一种与黄瓜成株期耐热相关的SNP标记、引物组、试剂盒及应用的制作方法

一种与黄瓜成株期耐热相关的snp标记、引物组、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学辅助育种技术领域，具体涉及一种与黄瓜成株期耐热相关的snp标记、引物组、试剂盒及应用。


背景技术：

2.黄瓜(cucumissativus l.)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜原产于热带地区，但对高温敏感。黄瓜生长的最适温度是白天25～28℃，夜间15～20℃。随着全球气温升高，黄瓜在生产中更容易受到热胁迫。夏季露天栽培温度往往超过35℃，容易造成黄瓜叶片晒伤，茎、根生长迟缓，果实畸形甚至植株死亡，严重影响了黄瓜产量和果实品质。研究黄瓜成株期耐热性的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义。
3.目前，关于黄瓜成株期耐热性的遗传规律还未见报道，黄瓜耐热性研究多集中在苗期。杨寅桂利用耐热自交系“poinsett 97”和不耐热自交系“boothbyls blonde”鉴定出了1个与黄瓜幼苗期耐热相关的ssr标记，该成果在2007年被记录在南京农业大学硕士论文《黄瓜耐热性及热胁迫响应基因研究》中。杨迪菲以相对电导率为指标，鉴定出与黄瓜苗期耐热性相关的4个ssr和7个rapd标记，该成果在2006年被记录在东北农业大学硕士论文中。庄影在5号染色体上鉴定出1个与黄瓜苗期耐热性相关的qtl，表型变异率为11％，该成果在2014年被记录在扬州大学硕士论文《黄瓜耐热性遗传及qtl初步定位》。研究表明，
‘
l-9’(耐热)黄瓜幼苗的耐热性是由第1染色体上的一个单基因控制的，该基因两侧分别是indel-h90和indel-h224，在王敏等人于2019年在《hortscience》第54期第423-428页上发表的文章《genetic analysis and related gene primary mapping of heat stress tolerance in cucumber using bulked segregant analysis》中也有记载。董邵云等(2020)鉴定出6个与黄瓜苗期耐热性相关的qtl，包括qht3.1、qht3.2、qht3.3、qht4.1、qht4.2和qht6.1，其中qht3.2表型解释率为28.3％，该成果被记载在《plants》杂志第9期第9卷1155页《identification of quantitative trait loci controlling high-temperature tolerance in cucumber(cucumis sativus l.)seedlings》中。然而，在这些苗期耐热研究中，还没有开发出与耐热基因紧密连锁的分子标记，也没有克隆到相关基因。此外，也尚未有与黄瓜成株期耐热性相关的研究报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与黄瓜成株期耐热相关的snp标记、引物组、试剂盒及应用，本发明的snp标记与黄瓜成株期耐热基因csht紧密连锁。
5.本发明提供了一种与黄瓜成株期耐热相关的snp标记，核苷酸序列如seq id no.1所示，所述seq id no:1的第190位存在t/c多态性。
6.本发明还提供了一种用于检测上述方案所述snp标记的引物组，正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
7.本发明还提供了一种用于检测上述方案所述snp标记的试剂盒，包括上述方案所述的引物组和pcr扩增用试剂。
8.本发明还提供了上述方案所述的snp标记或者所述的引物组或者上述方案所述的试剂盒在耐热黄瓜品种选育中的应用。
9.本发明还提供了上述方案所述的snp标记或者所述的引物组或者所述的试剂盒在鉴定或筛选耐热黄瓜中的应用。
10.本发明还提供了一种鉴定或筛选耐热黄瓜的方法，包括以下步骤：
11.1)提取待测黄瓜的基因组dna；
12.2)以所述待测黄瓜的基因组dna为dna模板，采用上述方案所述的引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
13.3)对所述pcr扩增产物进行测序；或者，对所述pcr扩增产物进行sspi酶切，得到酶切产物，所述酶切产物经凝胶电泳分离后，观察带型；
14.当对所述pcr扩增产物进行测序时，若所述pcr扩增产物的190位碱基为t，则待测黄瓜为耐热材料，若所述pcr扩增产物的190位碱基为c，则待测黄瓜为不耐热材料；
15.当对所述pcr扩增产物进行sspi酶切，得到酶切产物，所述酶切产物经凝胶电泳分离后，观察带型时，若sspi酶切的酶切片段的大小为187bp，则待测黄瓜为耐热材料，若sspi酶切的酶切片段的大小为241bp时，则待测黄瓜为不耐热材料。
16.优选的，所述pcr扩增的反应体系以10μl计，包括：7.5ng dna模板，所述正向引物和所述反向引物各50ng，5μl 2*3g taq master mix for page和余量的双蒸水。
17.优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟。
