一株高产AVG的链霉菌及其应用

一株高产avg的链霉菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物保鲜技术领域，具体涉及一株高产avg的链霉菌及其应用。


背景技术：

2.果蔬采摘后由于受物理、生理和病理等因素的影响，其损失比较严重。目前广泛用于果蔬贮藏保鲜的技术有常温贮藏、低温贮藏、气调贮藏、减压贮藏、电磁辐射贮藏、臭氧离子贮藏等。在这些贮藏保鲜技术中，果蔬保鲜剂作为一项必不可少的辅助技术及常温下的一项独立技术而被广泛应用，并显示出较好的经济效益。随着人们对环境、健康等方面的考虑，安全和无毒的天然保鲜剂和微生物保鲜剂正受到广泛的关注。
3.氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine，avg)是一种非必需氨基酸，是乙烯合成前体acc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合成的抑制剂，可有效抑制乙烯的生物合成，延缓果蔬的后熟过程。许多研究已证实，avg可有效延缓猕猴桃、桃子、果菜类等果蔬的成熟衰老。但是由于avg的化学合成复杂，产率低；目前只能依靠进口。因此，avg的价格昂贵，难以进行产业化应用。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株高产avg的链霉菌及其应用。本发明的链霉菌的发酵液中含有avg成分，可将其开发成avg液体保鲜剂，用于乙烯敏感类果蔬的贮藏保鲜，解决了avg产业化应用的难题。利用本发明的链霉菌发酵生产生物保鲜剂具有发酵周期短、生产条件简单、产量和质量稳定等优点，具有良好的应用前景。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供一株链霉菌(streptomyces sp.)pl11，该菌株已于2022年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：cgmcc no.24263。
7.含有上述链霉菌(streptomyces sp.)pl11的菌剂也属于本发明的保护范围。
8.上述菌剂中，所述链霉菌(streptomyces sp.)pl11是以活菌的发酵液形式存在。
9.上述菌剂中，还可含有其他活性成分，本领域技术人员可根据菌剂的使用效果确定其他活性成分的组成。
10.本发明的第二方面，提供上述链霉菌(streptomyces sp.)pl11或者含有链霉菌(streptomyces sp.)pl11在如下(1)-(3)至少一项中的应用：
11.(1)合成avg；
12.(2)果蔬的贮藏保鲜；
13.(3)制备用于果蔬贮藏的生物保鲜剂。
14.上述应用中，优选的，所述果蔬为乙烯敏感类果蔬。
15.本发明的第三方面，提供一种发酵生产avg的方法，包括以下步骤：
16.将上述链霉菌(streptomyces sp.)pl11接种于yepeg培养基中，发酵培养，得到含
有avg的发酵液。
17.优选的，发酵培养的条件为：发酵温度28℃，ph＝7.5，发酵时间80h。
18.在上述优选的发酵培养条件下，avg的产量为78mg/l。
19.本发明的第四方面，提供一种生物保鲜剂，所述生物保鲜剂由如下方法制备而成：
20.将上述链霉菌(streptomyces sp.)pl11接种于yepeg培养基中，25℃～28℃，140r/min～180r/min摇床培养24-80h，得到发酵液；将发酵液通过滤膜过滤，得到发酵滤液。
21.进一步的，上述生物保鲜剂的制备方法中，还包括：对发酵滤液纯化的步骤，纯化的方法为：
22.调节发酵滤液的ph＝3，静置使杂蛋白析出，离心，分离上清液；将上清液用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；将萃取液与无水乙醇配成体系，浓缩。
23.本发明的第五方面，提供上述生物保鲜剂在采收后乙烯敏感类果蔬保鲜中的应用。
24.上述应用中，具体应用方法为：将上述生物保鲜剂喷洒在采摘后的果蔬表面，晾干，再进行冷藏或常温贮藏。
25.本发明的有益效果：
26.(1)本发明首次分离得到一株高产avg的链霉菌(streptomyces sp.)pl11，其发酵生产条件简单，发酵液中avg含量高，解决了目前缺少avg产业化制剂的难题。
27.(2)本发明的链霉菌(streptomyces sp.)pl11可以作为一种新型、安全、高效的保鲜菌株，利用本发明的链霉菌(streptomyces sp.)pl11制备的生物保鲜剂，能延缓对乙烯敏感类果蔬的成熟衰老，此法操作简单、安全性高、对果蔬无残留毒性，具有很高的应用价值。在处理和贮藏中不使用任何有毒试剂，能高效保鲜多种乙烯敏感类果蔬，具有广阔的市场前景。可用于香蕉、红立毛桃、青椒、番茄、苦瓜等多种果蔬保鲜。
