一种永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系及其构建和应用

1.本发明涉及一种细胞系及其构建方法，具体涉及一种永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系及其构建和应用。


背景技术：

2.牦牛是一种生活在海拔3千米以上寒冷高原上的牛科动物，中国拥有的牦牛为我国独有的珍贵基因资源。中国几乎所有的牦牛都分布在整个青藏高原，尤其是甘肃、青海和西藏。牦牛是甘肃、青海和西藏最重要的驯化动物之一。根据《中国家畜家禽品种志》目前我国有12个官方认可的家养牦牛品种，包括四川的九龙牦牛、麦洼牦牛，甘肃的天祝白牦牛、甘南牦牛，西藏的八里牦牛、嘉里牦牛、四步牦牛，青海的环湖牦牛、高原牦牛、长毛额牦牛、新疆的霸州牦牛以及云南的中甸牦牛。牦牛除了是当地牧民最主要的经济来源和生活支柱，还与当地的文化、宗教、社会生活紧密联系。牦牛因其特殊的生物学特征、经济特征和分布特点，不管是营养，育种或是遗传方面，动物生产研究较多，然而这些研究涉及细胞层面的报道非常有限。牦牛相关的细胞系也是及其有限。从我国种质资源保存的实际出发，构建重要的牦牛种群的细胞系的方式保存其基因资源，也是具有重要意义的。
3.成纤维细胞是结缔组织中最常见的多功能细胞，间充质组织的重要组成部分，通常保持静息状态，仅在组织受损后发生组织重塑和修复期间获得暂时的活性，之后会凋亡或恢复到休眠状态。己知成纤维细胞的主要功能之一是合成胶原蛋白及其他细胞外基质，在组织器官纤维化过程中发挥重要作用。瘤胃是反刍动物消化系统最主要的器官，也是机体的免疫系统重要的组成部分。胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和外膜四层组成，并有神经、血管和淋巴管的分布。其中成纤维细胞主要分布于粘膜层中的固有层、黏膜下层和外膜层。成纤维细胞具有较强的异质性，而且对于维持组织稳态至关重要。成纤维细胞的来源对侵袭转移，器官生长，血管生成，基质重塑，免疫调节等方面的研究非常重要，也具有研究价值。成纤维细胞较大，轮廓清晰，大多数为突出的纺锤形或者星形的扁平状结构，细胞核规则椭圆形，核仁大而明显，细胞。电镜下，成纤维细胞胞质内可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和高尔基复合体，表明其具有合成和分泌蛋白质的功能。
4.成纤维细胞的分离培养主要用于研究细胞的老化，各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。目前在不同物种不同部位器官组织已有部分研究，特别的一些成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到广泛的应用，而对于牦牛相关的成纤维细胞系的研究仍未有突出报道。分离培养的原代细胞虽然相对成熟，但有其极大的缺陷，有限的生命代数也将制约着对其体外试验的研究进展。牦牛瘤胃成纤维细胞水平解析牦牛机体相关器官功能的研究鲜有报道。最主要的原因是牦牛种类细胞分离及培养技术尚不成熟。成纤维细胞具有多向分化潜能，人类皮肤成纤维细胞经不同转录因子处理后，可转化为具分化能力的多功能干细胞，如：脂肪细胞、内皮细胞、软骨细胞、肌腱细胞以及神经细胞等。然而牦牛瘤胃成纤维细胞系的增殖、功能、分化等机制或潜能尚不明确。利用原代培养的细胞进行研究可保证不受体内血流动力学等
其他因素的影响，也可通过药物等处理控制其他影响因素，为研究各种生理病理过程提供基础。
5.细胞永生化有望从根本上解决牦牛供体短缺的问题，是目前国际上研究的热点。为了使正常的原代细胞获得能在体外培养增殖的特性，构建逆转录病毒载体，将永生化基因转导入细胞内，永生化了原代细胞依旧能够保持其生理生化特征。永生化的定义是体外培养的二倍体细胞在自发的或受外界因素影响的条件下从增殖衰老危机中逃脱，具备无限增殖能力的过程。而在自发条件下，二倍体细胞发生永生化的机率非常小。因此为了研究的需要，学者将外源性永生化基因通过质粒转染等方法引入细胞内，经过筛选后获得稳定表达永生化基因的细胞株，从而实现细胞的永生化。
