用于增加辅因子的微生物和方法与流程

用于增加辅因子的微生物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月23日提交的美国临时专利申请号62/925,150的权益，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
3.本发明大体上涉及经工程改造以产生期望产物的生物体、促进期望产物产生的经工程改造的酶，并且更具体地涉及可增加辅因子(诸如nadph)的可用性以用于增加期望产物(诸如1，3-丁二醇、甲基丙烯酸甲酯、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸和相关产物以及由其衍生的产物)的产生的非天然存在的生物体。


背景技术：

4.微生物生物体可用于生产化合物，诸如1，3-丁二醇(1，3-bdo)、甲基丙烯酸甲酯(mma)、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯和氨基酸。此类生产的滴度、速率和产率可能受到辅因子可用性限制。特定来说，有限的辅因子(诸如还原剂还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph))可导致有限的氧化还原可用性。例如，nadph为生物合成反应(诸如脂质和核酸合成)以及参与保护免受活性氧物质(ros)毒性的氧化还原提供还原当量。nadph还用于合成代谢途径，诸如胆固醇合成和脂肪酸链延长。氧化还原水平的失衡可导致对化学化合物(诸如1，3-丁二醇(1，3-bdo)、甲基丙烯酸甲酯(mma)、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯和氨基酸)的生产的有害作用。因此，增加辅因子(诸如nadph)的可用性可有助于增加化学化合物(诸如1，3-丁二醇(1，3-bdo)、甲基丙烯酸甲酯(mma)、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯和氨基酸)的滴度、速率和产率。
5.1，3-bdo是传统上由乙炔经由其水合产生的四碳二醇。然后将所得乙醛转化为3-羟基丁醛，随后将其还原为1，3-bdo。最近，乙炔已被较便宜的乙烯替代作为乙醛的来源。1，3-bdo通常用作用于食品调味剂的有机溶剂。它还用作用于聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体，并被广泛用作降血糖剂。光学活性1，3-bdo是用于合成生物活性化合物和液晶的有用起始材料。1，3-丁二醇的另一用途是其脱水得到1，3-丁二烯(ichikawa等，journal of molecular catalysis a-chemical 256：106-112(2006)；ichikawa等，journal of molecular catalysis a-chemical231：181-189(2005)，1，3-丁二烯可用于制造合成橡胶(例如轮胎)、胶乳和树脂。乙炔或乙烯对基于石油的原料的依赖使得有必要开发得到1，3-丁二醇和丁二烯的基于可再生原料的路线。
6.mma是分子式为ch2＝c(ch3)co2ch3的有机化合物。这种无色液体是甲基丙烯酸甲酯(mma)，并且是用于生产透明塑料聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)的单体。甲基丙烯酸甲酯的主要应用是生产聚甲基丙烯酸甲酯丙烯酸类塑料。此外，甲基丙烯酸甲酯用于生产用作pvc的改性剂的甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物(mbs)。甲基丙烯酸甲酯聚合物和共聚物用于水性涂料，诸如乳胶漆。在粘合剂制剂中也发现了用途。现代应用包括在保持光线在液晶显示器(lcd)计算机和电视屏幕上均匀分布的板中的用途。甲基丙烯酸甲酯还用于制备
解剖器官(诸如心脏的冠状动脉)的腐蚀铸件。
7.已证明摄入含有(r)-3-羟基丁酸酯衍生物(例如(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯)的化合物和组合物可提升血液中酮体的水平。酮体是脂肪酸被机体代谢为能量时产生的化学化合物，这反过来又会导致酮体本身被用于能量。已证明酮体适于降低个体血浆中循环的游离脂肪酸水平。摄入酮体还可带来各种临床益处，包括增强身体和认知表现以及治疗心血管病况、糖尿病和治疗线粒体功能障碍病症，以及治疗肌肉疲劳和损伤。然而，直接施用酮体是不切实际且危险的。例如，直接施用任一种(r)-3-羟基丁酸酯可在从胃肠道快速吸收后导致显著的酸中毒。这些化合物的钠盐的施用也不适合，因为有潜在危险的钠超载将伴随治疗相关量的这些化合物的施用。施用低聚形式的(r)-3-羟基丁酸酯衍生物已被用于规避这一问题。为了获得期望的治疗益处和其他益处，酮体通常需要以阈值水平(例如至少1mm(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯)存在于个体的血浆中。然而，低产率或大规模的不切实际性已阻碍生产。
