透皮肽寡肽-5融合多肽及其制备方法与流程

1.本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及透皮肽寡肽-5融合多肽及其制备方法。


背景技术：

2.透皮给药系统或经皮吸收系统(transdermal drug delivery systems/transdermal thrapeutic systems，简称tdds/tts)，指经皮肤贴敷或涂抹方式用药，药物由皮肤吸收进入全身血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防的一种方法。经皮给药具有易操作、损伤小等优点，避免了胃肠道和肝脏的消化和降解作用。
3.皮肤是最大的器官，无论是经皮给药用于治疗皮肤疾病还是出于美容护肤的目的，如何促进有效成分的透皮吸收是科研工作者研究重点。
4.传统促透剂易产生皮肤过敏和炎症、浓度高有毒性、对大分子无效需仪器辅助的缺点，物理促透法成本高，不便携带，长期使用易导致角质层变薄、易引起皮肤感染。而生物促透技术是利用一类具有皮肤穿透能力的多肽分子，约10到30个氨基酸，可有效促进大分子透皮。透皮肽具有无刺激性、不会导致皮肤过敏及损伤、药物与材料有良好的相容性、具有稳定的理化性质、起效时间快、作用时间长。
5.透皮肽是一种具有增强型透皮功能的多肽，能增强和/或方便活性分子透过皮肤，使得进入体循环的活性分析剂量增加或者到达靶器官、组织和细胞的活性分子剂量增加，并能够用于大分子量药物如多肽、蛋白和核酸分子的透皮给药。透皮肽种类很多，tat以其低毒性及高细胞穿透性应用最为广泛。
6.环状ctat(cyclization of tat peptide)氨基酸序列为cygrkkrrqrrrc，其主链半胱氨酸巯基形成二硫键发生环化，具有优越的穿透细胞的能力，其透皮能力远高于线型tat，且ctat长时间作用于细胞对细胞活力无明显影响。寡肽-5是一种具有抗皱和美白皮肤的美容肽，由原核表达系统(e.coli)重组表达制备，由169个氨基酸残基组成的非糖基化多肽，分子量为19.2kda。
7.寡肽-5(oligopeptide-5，简称peptide-5)由原核表达系统重组表达制备，由169个氨基酸残基组成的非糖基化多肽，分子量为19.2kda。寡肽-5是一种具有抗皱和美白皮肤的美容肽。
8.许多化学渗透增强剂被用来试图打开皮肤屏障，但大多数效果不理想。如果没有物理方法的帮助，化学透皮增强剂难以有效地将亲水性药物(特别是分子量大于500da的药物)通过未破坏的皮肤进入到血液循环，并达到治疗所需的血药水平；现有的化学透皮增强剂容易导致皮肤损伤、过敏、发炎、过敏、系统毒性等，对大分子无效需仪器辅助的缺点，在使用上受到很大限制；常用的物理方法有离子电渗、微针等，以证明对多种药物分子具有增进透皮的效果，但物理方法有很多不足，包括使用特别仪器，成本高，剂型灵活性差等，物理促透法成本高，不便携带，长期使用易导致角质层变薄、易引起皮肤感染，而且在不同程度上有疼痛感，不适合家庭使用等。