6.sv40t是目前国际上常用的用于细胞体外永生化转染的目的基因。sv40 病毒属乳多空病毒科，多瘤病毒属，其基因组包括5224bp，为双股环状dna，在病毒dna复制前编码两种转化蛋白，即大t抗原和小t抗原。tag是一种磷酸化蛋白，在细胞转化中起决定性作用，并被广泛应用于转基因动物肿瘤模型的建立研究。sv40t基因能够影响端粒长度和激活端粒酶活性。端粒是由位于真核生物染色体3’末端富含鸟嘌呤的dna重复序列和相关蛋白组成，端粒酶的激活和端粒长度的稳定性与细胞复制衰老和永生化存在密切关系。端粒酶的激活可以使端粒长度保持稳定进而使得染色体保持稳定，介导细胞永生化。我们通过慢病毒介导的方法，成功的使牦牛瘤胃成纤维细胞永生化，经过基因及蛋白水平的检测，证实了永生化基因sv40t及其表达产物的存在，体外实验证实该细胞株的功能稳定，可以用于后续的研究。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系及其构建和应用，该细胞系的建立为解决原代瘤胃成纤维细胞培养难、传代次数有限的缺陷，丰富了牦牛源细胞系库，也可为生命科学相关领域以及疫苗生产等科研研究提供主要原材料。
8.为了达到上述目的，本发明提供了一种永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.c2021253。
9.本发明还提供了一种永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系的构建方法，包括如下步骤：
10.s1.样本预处理：将牦牛瘤胃上皮组织用含抗生素的洗液清洗干净并剪碎；
11.s2.酶消化及培养：用消化酶处理组织，收集上层消化液并进行终止消化，离心收集细胞沉淀，用完全培养基分散细胞沉淀并接种到培养瓶中进行常规细胞培养；同时，将酶消化后的组织于培养瓶中间隔放置，加入完全培养基进行培养；待细胞长至70％～80％时进行传代培养，用胰蛋白酶-edta 溶液消化1～2min，终止消化后离心收集细胞沉淀，再用含碱性成纤维细胞生长因子的完全培养基重悬细胞沉淀，所得的细胞为成纤维细胞；
12.s3.慢病毒感染：当传代的成纤维细胞长至40％～50％时，将慢病毒用聚凝胺和含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的完全培养基进行稀释，并加入细胞中进行感染并过夜，每2天更换培养基，持续培养4d；
13.s4.细胞系筛选：待细胞长到20％～30％时，加入嘌呤霉素进行筛选，每2天更换含嘌呤霉素的完全培养基，持续培养4d；
14.s5.扩大培养和传代：将筛选的细胞经20代以上的常规传代培养，所获得的细胞系即为牦牛瘤胃成纤维细胞系。
15.其中，完全培养基包含基础培养基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素和 100u/ml链霉素。
16.其中，上述试剂均为无菌试剂，上述操作均为常规无菌操作。
17.优选地，上述的消化酶为2％胰蛋白酶和分散酶以10:1的体积比混合的混合液。
18.优选地，上述的基础培养基为rpmi 1640或dmem/f-12。
19.优选地，上述的的慢病毒为包含sv40t慢病毒载体。
20.本发明提供的细胞系在生命科学领域中的应用。
21.优选地，该细胞系可用于疫苗的研究和生产。
22.本发明的一种永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系及其构建和应用，解决了原代瘤胃成纤维细胞培养难、传代次数有限的缺陷等问题，并具有以下优点：
23.本发明中细胞系的构建方法操作简便，构建的细胞系稳定、可靠，丰富了牦牛源细胞系库，填补了牦牛成纤维细胞相关研究试验材料的空白，也为牦牛成纤维细胞系诱导分化成为牦牛脂肪细胞、成骨细胞等提供细胞模型，也可为生命科学相关领域以及疫苗生产等科研研究提供主要原材料。
24.本发明在对慢病毒感染复数最佳剂量和嘌呤毒素筛选最佳浓度的探究中设置多种感染复数(moi)和对嘌呤毒素浓度进行探索，筛选出最后存活的细胞，减少试验的盲目性，防止某一浓度的慢病毒感染复数或者嘌呤毒素浓度不合适导致试验失败。
25.本发明构建的牦牛成纤维细胞系具有较强的增殖能力，呈现成纤维细胞形态，细胞传代30代以上，仍然保持成纤维细胞形态特点和生长特性。
附图说明
26.图1为牦牛瘤胃成纤维原代细胞显微镜镜检图(200x)。
27.图2为永生化牦牛瘤胃成纤维细胞系显微镜镜检图(200x)。
28.图3为β-半乳糖苷酶染色的永生化牦牛瘤胃成纤维细胞系显微镜镜检图(200x)。
29.图4为永生化牦牛瘤胃成纤维细胞系的免疫荧光鉴定结果图。
30.图5为永生化牦牛瘤胃成纤维细胞系的生长曲线结果图。
具体实施方式
31.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.主要试剂