8.氨基酸是有吸引力和前景的生化物质，市场容量要求不断增加。氨基酸市场预计将从2019年的103亿美元增长到2024年的134亿美元，2019-2024年期间的增长率为5.3％(参见例如，elder，m.2019，世界发酵成分市场(world markets for fermentation ingredients)，bcc研究报告概述(bcc research report overview))。氨基酸用于许多工业应用，诸如制药、食品添加剂、饲料补充剂、化妆品、聚合物材料、医疗产品和农业化学品。诸如谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(escherichia coli)的微生物的发酵在氨基酸的工业生产中发挥着重要作用。然而，生产氨基酸的工业过程仍然需要优化，并找到更具成本效益和可持续的生产氨基酸的路线。
9.因此，需要开发增加辅因子(诸如nadph)的可用性以用于有效产生商业量的化合物(诸如1，3-丁二醇、甲基丙烯酸甲酯(mma)、酮酯(3r-羟基丁酸-3r-羟基丁酸酯)以及氨基酸)的方法。本发明满足了这些需要并且还提供了相关的优点。可通过本发明的教导产生的另外的产物分子包括但不限于己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸(6-aca)、六亚甲基二胺(hmda)或甲基丙烯酸(maa)。


技术实现要素：

10.在一些方面，本公开提供具有增加的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)可用性的非天然存在的微生物生物体。在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体包含(a)一种或多种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，(b)一种或多种在编码蛋白质或酶的基因中发生的基因衰减，所述基因衰减在所述破坏后导致所述非天然存在的微生物生物体的胞质溶胶中存在的nadph与nadh的比率增加，或(c)以下的组合：一种或多种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，以及一种或多种在编码蛋白质或酶的基因中发生的基因衰减，所述基因衰减在所述破坏后导致所述非天然存在的微生物生物体的胞质溶胶中存在的nadph与nadh的比率增加。在某些实施方案中，至少一种外源性核酸选自：(i)atp-nadh激酶、nad(p)转氢酶亚基α部分2(pntab)；(ii)atp-nad 激酶(nadk)，或(iii)nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)。在某些实施方案中，atp-nadh激酶是变体atp-nad 激酶。
11.在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物包含一种外
源性核酸。在一些实施方案中，一种外源性核酸编码atp-nadh激酶。在其他实施方案中，外源性核酸编码gapn。在某些实施方案中，atp-nadh激酶是变体atp-nad 激酶。
12.在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体包含两种外源性核酸。在一些实施方案中，两种外源性核酸编码pntab和nadk。在其他实施方案中，两种外源性核酸编码atp-nadh激酶和gapn。在某些实施方案中，atp-nadh激酶是变体atp-nad 激酶。
13.在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物包含三种外源性核酸。在一些实施方案中，三种外源性核酸编码atp-nadh激酶、pntab和nadk。在一些实施方案中，三种外源性核酸编码gapn、pntab和nadk。在某些实施方案中，atp-nadh激酶是变体atp-nad 激酶。
14.在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体包含四种外源性核酸。在一些实施方案中，四种外源性核酸编码gapn、atp-nadh激酶、pntab和nadk。在某些实施方案中，atp-nadh激酶是变体atp-nad 激酶。
15.在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体具有增加的nadph/nadp比率。
16.在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性和编码gapn的外源性核酸的非天然存在的微生物生物体具有以比内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶a(gapa)更高的水平表达的gapn。在一些实施方案中，gapn与内源性gapa加上所述gapn的比率[gapn/(gapn gapa)]为至少约10％到约90％。在一些实施方案中，内源性gapa包括衰减的gapa。在一些实施方案中，衰减的gapa包括降低的gapa表达。在一些实施方案中，gapn增加nadph的产生。在某些实施方案中，gapn来自甲烷营养细菌。在具体实施方案中，gapn来自甲醇芽孢杆菌(bacillus methanolicus)。
