一种木聚糖酶的制备方法与流程

1.本发明属于发酵技术领域，涉及一种木聚糖酶的制备方法。


背景技术：

2.木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是自然界中第二大含量丰富的可再生资源。木聚糖酶(xylanase)是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和β-木聚糖酶。它可以将饲料中的非淀粉多糖(nsps)分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用；同时它可以破坏植物细胞壁的结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用表观代谢能(ame)；另外还可以减少微生物的定植、维持肠道正常结构，取得了良好的社会效益和经济效益。
3.目前饲用酶制剂的生产主要有液态和固态发酵方式。固态发酵是高效生产酶制剂的方法之一，存在着很多优点。然而，目前在木聚糖酶生产成本中培养基的成本占总成本的30％～40％，目前的固态发酵木聚糖酶的研究只侧重酶活的提高，而没有涉及木聚糖酶的实际应用效果。另外，喷雾干燥温度难于控制也会影响产品品质。因此，如何开发利用廉价的培养基成分(特别是碳源)降低木聚糖酶生产成本，提高酶的产率和酶活，并改进喷雾干燥系统确保生产出高酶活的酶制剂产品。


技术实现要素：

4.本发明提出一种木聚糖酶的制备方法，解决了现有技术中生物发酵生产木聚糖酶存在的酶产率低、酶活低、生产成本高的问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)制备发酵液
7.将生产木聚糖酶种子液按照6-8％的接种量接种至发酵培养基中在发酵罐中进行发酵培养，培养温度28-30℃，培养140-160h，补料培养，得到发酵液；
8.(2)制备粗酶液
9.将发酵液中菌丝体进行过滤、超滤浓缩除盐，得到粗酶液；
10.(3)稳定化干燥
11.粗酶液经添加载体稳定化处理形成喷雾料浆后进行喷雾干燥得到木聚糖酶固体酶制剂。
12.优选地，所述步骤(1)中，所述发酵培养工艺控制参数为：培养温度30℃、罐压0.05mpa、ph值4.5-5.0、转速140-150rpm、通风比1.0:1、溶氧控制20％、补料量50％、培养周期156h。
13.优选地，所述步骤(1)中，所述发酵培养还包括流加含生物素的氨水和甲醇进行诱导培养产生木聚糖酶，更优选为，流加含5x10-4
g/l生物素的氨水，所述氨水用量占总发酵液8％左右。
14.优选地，所述步骤(1)中，按质量百分比计，所述发酵培养基包括：葡萄糖25-35份，蛋白胨5-10份，磷酸二氢钾1-2份，七水合硫酸镁0.5-1份，氯化钾0.5-1份，水900-1000份。
15.优选地，所述步骤(1)中，所述补料包括：甲醇、加有生物素的氨水，补料的诱导剂甲醇加入量为发酵培养基的50％质量百分数，所述氨水用量占总发酵液8％左右。
16.优选地，所述步骤(1)中，所述种子液的制备方法包括：将生产木聚糖酶的摇瓶种子接种到一级种子培养基上进行一级种子培养，ph控制4.5-5.0，获得一级种子，然后将一级种子接种到二级种子培养基进行二级种子培养，ph控制4.5-5.0；种子经过两级扩培，湿重达到70克/升后形成所述种子液。
17.优选地，所述一级种子培养条件为：温度30℃、罐压0.05mpa、ph值4.5-5.0、转速300rpm、通风比1.5:1、接种量1％、培养周期24h。
18.优选地，所述二级种子培养条件为：温度30℃、罐压0.05mpa、ph值4.5-5.0、转速200rpm、通风比1.5:1、接种量10％、培养周期16h。