附图说明
28.图1：基于16s rrna基因序列构建的菌株pl11系统发育树。
29.图2：菌株pl11发酵产物的薄层色谱验证。
30.图3：本发明的生物保鲜剂在保鲜青椒上的效果考察。
31.图4：25℃下贮藏9d青椒颜色变化；其中，a为对照处理；b为本发明的生物保鲜剂处理。
32.图5：本发明的生物保鲜剂在保鲜香蕉上的效果考察。
33.图6：本发明的生物保鲜剂在保鲜红立毛桃上的效果考察。
34.图7：本发明的生物保鲜剂在保鲜番茄上的效果考察。
具体实施方式
35.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
36.如前所述，avg是一种非必须氨基酸，可有效抑制乙烯的生物合成，延缓果蔬的后
熟过程，在果蔬保鲜方面极具应用价值。但是，avg的化学合成复杂，产率低，目前主要依赖进口，其价格昂贵，限制了其产业化应用。
37.本发明在实验过程中分离筛选到一株链霉菌(streptomyces sp.)pl11，并意外的发现该菌株的发酵液中含有avg，因此，可以利用该链霉菌(streptomyces sp.)pl11发酵生产avg，解决了缺少avg产业化制剂的难题。而且，微生物生长不受季节、地区和气候的影响，发酵周期短，利用该链霉菌(streptomyces sp.)pl1发酵生产生物保鲜剂，具有生产条件简单、产量与质量稳定等优点，在果蔬保鲜方面有良好的应用前景，由此提出了本发明。
38.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
39.改良黄豆粉琼脂培养基：黄豆浸膏粉20.0g，淀粉5.0g，蔗糖10.0g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉2.0g，氯化钠2.0g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙0.1g，琼脂15.0g，去离子水1000ml,ph7.3
±
0.1(25℃)。
40.改良黄豆粉液体培养基：黄豆浸膏粉20.0g，淀粉5.0g，蔗糖10.0g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉2.0g，氯化钠2.0g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙0.1g，去离子水1000ml,ph7.3
±
0.1(25℃)。
41.yepeg培养基：葡萄糖10g，细菌蛋白胨5g，酵母抽提物3g，fe(nh4)2(so4)2·
6h2o0.03g，蒸馏水1000ml；于121℃下，高压蒸汽灭菌20min。
42.高氏1号培养基、胰酪大豆胨液体培养基等均为市售培养基。
43.avg标品的购买厂家：valent biosciences；epa reg no:73049-468；code number:11983；list number:33702。
44.实施例1：菌株pl11的分离与鉴定
45.1、菌株分离：
46.初筛方法：琼脂扩散法
47.将从山东农业大学泮河校区桃园土壤中分离纯化菌株接种到改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃培养4～5d，用打孔器打成直径5mm琼脂块。取指示菌10微升涂布于普通琼脂平板，挑取琼脂块反贴到指示菌(枯草芽孢杆菌)平板上，观察抑菌圈和测量。
48.复筛方法：
49.将初筛有较强抗菌作用的链霉菌菌株接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃，180r/min培养5～6天。取指示菌5微升涂布于普通琼脂平板上，用灭菌的打孔器在培养基上打孔，取链霉菌培养液5微升注入孔中，培养24～48h后进行抑菌观察和测量。筛选得到一株抑菌效果最优的菌株pl11。
50.2、菌株鉴定：
51.菌株pl11生理生化鉴定结果：在ph 5.5～12范围可生长，ph＝7时生长最旺盛；对nacl有较强的耐受性，在4～28℃温度范围可生长，28℃左右最适宜生长，能够利用d-果糖、葡萄糖、α-乳糖、甘氨酸、蔗糖和l-阿拉伯糖，菌株过氧化氢酶、淀粉水解试验为阳性，酯酶试验为阴性，不能使明胶液化，不能分解利用纤维素。菌株pl11的耐受性考察结果见表1。
52.表1：菌株pl11的耐受性
[0053][0054]
基于16s rrna基因序列构建的菌株pl11系统发育树，结果如图1所示。
[0055]
结合菌株pl11的生理生化特征和分子生物学鉴定结果，将菌株pl11鉴定为链霉菌(streptomyces sp.)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
[0056]
菌种名称：pl11
[0057]
分类命名：streptomyces sp.