[0017]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性与一种或多种基因衰减的非天然存在的微生物生物体包含编码非质子易位性nadh脱氢酶ii(ndh-2)的基因中的基因衰减。在一些实施方案中，编码ndh-2的基因中的基因衰减包括ndh-2的缺失。在一些实施方案中，ndh-2的衰减降低nadph消耗。
[0018]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体具有增加的nadph可用性与编码酶的外源性核酸，所述外源性核酸由选自由内源性启动子、组成型启动子和诱导型启动子组成的组的启动子调控。
[0019]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体进一步包含1，3-丁二醇(1，3-bdo)途径、甲基丙烯酸甲酯(mma)途径、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径、氨基酸产生途径、3-羟基丁酰-辅酶a(3hb-coa)、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-aca)途径、六亚甲基二胺(hmda)途径或甲基丙烯酸(maa)途径。
[0020]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含1，3-bdo途径。在具体实施方案中，1，3-bdo途径包含乙酰乙酰-coa还原酶(coa依赖性，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰-coa还原酶(coa依赖性，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基，2-丁酮还原酶；乙酰乙酰-coa还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰-coa还原酶(醛形成)；和3-羟基丁酰-coa还原酶(醇形成)。在一些实施方案中，微生物生物体包含编码乙酰乙酰-coa还原酶(phab)的核酸。在具体实施方案中，乙酰乙酰-coa还原酶是突变体乙
酰乙酰-coa还原酶。在一些实施方案中，突变体乙酰乙酰-coa还原酶使用nadh作为底物。
[0021]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径。在具体实施方案中，(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径包含(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯形成酶；(3r)-羟基丁酰-coa：(r)-1，3-丁二醇转移酶；3-氧代丁酸(3r)羟基丁基酯形成酶；乙酰乙酰-coa：(r)-1，3-丁二醇转移酶；3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯还原酶；(3r)-羟基丁酰-acp：(r)-1，3-丁二醇酯合酶和乙酰乙酰-acp：(r)-1，3-丁二醇酯合酶。在一些实施方案中，微生物生物体包含编码乙酰乙酰-coa还原酶(phab)的核酸。在具体实施方案中，乙酰乙酰-coa还原酶是突变体乙酰乙酰-coa还原酶。在一些实施方案中，突变体乙酰乙酰-coa还原酶使用nadh作为底物。
[0022]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含3hb-coa途径。在具体实施方案中，3hb-coa途径包含乙酰-coa硫解酶和3-羟基丁酰-coa脱氢酶。
[0023]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含mma途径。在一些实施方案中，mma途径包含：(a)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、2-羟基异丁酰-coa脱水酶和甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。在一些实施方案中，微生物生物体进一步包含第二mma途径，所述第二mma途径包含：(c)甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶、4-羟基丁酰-coa变位酶和3-羟基异丁酰-coa脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
[0024]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含氨基酸产生途径。在具体实施方案中，氨基酸产生途径包括色氨酸产生途径、苏氨酸产生途径、赖氨酸产生途径或谷氨酸产生途径。