技术实现要素：

9.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供透皮肽寡肽-5融合多肽及其制备方法。
10.本发明提供了一种融合多肽，其包括ctat和peptide5。
11.本发明对提供的融合多肽中ctat和peptide5的连接顺序不做限定。一些实施例中n端到c端连接顺序是ctat、peptide5。本发明将ctat与peptide5融合表达中间没有linker。其中，ctat是环化的，形成融合多肽以后ctat-寡肽-5融合多肽具有低毒性、高细胞穿透性等特性。
12.具体的，本发明所述融合多肽具有如seq id no.1所示的氨基酸序列：cygrkkrrqrrrchkyiltyilptllyrscfhiiclvgyislacndmtpeqmatnvncssperhtrsydymeggdirvrrlfcrt。
13.本发明所述融合多肽中，ctat的氨基酸序列为:cygrkkrrqrrrc(seq id no.3)。peptide5的氨基酸序列为:
14.hkyiltyilptllyrscfhiiclvgyislacndmtpeqmatnvncssperhtrsydymeggdirvrrlfcrt(seq id no.4)。
15.本发明还提供了：编码本发明所述的融合多肽的核酸。
16.本发明中，编码所述的融合多肽的核酸的序列为：tgttacggccgtaagaaacgccgacagcgtcgccggtgccacaaatacattctgacctacattctgccgaccctgctgtatcgcagctgcttccacataatttgcctagttggttacatctccctggcttgtaatgatatgacacccgaacaaatggccacgaacgtcaattgctcatcgccagagcgccatactcgaagttatgactacatggaaggcggagatatacgggtaagacggttattctgtcgtacc(seq id no.2)。
17.本发明还提供了一种表达载体，其包括骨架载体和本发明所述的核酸。
18.本发明所述的表达载体为质粒载体，所述表达载体包括但不限于pet系列载体。一些实施例中，所述表达载体的骨架载体包括pet28a质粒。其中pet28a质粒是用于核酸片段的扩增、存储以及蛋白的表达。其中核酸片段的插入位点为多克隆位点not i与bamh i之间。
19.本发明除了使用所述pet28a表达载体，还做了其他载体，但表达效果不理想，例如，本发明尝试使用感受态如rosetta与bl21(de3)plys作为表达载体，但是表达效果也不理想。
20.本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主。
21.本发明所述宿主包括质粒载体的存储宿主，或者所述融合多肽的表达宿主。本发明实施例中，所述宿主为细菌、真菌或动物细胞。一些实施例中，所述的宿主为细菌。一些具体实施例中，所述包括大肠杆菌。具体的，本发明以大肠杆菌bl21 de3作为表达融合多肽的宿主。
22.本发明所述宿主的构建方法包括将本发明所述的质粒载体转化入大肠杆菌感受态，经复苏构建融合多肽的表达宿主。
23.本发明还提供了所述融合多肽的制备方法，其包括培养所述的宿主，获得含有所述融合多肽的培养物。
24.本发明所述的培养基为lb液体培养基(加入抗生素kana 50mg/ml)，培养温度为26℃～37℃。
25.本发明所述培养后，还包括诱导蛋白表达的步骤。所述诱导的诱导剂为iptg。在一些实施例中，iptg诱导融合多肽表达的浓度为0.1mm～1.5mm。
26.本发明所述多肽融合表达的蛋白标签包括his tag。
27.本发明所述融合多肽的制备方法，还包括对培养物纯化获得融合的蛋白的步骤。本发明所述方法制备的融合多肽带有纯化标签，所述纯化标签为his tag；所述融合多肽的纯化方式包括镍柱纯化，所述纯化方法的柱填料为ni

