下游，条件为22℃连接60min，以此构建ppic9k-mlcc5表达载体。
[0055]
4.获取重组菌株
[0056]
①
将构建的ppic9k-mlcc5表达载体转化至trans1 t1感受态细胞中，得到trans1t1-ppic9k-mlcc5。
[0057]
②
在37℃条件下培养trans1 t1-ppic9k-mlcc5 8～12h，并提取ppic9k-mlcc5质粒；如图2所示，然后使用限制性内切酶sac i对ppic9k-mlcc5质粒线性化，条件为37℃反应60min；再通过电击转化法将线性化表达载体转入宿主毕赤酵母(p.pastoris)中，得到p.pastoris-ppic9k-mlcc5。
[0058]
5.筛选饱和突变文库
[0059]
①
将p.pastoris-ppic9k-mlcc5从保菌管单克隆转接到含有100ml bmgy培养基的96孔板中，并于28℃、800rpm条件下养菌24h。
[0060]
②
以p.pastoris-ppic9k、野生型p.pastoris-ppic9k-lcc5为对照组，将养好的对照组、p.pastoris-ppic9k-mlcc5分别用印膜转到含有800μl bmgy培养基的96孔板中培养，每组样品做三个平行样，尽量保证每块板的接种量一致，并于28℃、800rpm条件下培养24h。
[0061]
③
将上述培养的样品分别以600rpm离心15min，除去上清液，然后在每孔中加入800μl bmm培养基，诱导培养24h，使对照组菌株和突变漆酶表达。
[0062]
④
以黄曲霉毒素b1(afb1)为底物，向其中加入乙醇、稀释1～5倍的诱导后对照组或突变漆酶发酵液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，反应体系总体积为200μl，其中afb1终浓度为0.1μg/ml，乙醇终浓度为15％，酶液终浓度为0.2u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足体积至200μl。
[0063]
将各反应体系在32℃、800rpm反应24h，测定各反应体系中afb1的脱毒效率相较于野生型脱毒率倍数，该倍数可用公式表示为：脱毒率倍数＝突变漆酶脱毒率/野生型漆酶脱毒率，测定结果如图3所示。
[0064]
根据图3，筛选出对afb1脱毒效率相对照组提升1.34倍的p.pastoris-ppic9k-mlcc5为目标突变漆酶。经测定，筛选出的突变漆酶的氨基酸序列如seq id no:3所示，突变漆酶氨基酸编码的核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0065]
6.重组菌株在生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1同步脱毒中的应用
[0066]
以生物乙醇制备过程中ddgs为底物，向其中加入乙醇、筛选出的突变漆酶培养液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，反应体系总体积为200μl。其中，afb1终浓度为0.1μg/ml-1
，乙醇终浓度为15％，酶液终浓度为0.2u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足体积至200μl。将反应体系在32℃、800rpm反应24h，测定反应体系中afb1的脱毒效率为16％。
[0067]
实施例2
[0068]
本实施例提供一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用，包括以下步骤：
[0069]
步骤1-5同实施例1。
[0070]
6.重组菌株在生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1同步脱毒中的应用
[0071]
以生物乙醇制备过程中ddgs为底物，向其中加入乙醇、筛选出的突变漆酶培养液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，反应体系总体积为200μl。其中，afb1终浓度为0.13μg/ml-1
，乙醇终浓度为18％，酶液终浓度为0.23u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足体积至200μl。将反应体系在31℃、900rpm反应22h，测定反应体系中afb1的脱毒效率为16.2％。
[0072]
实施例3
[0073]
本实施例提供一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用，包括以下步骤：
[0074]
步骤1-5同实施例1。
[0075]
6.重组菌株在生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1同步脱毒中的应用
[0076]
以生物乙醇制备过程中ddgs为底物，向其中加入乙醇、筛选出的突变漆酶培养液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，反应体系总体积为200μl。其中，afb1终浓度为0.15μg/ml-1
，乙醇终浓度为20％，酶液终浓度为0.25u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足体积至200μl。将反应体系在30℃、1000rpm反应20h，测定反应体系中afb1的脱毒效率为16.5％。
[0077]
对比例1
[0078]
本对比例采用含有ppic9k空载的毕赤酵母(p.pastoris)菌对生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1进行同步脱毒。
[0079]
以生物乙醇制备过程中ddgs为底物，向其中加入乙醇、含有ppic9k空载的毕赤酵母(p.pastoris)菌株液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，反应体系总体积为200μl。其中，afb1终浓度为0.1μg/ml-1
，乙醇终浓度为15％，酶液终浓度为0.2u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足体积至200μl。将反应体系在32℃、800rpm反应24h，测定反应体系中afb1的脱毒效率为0％。
[0080]
对比例2
[0081]
本对比例采用野生型p.pastoris-ppic9k-lcc5菌株对生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1进行同步脱毒。
[0082]
以生物乙醇制备过程中ddgs为底物，向其中加入乙醇、野生型p.
[0083]
pastoris-ppic9k-lcc5菌株液、ph＝4.0的柠檬酸-na2hpo4缓冲液，反应体系总体
积为200μl。其中，afb1终浓度为0.1μg/ml-1
，乙醇终浓度为15％，酶液终浓度为0.2u，柠檬酸-na2hpo4缓冲液补足体积至200μl。将反应体系在32℃、800rpm反应24h，测定反应体系中afb1的脱毒效率为12％。
[0084]
本技术的实施原理为：本发明以在pichia pastoris中异源表达的漆酶为基础，通过定点饱和突变，并在p.pastoris中异源表达突变漆酶基因，构建了一个“小而精”的饱和突变体文库；最终通过筛选获得了一株重组毕赤酵母突变菌株，其发酵产生的酶蛋白脱毒afb1的效率提升至1.34倍，突变体蛋白可应用于生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(ddgs)中afb1的同步脱毒。
[0085]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。