[0025]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含6-aca途径。在具体实施方案中，6-aca途径包含2-氨基-7-氧代辛二酸酮酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸氧化还原酶、2-氨基庚二酸脱羧酶、6-氨基己醛氧化还原酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶或2-氨基-7-氧代辛二酸氨基酸脱羧酶。
[0026]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含己内酰胺途径。在具体实施方案中，己内酰胺途径包含3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶和6-氨基己酰-coa合酶。
[0027]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含己二酸途径。在具体实施方案中，己二酸途径包含3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa水解酶、己二酰-coa连接酶、己二酰-coa转移酶和磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶。
[0028]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含hmda途径。在具体实施方案中，hmda途径包含3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶、6-氨基己酰-coa合酶、6-氨基己酰-coa还原酶(醛形成)、hmda转氨酶和hmda脱氢酶。
[0029]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体包含maa途径。在具体实施方案中，maa途径包含：(a)(i)琥珀酰-coa转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-coa变位酶；(iii)甲基丙二酰-coa差向异构酶；(iv)甲基丙二酰-coa还原酶(醛形成)；(v)甲基丙二酸半醛还原酶；和(vi)3-羟基异丁酸脱水酶；(ii)(i)琥珀酰-coa转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-coa变位酶；(iii)甲基丙二酰-coa还原酶(醛形成)；(iv)甲基丙二酸半醛还原酶；和(v)3-羟基异丁酸脱水酶；或(iii)(i)琥珀酰-coa转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-coa变位酶；(iii)甲基丙二酰-coa还原酶(醇形成)；和(iv)3-羟基异丁酸脱水酶。
[0030]
在一些实施方案中，微生物生物体是细菌、酵母或真菌的物种。
[0031]
在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体在基本上厌氧的培养基中。
[0032]
在另一方面，本文提供用于增加非天然存在的微生物生物体中的nadph可用性的方法，其包括在多种条件下培养本文所提供的任何非天然存在的微生物生物体且持续足以增加nadph可用性的时间段。在一些实施方案中，增加nadph可用性使得一种或多种选自由以下组成的组的化合物增加：1，3-bdo、mma、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、3hb-coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda和maa。
[0033]
在再一方面，本文提供用于经由基于碳水化合物的碳原料增加非天然存在的微生物生物体中的nadph可用性、由此增加一种或多种选自由以下组成的组的化合物的产率的方法：1，3-bdo、mma、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、3hb-coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda和maa，所述方法包括在多种条件下培养本文所提供的任何非天然存在的微生物生物体且持续足以产生产物的时间段。
附图说明
[0034]
图1显示与l15863菌株(无质粒)相比，l16182菌株(p115-nadk-p115-pntab)展现出1，3-bdo的更大滴度、速率和产率。
[0035]
图2显示与l15863菌株(无质粒)相比，来自l16182菌株(p115-nadk-p115-pntab)的比速率产物的发酵结果。在pntab-nadk过表达下，l16182菌株生成1，3-bdo和乙醇的显著更高的比速率，以及更高的4-羟基-2-丁酮(4oh2b)和葡萄糖。