[0058]
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0059]
保藏机构简称：cgmcc
[0060]
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
[0061]
保藏日期：2022年1月6日
[0062]
保藏中心登记入册编号：cgmcc no.24263。
[0063]
实施例2：菌株pl11的发酵培养及纯化
[0064]
1、菌株pl11的发酵培养方法为：
[0065]
(1)经高氏1号培养基的平板培养的pl11菌种接种于胰酪大豆胨液体培养基(tsb培养基)，在27℃、180rpm/min，培养1d，将tsb培养基中的菌液按1％的接种量(即100ml培养基接种1ml菌液)接种于yepeg培养基，在27℃、180rpm/min，培养1d，得到发酵液。
[0066]
(2)将发酵液在5000rpm/min下，离心10分钟，去沉淀，取上清液用0.22μm滤膜过滤，得过滤液。
[0067]
2、本发明菌株pl11产生的avg鉴定和定量方法为：
[0068]
(1)采用薄层色谱法鉴定和测定。
[0069]
(2)在距离薄板一端约2cm处用细线向下压硅胶(用铅笔划一线)，压成一条点样线，标出点样点，并标注样品编号，间隔点的间距一般为0.5cm。
[0070]
(3)用微量定量毛细管分别吸取过滤液与avg标品溶液，在点样线上点样，每隔一定距离点一种样品，与薄板垂直方向轻轻碰点样处点样，直径约2～3mm。待点样处干后(可用吹风机吹干)，再将样品在原点样处重复点一次。
[0071]
(4)硅胶板的点样端向下，倾斜地放入层析缸内，使其与缸底平面呈约15-30度角。用长颈漏斗加入展开剂(正丁醇-冰乙酸-水，体积比4:2:1)，使展开剂离点样处1cm处为止。即点样端浸入展开剂深度约0.3cm-0.5cm为宜，盖上层析缸盖进行层析。
[0072]
(5)当溶剂前沿距上边缘1厘米处时，取出薄层板，立即用笔标出溶剂前沿的位置，将硅胶板置干燥箱烘干。用喷雾器均匀地喷上茚三酮显色剂将玻板置105℃干燥箱内烘干(可用吹风机吹干)，约10分钟左右可显出斑点。
[0073]
(6)用大头针轻轻划出所有斑点的轮廓，再用尺量出每个斑点从原点至斑点中心的距离及原点至展开剂前沿距离，计算出rf值。rf值＝(氨基酸移动的距离(cm))/(溶剂移动的距离(cm))。
[0074]
(7)薄层色谱法证明了链霉菌的新产物为avg(图2)。
[0075]
(8)定量分析：将0.1％茚三酮乙醇混合液喷在点有avg标品及样品的薄层板上，再80℃烘干，迅速刮下相应的标样及样品，加水溶解，过滤，定容至50ml，在570nm下测定其吸光度。这些操作要求在1个小时内完成，计算。
[0076]
(9)通过定量分析得标品标准曲线，将样品的吸光值代入得样品中avg含量。
[0077]
3、本发明的菌株pl11培养条件优化方法为：
[0078]
(1)温度对发酵产量的影响：将种子发酵液接种到yepeg培养基的三角瓶中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃下摇瓶培养，将发酵液离心获取上清液。
[0079]
(2)ph值对发酵产量的影响：将种子发酵液接种到yepeg培养基的三角瓶中，分别设置ph值在5.5、6.5、7、8下摇瓶培养，将发酵液离心获取上清液。
[0080]
(3)时间对发酵产量的影响：将种子液接种到yepeg培养基的三角瓶中，分别在60h、80h、96h、120h下摇瓶培养，将发酵液离心获取上清液。
[0081]
(4)在单因素实验基础上，按照响应曲面box-behnken法优化发酵条件。
[0082]
通过优化培养条件，链霉菌在28℃，ph＝7.5，发酵时间80h下，avg的产量为78mg/l，与在26℃，ph＝6.5，发酵时间72h培养条件下相比，avg的产量提高了27％。
[0083]
4、本发明的菌株pl11发酵滤液纯化方法为：
[0084]
(1)发酵液去菌体，保留上清液；
[0085]
(2)用配置的盐酸溶液调上清液ph值至3，静置1h至杂蛋白析出；
[0086]
(3)将上清液在6000-8000rpm转速下离心除沉淀；
[0087]
(4)离心后的溶液用乙酸乙酯萃取，除去发酵液中的脂溶性杂质，弃去乙酸乙酯层，得到萃取液；
[0088]
(5)将萃取液与无水乙醇按体积比3:7配成体系，旋蒸浓缩；通过将萃取液与无水乙醇配成容易挥发的体系，这样可以将萃取液中多余的水分除去，以提高avg浓度，avg浓度可以浓缩至原来4～5倍。
[0089]
(6)通过上述实验，即可得avg液体保鲜剂。
[0090]
实施例3：生物保鲜剂的制备
[0091]