18.优选的，所述sspi酶切的体系以10μl计，包括：pcr扩增产物3μl，内切酶0.2μl，nebuffer 3.11μl和双蒸水5.8μl；所述sspi酶切的温度为37℃；所述sspi酶切的时间为2h。
19.优选的，所述凝胶电泳采用质量浓度为6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶；所述凝胶电泳的功率为150v恒功率；所述凝胶电泳的时间为70min。
20.本发明提供了一种与黄瓜成株期耐热相关的snp标记，核苷酸序列如seq id no.1所示，所述seq id no:1的第190位存在t/c多态性；当所述snp标记的190位碱基为t时，待测黄瓜为耐热材料；当所述snp标记的190位碱基为c时，待测黄瓜材料为不耐热材料。本发明不仅为黄瓜成株期耐热性的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育耐热的黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明利用62份黄瓜核心种质材料进行验证，结果标记csht-snp1用于分子标记辅助选择的正确率在不耐热品系中的准确率为97.8％，在耐热品系中的准确率为62.5％。
附图说明
21.图1是snp标记csht-snp1对黄瓜亲本材料
‘
02465’(p1)，
‘
k18’(p2)，f1世代单株的检测结果；p1：02465(耐热)；p2:k18(不耐热)；
22.图2是snp标记csht-snp1在62份核心种质群体中的检测结果。
具体实施方式
23.本发明提供了一种与黄瓜成株期耐热相关的snp标记，核苷酸序列如seq id no.1所示，所述seq id no:1的第190位存在t/c多态性。
24.在本发明中，seq id no.1所示核苷酸序列具体为：
25.gcagtgtattattacgtggtgtatcgttcactttatatgttataagatacatcacaattaagtttaattgtttttttttttactttttctcttgtttttgtttcgttgtttatttcataataataagaaaaaaaaaaagacccgttttgtttctgtgattcaactcttaaaacagtatataaaaaatatstttattttttttaaaaaaaaagttaaagtctataagtaccactttcgtttc，其中s为190位碱基，所述s为t或c。
26.当所述snp标记的190位碱基为t时(核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为：gcagtgtattattacgtggtgtatcgttcactttatatgttataagatacatcacaattaagtttaattgtttttttttttactttttctcttgtttttgtttcgttgtttatttcataataataagaaaaaaaaaaagacccgttttgtttctgtgattcaactcttaaaacagtatataaaaaatatttttattttttttaaaaaaaaagttaaagtctataagtaccactttcgtttc)，待测黄瓜为耐热材料；当所述snp标记的190位碱基为c时(核苷酸序列如seq id no.3所示，具体为：gcagtgtattattacgtggtgtatcgttcactttatatgttataagatacatcacaattaagtttaattgtttttttttttactttttctcttgtttttgtttcgttgtttatttcataataataagaaaaaaaaaaagacccgttttgtttctgtgattcaactcttaaaacagtatataaaaaatatctttattttttttaaaaaaaaagttaaagtctataagtaccactttcgtttc)，待测黄瓜材料为不耐热材料。
27.本发明的snp标记以耐热自交系
‘
02465’和不耐热自交系
‘
k18’为材料开发。
28.采用本发明获得的snp标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断是否成株期耐热，对其进行植株成株期耐热材料的筛选。该标记具有高效、限制少的优点，提高了选育耐热黄瓜材料的效率，缩短了育种周期。
29.本发明还提供了一种用于检测上述方案所述snp标记的引物组，正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，具体为：gcagtgtattattacgtggtgt；反向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，具体为：gaaacgaaagtggtacttatagac。
30.本发明还提供了一种用于检测上述方案所述snp标记的试剂盒，包括上述方案所述的引物组和pcr扩增用试剂。在本发明中，所述pcr扩增用试剂优选的包括2*3g taq master mix for page和双蒸水；所述2*3g taq mastermix forpage优选为2*3g taqmastermix forpage，red dye。在本发明中，所述扩增用试剂优选的还包括sspi酶。
31.本发明还提供了上述方案所述的snp标记或者所述的引物组或者所述的试剂盒在黄瓜分子育种中的应用。