19.优选地，按质量份数计，所述一级种子培养基组分包括：甘油2％、蛋白胨2％、酵母粉1％，余量为水。
20.优选地，按质量份数计，所述二级种子培养基的组分包括：葡萄糖25-35份，蛋白胨5-10份，磷酸二氢钾1-2份，七水合硫酸镁0.5-1份，氯化钾0.5-1份，水900-1000份。
21.优选地，所述步骤(2)中，所述过滤为板框压滤机过滤，进料压力0.2-0.4mpa,过滤速度20l/m2h,菌渣水分55-65％(wt％)。
22.优选地，所述步骤(3)中，所述稳定化处理为粗酶液进入配料罐，向粗酶液中加入包含酶保护剂的辅助料，按喷雾料浆质量百分比计，所述辅助料包括：玉米淀粉10-15％、微晶纤维素2-4％、保护剂0.5-2％、载体1-3％。
23.优选地，所述保护剂为糊精、多元醇中的一种或多种，所述载体为食盐或硫酸钠中的一种或多种。
24.优选地，所述喷雾干燥在酶制剂恒温喷雾干燥系统中进行，所述酶制剂恒温喷雾干燥系统包括料浆喷雾干燥塔和控制器；所述料浆喷雾干燥塔在顶端的进风口接收热风并用于对喷雾料浆进行干燥；所述控制器通过设置于所述料浆喷雾干燥塔顶端内壁上温度传感器采集的实时温度生成调节指令调节所述热风的温度和/或风量以使所述料浆喷雾干燥塔内保持温度相对恒定。
25.优选的，所述控制器根据所述温度传感器采集的实时温度，并结合所述进风温度上次及历史调节指令，确定下次调节指令调整的方向和幅度。
26.优选的，所述控制器包括恒温决策算法：
27.1)温度传感器采集实时温度，控制器接收并对温度数据进行诊断，去除无效数据；
28.2)控制器通过最优化自回归数据处理算法获取对下次热风温度设定值的估计，消除对延时带来的误差的影响；其模型为：ta＝tk (δt
k-1
δt
k-2
)/2；其中，ta为下次温度调节设定值，tk为当前温度值，δt
k-1
和δt
k-2
分别为历史上最近两次温度设定值调节幅度变化矢量值，其计算公式为下次设定温度值减去上次设定温度值，对温度设定值进行修正。
29.本发明的工作原理及有益效果为：
30.1、本发明中产品发酵水平酶活力从原来10万u/ml提高到18万u/ml以上，喷雾干燥进风温度170
±
2℃、排风温度72
±
2℃下，喷雾干燥实现了相对恒温控制，喷雾收率能达到
60％以上，固体产品60万u/g，发酵生产成本降低33％以上，并能够根据客户需求生产出不同规格的优质产品。
31.2、本发明开发出适合木聚糖酶的酶保护剂和组合配方。在料浆喷雾干燥阶段，采用本发明的酶保护剂和组合配方，比单独用其中一种或多种喷雾收率提高3-5％。
32.3、本发明采用毕赤酵母工程菌，该菌种能诱导产生单一的内切木聚糖酶，不含β-木糖苷酶等外切木聚糖酶，更适合于饲料工业中使用；在毕赤酵母增值阶段，弃用价格昂贵的甘油培养酵母的通用工艺技术，创造性的选用廉价易得的葡萄糖为碳源，实现了毕赤酵母增值培养，降低了原材料生产成本；用甲醇诱导实现了毕赤酵母生产木聚糖酶的高效表达，大幅提升了发酵技术水平。
33.4、改变传统的生物素单独添加方式，甲醇诱导期采用了混合补料工艺，生物素添加混合氨水中均匀流加，生物素添加量稳定，不会因过量或过少影响菌体生长及产酶，生长顺畅，能更好的实现了高密度发酵，提高了发酵酶活力水平。
34.5、发酵过程通过自动化补料控制系统，将影响发酵的工艺控制参数ph、温度、do等在线监测和反馈，实现补料及整个发酵过程的自动化控制。
35.6、喷雾干燥塔采用恒温决策算法，通过历史上最近两次温度设定值调节幅度变化矢量值，消除对延时带来的误差的影响，对温度修订值进行修正，以达到将因进料等因素波动带来的干燥塔内干燥温度的波动变化进行限幅处理，防止温度过度调整，同时，能够快速实现喷雾干燥塔顶端的进口热风温度控制在目标范围内，保证了喷雾干燥的连续、稳定生产出高品质的固体酶制剂产品。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.酶活力检测方法