(1)为了得到具有高活性的保鲜物质，将经平板培养的链霉菌pl11接种于tsb培养基，在28℃、180rpm/min，培养80h，得到种子液；将种子液1％的接种量(即100ml培养基接种1ml种子液)接种于yepeg培养基，在28℃、180rpm/min，培养80h，得到发酵液。
[0092]
(2)将上述发酵液通过0.22μm滤膜过滤，得到发酵滤液。
[0093]
(3)将发酵滤液用配置的盐酸溶液调上清液ph值至3，静置1h；8000rpm/min离心除沉淀。将离心后的溶液再用naoh调至ph＝7。将调整ph后的溶液与乙酸乙酯等体积混合，于摇床中振荡1h。振荡好后移入分液漏斗，静置，将发酵滤液与乙酸乙酯分离。将分离好的发酵滤液与无水乙醇按体积比3:7配成体系，蒸发浓缩至无醇味，得到浓缩液。
[0094]
(4)将浓缩液进行高压蒸汽灭菌(121℃，15min)，即制备得到生物保鲜剂。
[0095]
用户根据实际需求，用蒸馏水稀释相应倍数即可使用。根据果蔬种类的不同稀释倍数也不相同，一般为2～6倍。
[0096]
喷洒量：一公斤果蔬喷洒40-80ml稀释液。
[0097]
将稀释好的保鲜剂均匀的喷洒在果蔬表面，1-2h晾干。然后根据果蔬运输的要求可冷藏或常温贮藏。
[0098]
应用例1：在保鲜青椒上的应用
[0099]
选取新鲜市售的青椒为研究对象，要求外观完好饱满、大小成熟度一致、色泽鲜亮、无机械损伤且无病虫害。
[0100]
将实施例3制备的生物保鲜剂与蒸馏水按体积比1:4进行稀释，得稀释液；将稀释液均匀喷洒在青椒表面，晾干；喷洒量为：每公斤青椒喷洒50ml稀释液。然后在25℃条件下贮藏15d。
[0101]
以喷洒等量的蒸馏水作为对照(ck)。
[0102]
贮藏期间随机取样进行失重率、总叶绿素含量等各项指标的测定，测定方法参考《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅。中国轻工业出版社。2007。
[0103]
结果如图3和图4所示。结果表明：本发明的生物保鲜剂对青椒具有优异的保鲜效果。
[0104]
应用例2：在保鲜香蕉上的应用
[0105]
以七成熟的香蕉为试材，将实施例3制备的生物保鲜剂与蒸馏水按体积比1:4进行稀释，得稀释液；将稀释液均匀喷洒在香蕉表面，晾干；喷洒量为：每公斤香蕉喷洒50ml稀释液。然后在20℃条件下贮藏。
[0106]
以喷洒等量的蒸馏水作为对照(ck)。
[0107]
通过对其硬度、可溶性固形物含量等指标的测定来观测其保鲜效果，测定方法参考《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅。中国轻工业出版社。2007。。
[0108]
结果表明(图5)，与对照组相比，本发明的生物保鲜剂处理能起到延缓香蕉果实成熟衰老的作用。
[0109]
应用例3：在保鲜红立毛桃上的应用
[0110]
挑选采摘购买成熟度一致、大小均匀、果色良好、没有病虫害和机械伤的八成熟红立毛桃果实为试验对象。将实施例3制备的生物保鲜剂与蒸馏水按体积比1:5进行稀释，得稀释液；将稀释液均匀喷洒在毛桃果实表面，晾干；喷洒量为：每公斤毛桃果实喷洒60ml稀释液。置于温度为20℃，湿度为40％-50％的环境下贮藏，并观测其品质(乙烯释放度、硬度)变化，测定方法参考《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅。中国轻工业出版社。2007。
[0111]
以喷洒等量的蒸馏水作为对照(ck)。
[0112]
结果表明(图6)，与对照组相比，本发明的生物保鲜剂处理能起到延缓果实硬度降低，延缓果实乙烯的释放，从而延长果实贮藏期。
[0113]
应用例4：在保鲜番茄上的应用
[0114]
选取新鲜市售的番茄为研究对象，要求外观完好饱满、大小成熟度一致、色泽鲜亮、无机械损伤且无病虫害。将实施例3制备的生物保鲜剂与蒸馏水按体积比1:2进行稀释，得稀释液；将稀释液均匀喷洒在番茄果实表面，晾干；喷洒量为：每公斤番茄果实喷洒70ml稀释液。然后在25℃条件下贮藏12d。
[0115]
以喷洒等量的蒸馏水作为对照(ck)。
[0116]
贮藏期间随机取样进行硬度、总叶绿素含量等各项指标的测定，测定方法参考《果蔬采后生理生化实验指导》，曹建康，姜微波，赵玉梅。中国轻工业出版社。2007。
[0117]
结果表明(图7)，与对照组相比，本发明的生物保鲜剂处理能起到延缓果实硬度降
低，延缓果实总叶绿素含量的降低，从而延长果实贮藏期。
[0118]
综上可见，本发明提供的可产生avg的链霉菌对香蕉、红立毛桃、番茄、青椒等均有较强的保鲜作用，可有效延长多种果蔬货架期，在该领域具有广阔的应用前景。
[0119]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。