[0036]
图3显示与l15863菌株(无质粒)相比，从l16182菌株(p115-nadk-p115-pntab)生成的产物浓度的发酵结果。l16182菌株展现出不同的丙酮酸动力学、较低的c3副产物(2oh-戊酸、缬氨酸)。
[0037]
图4显示l15863菌株(无质粒)和l16182菌株(p115-nadk-p115-pntab)的代谢组学结果。l16182菌株产生更高浓度的nadph和总nadph，以及更高的nadph/nadp比率。总nadph的增加不影响nadh池。
[0038]
图5显示从5-48小时测量的l15863菌株(无质粒)和l16182菌株(p115-nadk-p115-pntab)的途径和coa代谢物。在6-10小时后，l16182菌株具有高2-3倍的3hb-coa浓度，以及更高的3hb-coa/coa和accoa/coa比率，这与bdo和丙酮酸水平的峰值比速率一致。到24-30小时，l16182菌株具有低浓度的3hb-coa和低accoa/coa比率。在30-48小时后，l16182菌株具有1，3-bdo、etoh和丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)通量的更低比速率。3-羟基丁酰-coa(3hb-coa)、乙酰辅酶a(accoa)、1，3-丁二醇(bdo)和乙醇(etoh)。
[0039]
图6a和图6b显示过表达pntab和nadk的l16933菌株(图6a)和过表达nadk变体的l17786菌株(图6b)的示例性反应。
[0040]
图7显示过表达pntab和nadk的l16933菌株和过表达nadk变体的l17786菌株中途径和coa代谢物的测量值。在l17786菌株中观察到3-羟基丁酰辅酶a(3hb-coa)和乙酰辅酶(accoa)的降低，以及更高的nad(p)h和nad(p)h/nad(p)比率。
[0041]
图8a和图8b显示与高通气(wour40)(图8b)条件相比，低通气(wour30)(图8a)对过表达pntab和nadk的l16933菌株和过表达nadk变体的l17786菌株的1，3-丁二醇(1，3-bdo)产生的作用。l17786菌株在高通气条件下显示出改善的性能。
[0042]
图9a-图9d显示在高需氧条件下l15086菌株、过表达pntab和nadk的l16933菌株和过表达nadk变体的l17786菌株的1，3-丁二醇(1，3-bdo)的滴度(图9a)、产率(图9b)、速率(图9c)和比速率(图9d)的比较。l17786菌株比l16933菌株和l15086菌株两者都具有更大的滴度、速率、产率和比速率。
[0043]
图10a-图10d显示在中和高需氧条件下过表达pntab和nadk的l16933菌株和过表达nadk变体的l17786菌株中1，3-丁二醇(1，3-bdo)的滴度(图10a)、速率(图10b)、产生产率(图10c)和比速率(图10d)。l17786菌株在高需氧条件下的1，3-bdo产率更高。
[0044]
图11显示在中和高需氧条件下过表达pntab和nadk的l16933菌株和过表达nadk变体的l17786菌株的氧化还原代谢物水平。与l16933菌株相比，l17786菌株具有显著更高的nadph水平。l16933菌株在中需氧条件下的nadh水平显著较高。
[0045]
图12显示在中和高需氧条件下过表达pntab和nadk的l16933菌株和过表达nadk变体的l17786菌株的辅酶a(coa)代谢物水平。l17786菌株展现出3hb-coa积累的减少，而l16933菌株在发酵后期的3hb-coa水平较高。l16933菌株在中需氧条件下的nadh水平显著较高。3-羟基丁酰辅酶a(3hb-coa)、乙酰辅酶a(accoa)。
[0046]
图13显示在高通气条件下，与l16933(nadk和pntab)菌株相比，l17786(nadk变体)菌株的通量模型。磷酸烯醇丙酮酸(pep)、丙酮酸(pyr)、甲酸(for)、乙醇(etoh)、乙酸(ace)、乙酰辅酶a(accoa)、三羧酸循环(tca)循环、乙酰乙酰辅酶a(acaccoa)、4-羟基-2-丁酮(4oh2b)、3-羟基丁酰-coa(3hb-coa)、3-羟基丁酸(3hb)、1，3-丁二醇(1，3-bdo)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、乳酸(lac)。
[0047]
图14显示在高通气条件下，在0-12小时，与l16933(nadk和pntab)菌株相比，l17786(nadk变体)菌株的通量模型。磷酸烯醇丙酮酸(pep)、丙酮酸(pyr)、甲酸(for)、乙醇(etoh)、乙酸(ace)、乙酰辅酶a(accoa)、三羧酸循环(tca)循环、乙酰乙酰辅酶a(acaccoa)、4-羟基-2-丁酮(4oh2b)、3-羟基丁酰-coa(3hb-coa)、3-羟基丁酸(3hb)、1，3-丁二醇(1，3-bdo)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、乳酸(lac)。
[0048]