33.rpmi-1640培养基(含l-谷氨酰胺和hepes)、胎牛血清、分散酶(gibco 公司)；pbs、青霉素、链霉素、胰蛋白酶-edta溶液(0.25％:0.02％)(索莱宝)；bfgf(rd公司)；洗必泰、嘌呤霉素puromycin、聚凝胺polybrene (sigma)；sv40t慢病毒包装(云舟生物)；cck-8(abmole公司)；波形蛋白(vimentin)一抗、sv40t一抗(abcam公司)；triton-100、4％多聚甲
醛、山羊血清、cy3标记山羊抗小鼠igg(h l)、dapi染色液、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(beyotime公司)；其他试剂均为试验室常规试剂。
34.实施例1
35.(1)原代培养：将牦牛瘤胃上皮组织，剥离干净脂肪、血管、肌肉等其他的组织，将瘤胃上皮组织使用pbs(含有400u/ml青霉素和400u/ml链霉素)清洗两次后，置于洗必泰溶液5min，再使用pbs清洗干净，剪取干净的牦牛瘤胃上皮组织放入50ml离心管中，使用无菌手术剪刀尽量剪碎，使用2％胰蛋白酶和分散酶以10:1的体积消化30min后，收集上层消化液并使用rpmi 1640完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml 链霉素)终止消化，以1000rpm/5min离心细胞悬液，收集细胞沉淀，添加 pbs(含100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)使用移液器轻轻吹打均匀细胞沉淀进行清洗两次。之后添加rpmi 1640完全培养基(含10％胎牛血清， 100u/ml青霉素，100u/ml链霉素和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子) 使用移液器轻轻吹打均匀细胞沉淀成细胞悬液，接种到细胞培养瓶中，放置到37℃(21％o
2-5％co2)细胞培养箱中孵育，培养50min后将培养瓶中上层培养液去除，置换新的完全培养基。同时胰蛋白酶消化后的组织块添加 rpmi 1640完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)浸泡组织块，使用眼科镊将组织块送入培养皿中摆好，组织块间距约 5mm以保证组织块周围爬出细胞。将无菌盖玻片轻轻覆盖在组织块上，放入细胞培养箱孵育5h后，在每个组织块周围加入几滴完全培养液继续进行培养，防止组织块漂浮。2天后补培养液8ml继续培养，每3天进行换液培养。当培养瓶中胰蛋白酶消化法培养的细胞或者从组织块中游出的细胞铺满培养皿底约80％时，其显微镜改下观察结果见图1所示，进行首次传代，倒去原培养液，用pbs液洗1次弃去，加人0.25％胰蛋白酶消化细胞1～2min，待成纤维细胞出现胞质回缩、细胞变成圆球形、细胞间隙增大时倾去胰蛋白酶，加入rpmi 1640完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml 链霉素和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)终止消化，用移液枪从培养皿底一边开始到另一边结束，按顺序吹打，吹打时动作要轻柔，尽最避免出现泡沫。将脱壁细胞制成细胞悬液，以1000rpm/5min离心细胞悬液，收集细胞沉淀，添加完全培养液混匀成细胞悬液，以一瓶细胞数量传三瓶细胞数量的密度进行传代，这时所得细胞多数为成纤维细胞，培养皿中没有脱壁的主要是上皮细胞。
36.(2)sv40t慢病毒感染原代牦牛瘤胃成纤维细胞系：在六孔板中将原代细胞培养至细胞密度至50％后，慢病毒使用8mg/lpolybrene和rpmi 1640 完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素和10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)先稀释，将慢病毒配成感染复数(moi) 为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的稀释液并加入各孔中，继续培养过夜后，进行换液培养后，持续培养4天。待细胞长到20％-30％时，加入嘌呤霉素进行筛选。设0、0.5、1、2、4、5、6、7g/ml浓度梯度，每一个梯度设2个复孔。观察并记录细胞生长状况，每2天换一次新的嘌呤毒素培养基继续筛选，持续培养96h后，存活下来的细胞即为永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞。其中慢病毒感染复数为60，嘌呤毒素浓度为0.5g/ml时细胞系筛选成功。使用rpmi 1640完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)继续常规培养20代，所得的稳定细胞系即为永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系，其显微镜改下观察结果见图2所示，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年10月14日，保藏编号为cctcc no.c2021253。保藏单位地址：中