38.本实施例和对比例的产品酶活力均采用gb/t 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法进行检测。
39.实施例1
40.(1)制备发酵液
41.将生产木聚糖酶的摇瓶种子(毕赤酵母工程菌)接种到一级种子培养基上进行一级种子培养，ph控制4.5-5.0获得一级种子，然后将一级种子接种到二级种子培养基进行二级种子培养，ph控制4.5-5.0；种子经过两级扩培，湿重达到70克/升后获得生产木聚糖酶的种子液。
42.其中，一级种子培养条件为：温度30℃、600升发酵罐罐压0.05mpa、ph值4.5-5.0、转速300rpm、通风比1.5:1、接种量1％、培养周期24h；二级种子培养条件为：温度30℃、4000升发酵罐压0.05mpa、ph值4.5-5.0、转速200rpm、通风比1.5:1、接种量10％、培养周期16h。
43.按质量份数计，一级种子培养基组分包括：甘油2％、蛋白胨2％、酵母粉1％，余量为水。
44.按质量份数计，二级种子培养基的组分包括：葡萄糖25-35份，蛋白胨5-10份，磷酸二氢钾1-2份，七水合硫酸镁0.5-1份，氯化钾0.5-1份，水900-1000份。
45.将培养的生产木聚糖酶种子液按照6-8％的接种量接种至发酵培养基中在60立方发酵罐中进行发酵培养得到发酵液。其中，发酵培养工艺控制参数为：培养温度30℃、罐压0.05mpa、ph值4.5-5.0、转速140-150rpm、通风比1.0:1、溶氧控制20％、补料量50％、培养周期156h。按质量百分比计，发酵培养基包括：葡萄糖25-35份，蛋白胨5-10份，磷酸二氢钾1-2份，七水合硫酸镁0.5-1份，氯化钾0.5-1份，水900-1000份。
46.在本实施例中，为消除人为操作因素可能带来的产品波动影响，发酵过程通过自动化补料控制系统，将影响发酵的工艺控制参数ph、温度、do等在线监测和反馈，实现补料及整个发酵过程的自动化控制。
47.在本实施例中，采用甲醇诱导产生木聚糖酶，甲醇诱导期采用连续补料工艺进行发酵培养，通过流加含5x10-4
g/l生物素的氨水(氨水用量占总发酵液质量总数的8％左右)并控制ph在5.0左右添加，进行诱导实现了毕赤酵母生产木聚糖酶的高效表达，大幅提升了发酵技术水平。由于生物素添加混合在原料中均匀流加，生物素添加量稳定，不会出现生物素单独添加方式下因过量或过少影响菌体生长及产酶，生长顺畅，因此，检测发酵液的木聚糖酶酶活力在18万u/ml以上。发酵生产成本降低33％以上。
48.在本实施例中，生物素也可以混在甲醇中进行添加，但是，由于向发酵液中添加时，需要打开甲醇罐的罐口进行添加，甲醇由于其易燃易爆特点，如果泄露将比较危险，而氨水相对安全，添加方便，因此，在本实施例中，生物素添加到氨水中，同氨水一起在发酵过程中通过控制ph值来向发酵罐中补料流加。
49.(2)制备粗酶液
50.将制备的发酵液在用板框压滤机过滤，采用25ku直径的超滤管膜超滤，浓缩除盐，得到粗酶液。板框压滤过滤条件为：进料压力0.2-0.4mpa,过滤速度20l/m2h,菌渣水分55-65％(wt％)。
51.(3)稳定化干燥
52.为了生产木聚糖酶固体酶制剂产品，粗酶液经添加载体稳定化处理形成喷雾料浆后进行喷雾干燥得到木聚糖酶固体酶制剂。
53.首先，粗酶液导入配料罐，向粗酶液中搅拌加入包含酶保护剂的辅助料，加载体稳定化处理形成喷雾料浆，按喷雾料浆质量百分比计，辅助料包括：玉米淀粉10-15％、微晶纤维素2-4％、保护剂0.5-2％、载体1-3％。其中，保护剂为糊精、多元醇中的一种或多种，所述载体为食盐或硫酸钠中的一种或多种。