柱，咪唑梯度洗脱。
28.本发明还提供了所述的融合多肽、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主、所述制备方法制得的融合多肽，和/或所述制备方法制得的含有所述融合多肽的培养物在制备抗皱和/或美白的产品中的应用。
29.本发明所述的融合多肽在治疗皮肤褶皱时，可以使有褶皱的皮肤光滑有光泽，并且褶皱慢慢淡化消失；还可以使新皮肤光滑细腻有光泽的周期延长。在发挥美白作用时，可以使晒黑或者由色素沉淀变黑变黄的皮肤逐渐变白，并且维持皮肤白净润滑有光泽的状态，不易变黑变黄。
30.本发明提供了一种抗皱和/或美白产品，其包括所述的融合多肽。
31.ctat成环使其具有优越的穿透细胞的能力，其透皮能力远高于线型tat。tat以其低毒性及高细胞穿透性应用最为广泛。且主链环化有助于提高易位能力，且实验证明ctat长时间作用于细胞对细胞活力无影响。因此ctat被筛选作为本发明的目标透皮肽小分子。本发明将三者融合作为融合多肽，而不是简单混合是因为这样做，提高了蛋白表达量和可溶性，具有更好的生物亲和性，低毒性和无刺激性、高细胞穿透性等特性不会导致皮肤过敏及损伤、药物与材料有良好的相容性、具有稳定的理化性质、起效时间快、作用时间长。
32.本发明所述ctat，其成环的原理是通过半胱氨酸形成二硫键，在碱性且非还原条件下其二硫键即可成环，一步即可实现，在本发明中，蛋白纯化过程使用的体系为碱性非还原条件，在该步骤中可实现ctat的成环。
33.本发明所述产品包括化妆品、药品、保健品和食品。剂型包括注射剂和口服剂；
34.所述化妆品，包括化妆品基质和融合多肽；所述药品，包括融合多肽和药学上可接受的辅料；所述保健品，包括融合多肽和保健品中可接受的辅料；所述食品，包括融合多肽和食品中可接受的辅料。
35.本发明还提供了一种抗皱、美白的方法，给予本发明所述的产品。所述给予的方式包括贴敷、涂抹、针灸、按摩等。
36.本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及透皮肽寡肽-5融合多肽及其制备方法。本发明所述透皮给药系统具有易操作、损伤小等优点，避免了胃肠道和肝脏的消化和降解作用。透皮肽-寡肽-5融合表达系统的建立既使ctat的透皮功能得到发挥，又促进该融合多肽穿透皮肤进入细胞进而发挥抗皱和美白的功效。其具有无刺激性、不会导致皮肤过敏及损伤、药物与材料有良好的相容性、稳定的理化性质、起效时间快、作用时间长的优点。透皮肽种类虽多，但tat以其低毒性及高细胞穿透性应用最为广泛，主链环化有助于提高易位能力，且长时间作用于细胞对细胞活力无影响。本发明的融合多肽具有低毒性、高细胞穿透性等，具有更大的开发应用价值和市场前景。
buffer 50μl～200μl,80℃～120℃沸水煮5min迅速冰上冷却，瞬时离心。sds-page检测蛋白是否表达。8％～16％预制胶，上样量10μl～30μl，120v～200v，30min～60min。
54.实施例2基于皮肤模型透皮肽渗透性功效评价
55.本次试验基于3d表皮模型采用表面给药方式，将样品均匀涂抹于模型表面，经不同时间孵育后收取模型组织及培养液。利用荧光显微镜观察的方法可视化观察待测样品的渗透性，同时，采用荧光酶标仪检测培养液中待测样品的渗透量，进而综合判断样品的渗透能力。测试系统：本次测试所用模型为3d皮肤模型批号：es210405(广东博溪)。主要试剂：pbs(博士德)、epirecovery培养液(广东博溪)。主要设备：co2培养箱(thermo，150i)、超净工作台(苏州安泰，sw-cj-1f)、荧光显微镜(olympus)、多功能酶标仪(珀金埃尔默)。
56.样品信息如表1所示：
57.表1：待测样品信息
58.样品名称样品类别样品状态溶解性储存条件有效期寡肽-5、透皮肽-寡肽-5原料粉末水溶低温保存/
59.表2：渗透性及功效检测
[0060][0061]
工作液配制
[0062]
样品配制：
[0063]
p5：称取3.75mg样品p加入到0.3ml的pbs中充分溶解；
[0064]
t-p5：称取4.53mgt-p(等摩尔数)样品加入到0.3mlpbs中，两组样品溶液摩尔浓度相同。
[0065]
实验步骤：
[0066]
1)根据表2试验设计，将模型转移到6孔板中(提前添加3.7ml相应分组的epirecovery培养液)，在6孔板上标注测试组编号。
[0067]
2)取配置好的样品工作液25μl加于模型表面，用镊子夹取尼龙膜覆盖在每个模型表面，使样品均匀分布于模型表面，置于co2培养箱(37℃、5％co2)中，分别孵育1h，2h，8h。
[0068]
3)渗透检测
[0069]
给药孵育结束后，收集培养液于ep管中，收集完后将用于渗透量检测的样品置于4℃冰箱保存，第二天荧光酶标仪检测；同时，收集3d皮肤模型于ep管中，每管加入1ml多聚甲醛，室温固定，冰冻切片后荧光显微镜拍照。
[0070]
实验结果
[0071]
孵育培养结束后进行冰冻切片荧光检测及测量渗透量，结果汇总见表3和图8。
[0072]
表3：荧光强度值汇总表
[0073]
样品名称平均荧光强度sdbc10906.0078.08p5-1h55916.672719.29t-p5-1h164141.3311333.47p5-2h93120.002388.39t-p5-2h295334.3322701.83p5-8h237328.675239.99t-p5-8h781895.6725982.63
[0074]
备注：用t-test方法进行统计分析时，样品组与bc组相比，显著性以*表示，p-value＜0.05表示为*，p-value＜0.01表示为**。
[0075]
表4：渗透浓度结果汇总表
[0076][0077]
备注：检测各组的荧光强度，用样品稀释液作为标准品，计算各组的绝对渗透浓度。绝对渗透浓度＝固定时间点样品组对应浓度平均值-相应时间点bc组浓度平均值。
[0078]
表5：渗透量结果汇总表
[0079]
样品名称平均渗透量(μg)sdbc00p5-1h0.360.02t-p5-1h1.300.10p5-2h0.690.02t-p5-2h2.410.20p5-8h1.910.06t-p5-8h6.540.22
[0080]
备注：绝对渗透量＝平均渗透浓度
×
液体总体积(3.7ml)。
[0081]
样品作用于3d表皮模型1h后，p5的渗透量为0.36μg，t-p5的渗透量为1.30μg；作用2h后，p5组的渗透量为0.69μg，t-p5的渗透量为2.41μg；作用8h后，p5的渗透量为1.91μg，t-p5的渗透量为6.54μg。
[0082]
结论
[0083]
基于3d表皮模型渗透实验结果显示，样品p5作用1h、2h和8h后，渗透量分别是0.36μg、0.69μg和1.91μg；样品t-p5作用1h、2h和8h后，渗透量分别是1.30μg、2.41μg和6.54μg。两组样品作用3d表皮模型相同时间(1h、2h和8h)，tp-5融合多肽的渗透量明显高于p5组。
[0084]
综上所述，样品p5和t-p5均发生了一定的渗透行为，且随着时间的增加，样品渗透量不断增加，且t-p5的融合表达显著提升了p5的的渗透性。
[0085]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。