国武汉武大学，分类命名：永生化的牦牛瘤胃成纤维细胞系sv40t-yfb。
37.实验例1细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测
38.传代第30代的成纤维细胞系接种于六孔板细胞生长融合后，吸除细胞培养液，用pbs或hbss洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用pbs或hbss洗涤细胞3次，每次3 分钟。吸除pbs或hbss，每孔加入1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法参考下表1。
39.表1
40.β-半乳糖苷酶染色液a10μlβ-半乳糖苷酶染色液b10μlβ-半乳糖苷酶染色液c930μlx-gal溶液50μl
41.37℃孵育过夜，可以用封口膜或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。其中，37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行，需在普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2毫升pbs，4℃可以保存数天；或者加上封片液封片后，4℃可以保存较长时间。
42.细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，以x-gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。从而在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。显微镜下观察永生化牦牛瘤胃永生化细胞系，见图3，结果表明，该细胞系未见有有明显的深蓝色。
43.实验例2免疫荧光鉴定波形蛋白和sv40t蛋白表达
44.传代第5代的成纤维细胞系制成细胞悬液后，经计数以1
×
105个/ml的密度接种于6孔细胞培养板中，每个孔中均放置一个细胞爬片，细胞生长融合至80％时，去除培养液，用无菌pbs清洗细胞3次，每次3min；用4％多聚甲醛固定细胞15min，pbs清洗细胞3次，每次3min；加入0.5％triton-100x 室温通透20min，pbs清洗细胞3次，每次3min；添加5％山羊血清，室温封闭30min，pbs清洗细胞3次，每次3min；波形蛋白和sv40t蛋白一抗以1:50的稀释浓度分别加入到6孔板中，4℃孵育过夜；pbs清洗细胞3次，每次3min后添加cy3荧光标记的二抗，室温避光孵育2h，pbs清洗细胞3 次，每次3min；添加dapi避光孵育5min后pbs清洗细胞3次，每次3min；用含抗荧光淬灭剂的封片液对细胞爬片进行封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像，结果见图4，图中的a、d分别为抗原分子sv40t和波形蛋白的免疫荧光结果图，图中的b、e分别为图a和d所对应的dapi免疫荧光结果图，图中的c、f分别为抗原sv40t和波形蛋白的免疫荧光与dapi的免疫荧光merge的结果图，图中的标尺均为100μm。结果发现波形蛋白高表达，表明此细胞为成纤维细胞系，sv40t荧光呈阳性，表明sv40t基因成功转入原代成纤维细胞中。
45.实验例3永生化牦牛瘤胃成纤维细胞系生长曲线测定
46.传代第10代的成纤维细胞系制成细胞悬液后，经计数以1
×
104个/ml的密度接种于96孔细胞培养板中，设置6个重复，每次拿出6个孔进行测定，每孔加入10％培养液的cck-8，放置2h后在酶标仪波长450nm处测定od 值，测定10天细胞增殖周期。以培养时间为横轴，每天6孔细胞测定的od 值取平均数为纵轴。细胞系生长曲线呈“s”曲线符合一般细胞生长规律，经历潜伏期、对数生长期和平台期，结果见图5。
47.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。