32.在本发明中，所述黄瓜分子育种优选的包括鉴定黄瓜的耐热性和/或选育耐热的黄瓜品种。
33.本发明还提供了一种鉴定黄瓜的耐热性和/或选育耐热的黄瓜的方法，包括以下步骤：
34.1)提取待测黄瓜的基因组dna；
35.2)以所述待测黄瓜的基因组dna为dna模板，采用上述方案所述的引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
36.3)对所述pcr扩增产物进行测序；或者，对所述pcr扩增产物进行sspi酶切，得到酶切产物，所述酶切产物经凝胶电泳分离后，观察带型；
37.当对所述pcr扩增产物进行测序时，若所述pcr扩增产物的190位碱基为t，则待测黄瓜为耐热材料，若所述pcr扩增产物的190位碱基为c，则待测黄瓜为不耐热材料；
38.当对所述pcr扩增产物进行sspi酶切，得到酶切产物，所述酶切产物经凝胶电泳分离后，观察带型时，若sspi酶切的酶切片段的大小为187bp，则待测黄瓜为耐热材料，若sspi酶切的酶切片段的大小为241bp时，则待测黄瓜为不耐热材料。
39.本发明首先提取待测黄瓜的基因组dna。本发明对所述提取待测黄瓜的基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法或者试剂盒即可。
40.得到待测黄瓜的基因组dna后，本发明以所述待测黄瓜的基因组dna为dna模板，采用上述方案所述的引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
41.在本发明中，所述pcr扩增的反应体系以10μl计，优选的包括：7.5ng dna模板，所述正向引物和所述反向引物各50ng，5μl 2*3g taq master mix for page和余量的双蒸水。
42.在本发明中，所述pcr扩增的程序优选为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟；所述pcr扩增产物的保存温度优选为10℃。
43.得到pcr扩增产物后，本发明对所述pcr扩增产物进行测序；或者，对所述pcr扩增产物进行sspi酶切，得到酶切产物，所述酶切产物经凝胶电泳分离后，观察带型；当对所述pcr扩增产物进行测序时，若所述pcr扩增产物的190位碱基为t，则待测黄瓜为耐热材料，若所述pcr扩增产物的190位碱基为c，则待测黄瓜为不耐热材料；当对所述pcr扩增产物进行sspi酶切，得到酶切产物，所述酶切产物经凝胶电泳分离后，观察带型时，若sspi酶切的酶切片段的大小为187bp，则待测黄瓜为耐热材料，若sspi酶切的酶切片段的大小为241bp时，则待测黄瓜为不耐热材料。
44.在本发明中，所述sspi酶切的体系以10μl计，优选的包括：pcr扩增产物3μl，内切酶0.2μl，nebuffer 3.11μl和双蒸水5.8μl；所述sspi酶切的温度为37℃；所述sspi酶切的时间为2h。
45.在本发明中，所述凝胶电泳优选的采用质量浓度为6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶；所述凝胶电泳的功率优选为150v恒功率；所述凝胶电泳的时间优选为70min；所述凝胶电泳后优选的采用银染染色。
46.在本发明中，sspi酶切的酶切片段的大小为187bp的核苷酸序列如seq id no.6所示，具体为：
47.gcagtgtattattacgtggtgtatcgttcactttatatgttataagatacatcacaattaagtttaattgtttttttttttactttttctcttgtttttgtttcgttgtttatttcataataataagaaaaaaaaaaagacccgttttgtttctgtgattcaactcttaaaacagtatataaaaaat。
48.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
49.本发明的实施例中所用的试验材料为
‘
02465’(p1)，
‘
k18’(p2)以及由双亲构建的rils群体；验证材料是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组保存的62份核心种质群体材料，包括华北类型，欧洲温室型，以及华北类型和欧洲温室型的杂交种等。
50.‘
02465’为华北密刺型黄瓜，对热胁迫耐受。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2008年6月在《中国蔬菜》第6期发表的文章《耐热黄瓜新品种中农106号的选育》中也有记
载。中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
51.‘
k18’为华北密刺型黄瓜，对热胁迫敏感。为现有已知品种，在张圣平等人于2011年在《中国农业科学》第44卷第17期第3584-3593页上发表的文章《黄瓜白粉病抗性基因的qtl定位》中也有记载。中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
52.引物组(caps-sspi-f和caps-sspi-r)是基于重测序的基因组信息、利用caps finder软件和primer 3.0软件设计，并在北京生工公司合成。重测序的基因组信息详见qi等在《nature genetics》杂志2013年发表的论文《a genomic variation map provides insights into the genetic basis ofcucumber domestication and diversity》。