54.第二步，启动酶制剂恒温喷雾干燥系统中进行喷雾料浆的干燥。酶制剂恒温喷雾干燥系统包括料浆喷雾干燥塔和控制器；料浆喷雾干燥塔在顶端的进风口接收经加热器加热后的来自鼓风机的热风并用于对喷雾料浆进行干燥；控制器通过设置于料浆喷雾干燥塔顶端内壁上温度传感器采集的实时温度生成调节指令调节热风的温度和/或风量以使料浆喷雾干燥塔内保持温度相对恒定。
55.对于酶制剂恒温喷雾干燥系统，由于料浆从干燥塔顶端进入进行喷雾干燥，雾化料浆从顶端向塔底移动过程中吸收热风热量，脱水、干燥成粉体，因此，干燥塔塔内从顶端到塔底，干燥系统的恒温干燥的目标是干燥塔内温度分布达到一个相对恒定的状态，干燥
塔内空间各层的温度在塔高度上是变化的，但空间各层的温度在时间上追求恒定不变或者波动尽可能小，以保证干燥工艺的相对稳定。
56.在本实施例中，酶制剂恒温喷雾干燥系统的目标干燥恒温控制为调节鼓风机引入至料浆喷雾干燥塔顶端的热风温度控制在目标范围内，即顶端进风口热风170
±
3℃、塔底排风温度72
±
3℃下，产品雾化收率55％以上，控制器采用恒温决策算法进行指令调节：
57.a)温度传感器定期(间隔1-5分钟，优选为间隔2分钟)采集料浆喷雾干燥塔顶端内壁处的实时温度，控制器接收并对温度数据进行诊断，去除无效数据。
58.b)决策模块通过最优化自回归数据处理算法获取对下次热风温度设定值的估计，消除对延时带来的误差的影响，其模型为：ta＝tk (δt k-1
δt k-2
)/2；其中，ta为下次热风温度调节设定值，tk为当前温度值，δt k-1
和δt k-2
分别为历史上最近两次温度设定值调节幅度变化矢量值，其计算公式为下次设定温度值减去上次设定温度值，对温度设定值进行修正。
59.在正式开始喷雾干燥操作前，先开启酶制剂恒温喷雾干燥系统的鼓风机和加热器和引风机，热风进入料浆喷雾干燥塔，升高料浆喷雾干燥塔温度至目标干燥温度ts(例如进风口热风170℃左右)，待系统稳定后，喷雾料浆通过设置在料浆喷雾干燥塔顶端内壁处的喷头进行雾化喷雾，在热风气流下，喷雾料浆瞬间脱水、干燥，生产固体干粉酶制剂，从料浆喷雾干燥塔底部排出。由于常温的过滤浆料进入料浆喷雾干燥塔吸收热量，导致塔内温度波动下降，为保持恒温下干燥，需要调节料浆喷雾干燥塔塔顶热风温度。
60.根据决策模型：ta＝tk (δt
k-1
δt
k-2
)/2，由于首次和第2次没有前期历史数据，因此，在本实施例中，在开始第一次进行模型决策前，以喷雾料浆干燥目标温度ts调节温度设定值，并在开始进料干燥后记录实际干燥温度与喷雾料浆干燥目标温度ts的偏差δt作为模型最初的输入δt1和δt2，以启动模型。
61.第3次：实际干燥温度t3，计算下次温度调节设定值ta，计算公式：ta＝t3 (δt2 δt1)/2；根据第3次调节幅度为(δt1 δt2)/2。
62.由于控制器用于调节的指令所根据的是实时温度和包含历史决策和运行信息的预设温度的波动区间增大或减小趋势信息，确定料浆喷雾干燥塔顶端的进口热风温度调节方向和调节幅度，生成的调节指令能够将下次调节的幅度变化控制在较小的范围内，从而保证了料浆喷雾干燥塔内的相对恒温干燥运行。
63.控制单元的控制器的决策模块采用恒温决策算法，通过最优化自回归数据处理获取对下次热风温度设定值的估计，通过历史上最近两次温度设定值调节幅度变化矢量值，消除对延时带来的误差的影响，对温度修订值进行修正，其意义为，如果发现温度设定值变大，而实际温度未发生变化，则增加一个正的修正值；如温度设定值变小，则往温度上加一个付的修正量，以达到将因进料等因素波动带来的塔内干燥温度的波动变化进行限幅处理，防止温度过度调整。