53.pcr扩增使用vazyme公司的2*3g taq master mix for page(red dye)；酶切使用nebuffer 3.1的限制性内切酶sspi；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
54.实施例1用于检测黄瓜成株期耐热性snp标记csht-snp1的获得
55.步骤1.rils群体成株期耐热性的鉴定
56.以中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组保存的86个株系的rils群体为试验材料，对其进行自然高温处理，根据植株第8-10片的叶片受害程度进行分级(魏爽等，2019)并计算热害指数。根据rils群体热害指数的频率分布呈现非典型的双峰分布，表明在rils群体中成株期耐热性受主效qtl控制。
57.步骤2.qtl定位
58.利用86份试验材料的基因型数据及表型数据进行qtl分析，利用joinmap和mapqtl软件进行分析，绘制qtl定位图。
59.步骤3.snp标记的开发及其应用
60.由初定位结果分析得，在1号染色体有一个非常主效的qtl，在侧翼标记ssr23757处继续加密标记，用primer 6.0软件设计前后引物。
61.步骤4.dna提取和pcr扩增(验证群体)
62.取黄瓜植株的嫩叶，用改良的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本
‘
02465’(p1)，
‘
k18’(p2)及f1、核心种质各单株的基因组dna。
63.caps标记pcr反应体系为：总反应体系10μl，2μl dna(5.0ng
·
μl-1
)，正向和反向引物(50ng
·
μl-1
)各1μl，1μlh2o，5μl 2*3g taq master mix forpage(red dye)(vazyme公司产品)。
64.pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存forever。
65.sspi完全酶切pcr产物
66.酶切体系为：pcr产物3μl，内切酶0.2μl，nebuffer1μl，双蒸水5.8μl。酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
67.步骤5.结果判定
68.方法一：跳过步骤2，不经过酶切，将pcr产物直接测序。
‘
02465’(耐热)所得序列在第190位碱基为t；
‘
k18’(不耐热)所得序列在190位碱基为c；f1所得序列该位置有两种碱
基，t和c同时存在。
69.方法二：经过内切酶完全酶切，酶切产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5
×
tbe，150v恒功率电泳分离70min，电泳后银染显色，统计带型。
70.‘
02465’(耐热)得到一个为187bp的片段，条带带型记为a；
‘
k18’(不耐热)得到一个241bp的片段条带带型记为b；f1中两个条带同时检测到，条带带型记为h。
71.实施例2.与黄瓜成株期耐热基因csht连锁的snp标记的验证
72.利用中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组保存的62份核心种质材料，对实施例1获得的与csht基因连锁的标记csht-snp1进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性，步骤如下：
73.(1)提取待测样品基因组dna；
74.(2)以所述待测样品基因组dna为模板，以权利要求1所述的引物进行pcr扩增；
75.(3)对pcr扩增片段进行测序或sspi酶切；
76.如果测序结果如seq id no.2所示，黄瓜材料为耐热材料，如果测序结果如seq id no.3所示，黄瓜材料为不耐热材料；
77.如果酶切后片段为187bp，黄瓜材料为耐热；如果酶切后片段为241bp，黄瓜材料为不耐热材料。
78.caps标记pcr反应体系为：总反应体系10μl,3μl dna(5.0ng
·
μl-1
)，正向和反向引物(50ng
·
μl-1
)各1μl，5μl 2*3g taq mastermix forpage(red dye)(vazyme公司产品)。
79.pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存forever。
80.sspi完全酶切pcr产物
81.酶切体系为：pcr产物3μl，内切酶0.2μl，nebuffer1μl，双蒸水5.8μl。酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
82.经和所选材料的田间表现型相比，标记在62份核心种质材料带型反映的表型数据与田间调查结果有55份一致，经计算标记csht-snp1用于分子标记辅助选择的正确率在不耐热品系中的准确率为97.8％。扩增条带见图2。
83.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。