64.本实施例中，粗酶液经添加载体稳定化处理形成喷雾料浆后进行喷雾干燥，酶制剂恒温喷雾干燥系统的恒温控制目标能通过模型4次(8分钟内)调节就能快速顺利达成温度调控目标，进口热风温度控制在目标范围内，而且能实现目标温度下上下波动2度的精准控制，即进口热风170
±
2℃、塔底排风温度72
±
2℃下，产品雾化收率61％，产品品质也能够得到充分的保障。
65.实施例2
66.与实施例1不同的是，本实施例，首先，采用甲醇诱导产生木聚糖酶，甲醇诱导期，计量好生物素并以单独添加方式下加入到发酵罐中，供菌体发酵培养产酶。其次，将发酵液在板框压滤机过滤后，采用30ku直径的超滤管膜超滤，浓缩除盐，得到粗酶液。检测发酵液的木聚糖酶酶活力在15～16万u/ml。可见，采用单独添加生物素的方式，进行甲醇诱导产生木聚糖酶的酶活力较低，说明，单独添加生物素，生物素在发酵培养体系内不能很好的分散，从而影响到产酶和酶活力。
67.实施例3
68.与实施例1不同的是，本实施例中，在稳定化干燥阶段，酶制剂恒温喷雾干燥系统的目标干燥恒温控制以目标温度顶端进风口热风165-170℃、塔底排风温度68
±
2℃进行喷雾干燥调控，控制器采用恒温决策算法进行指令调节，恒温控制目标能通过模型4次(8分钟内)调节就能快速顺利达成温度调控目标，木聚糖酶喷雾干燥塔的进口热风167
±
2℃、塔底排风温度68
±
2℃下，产品雾化收率60％，产品品质也能够得到充分的保障。
69.实施例4
70.与实施例3不同的是，本实施例中，在稳定化干燥阶段，酶制剂恒温喷雾干燥系统的目标干燥恒温控制以目标温度顶端进风口热风180-190℃、塔底排风温度74
±
2℃进行喷雾干燥调控，控制器采用恒温决策算法进行指令调节，恒温控制目标能通过模型4次调节就能快速顺利达成温度调控目标，木聚糖酶喷雾干燥塔的进口热风185
±
2℃、塔底排风温度74
±
2℃下，产品雾化收率55％，产品品质略有下降，说明进风口热风180-190℃、塔底排风温度74
±
2℃进行喷雾干燥不利于木聚糖酶喷雾干燥。
71.对比例1
72.与实施例1不同的是，本实施例中，在完成粗酶液制备后，粗酶液导入配料罐，向粗酶液中搅拌加入不包含酶保护剂的辅助料，未经过稳定化处理形成的喷雾料浆，按喷雾料浆质量百分比计，辅助料包括：玉米淀粉10-15％、微晶纤维素2-4％、载体1-3％。其中，载体为食盐或硫酸钠中的一种或多种。
73.酶制剂恒温喷雾干燥系统，进口热风170
±
2℃、塔底排风温度72
±
2℃下，产品雾化收率56％，产品收率明显降低，表明酶保护剂在喷雾料浆干燥过程中的稳定保护作用明显，对产品收率影响较大。
74.对比例2
75.与实施例1不同的是，采用传统的酶制剂恒温喷雾干燥塔进行喷雾干燥，并通过人工进行木聚糖酶酶制剂恒温喷雾干燥塔的温度调控，结果发现，木聚糖酶恒温干燥无法实现连续稳定生产，温度控制波动较大，无法满足进口热风170
±
2℃、塔底排风温度72
±
2℃的温控目标，实测进口热风170
±
6℃、塔底排风温度72
±
6℃下，导致工艺波动大，产品雾化收率52％，木聚糖酶产品品质也无法得到保障，产品结块严重。
76.由实施例1-4和比较例1-2可知，料浆喷雾干燥温度控制对产品的收率影响较大，通过试验，确定最适合进风温度170
±
2℃、排风温度为72
±
2℃，采用恒温决策算法的控制器能够有效保证喷雾料浆在干燥塔内快速达成上述温度控制目标，以保障能够取得60％以上的木聚糖酶固体酶制剂的喷雾收率。此外，毕赤酵母能够实现高密度发酵木聚糖酶，以葡萄糖替代昂贵的甘油为碳源，能大幅降低发酵生产成本，提高了发酵水平。通过本发明的两
级种子扩培处理，发酵培养能够获得发酵酶活力大于18万/ml的发酵液，菌体湿重大于450g/l。
77.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。