图15显示在高通气条件下，在12小时到发酵结束，与l16933(nadk和pntab)菌株相比，l17786(nadk变体)菌株的通量模型。磷酸烯醇丙酮酸(pep)、丙酮酸(pyr)、甲酸(for)、乙醇(etoh)、乙酸(ace)、乙酰辅酶a(accoa)、三羧酸循环(tca)循环、乙酰乙酰辅酶a(acaccoa)、4-羟基-2-丁酮(4oh2b)、3-羟基丁酰-coa(3hb-coa)、3-羟基丁酸(3hb)、1，3-丁二醇(1，3-bdo)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、乳酸(lac)。
[0049]
图16显示生成nadh的gapa酶和生成nadph的gapn酶的示例性反应。
[0050]
图17显示任选地使用(i)生成nadh的gapa酶或生成nadph的gapn酶、(ii)nadk和
pntab或nadk变体以及(iii)nadh依赖性phab(phab 1500al)或nadph依赖性phab(phab 1500gm)从葡萄糖生成1，3-bdo的示例性途径。nad(p)依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶a(gapa)、甲酸乙酰转移酶(pflb)、二氢硫辛酰脱氢酶(lpda)、硫解酶(thl)、乙酰乙酰-coa还原酶(phab)、醛脱氢酶(ald)、醇脱氢酶(adh)、1，3-丁二醇(1，3-bg)、甲酸脱氢酶(fdh)、nad(p)转氢酶亚基α部分2(pntab)、nad激酶(nadk)和atp-nadh激酶(nadk*)。
[0051]
图18显示对nadph需求增加的三个示例性nadph依赖性反应。结果显示，gapn活性对需要更大nadph需求的反应更有益。
[0052]
图19a-图19d显示gapn菌株相对于对照的1，3-丁二醇(1，3-bdo)产生的滴度(图19a)、速率(图19b)、产率(图19c)和比速率(图19d)。结果证实，gapn菌株为1，3-bdo产生提供nadph。
具体实施方式
[0053]
本发明部分地涉及增加辅因子(诸如nadph)的可用性以用于增加产物分子的产生的经工程改造的生物合成途径。示例性产物分子包括但不限于1，3-bdo、mma、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、异丙醇、己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸(6-aca、六亚甲基二胺(hmda)或甲基丙烯酸(maa)，尽管给出了本文所提供的教导和指导，但本领域技术人员将认识到，具有nadph依赖性酶的任何产物分子均可借助增加的nadph可用性而展现出提高的产物产生。本发明提供具有一种或多种外源性基因的非天然存在的微生物生物体，所述外源性基因编码可催化增加的nadph产生的酶。在一些实施方案中，这些非天然存在的微生物生物体还具有一种或多种外源性基因，所述外源性基因编码可催化期望产物(诸如1，3-bdo、mma、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、异丙醇、己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸(6-aca)、六亚甲基二胺(hmda)或甲基丙烯酸(maa))产生的酶。
[0054]
在许多经工程改造的途径中，基于碳水化合物原料的最大产物产率的实现受制于辅因子(诸如还原当量，如nadph)不足，或辅因子(诸如还原nadph当量)损失。根据一些实施方案，本发明通过(i)增强nadph可用性以及(ii)增加用于氧化还原反应的还原当量来增加产物的产率。可通过本文所述的非天然存在的生物体和方法产生的产物包括例如但不限于1，3-bdo、mma、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、异丙醇、己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸(6-aca)、六亚甲基二胺(hmda)或甲基丙烯酸(maa)。
[0055]
如本文所用，术语“非天然存在的”当参照本发明的微生物生物体或微生物使用时，意在意指微生物生物体具有至少一种通常不见于参照物种的天然存在的菌株(包括参照物种的野生型菌株)中的遗传改变。遗传改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物生物体遗传物质的其他功能破坏。此类修饰包括例如用于参照物种的异源多肽、同源多肽或异源多肽和同源多肽两者的编码区和其功能片段。另外的修饰包括例如修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区。示例性代谢多肽包括导致例如代谢因子增加或减少的酶或蛋白质。一种示例性代谢因子包括nadph。示例性代谢因子还包括例如1，3-丁二醇(1，3-bdo)、甲基丙烯酸甲酯(mma)和/或(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯。又一示例性代谢因子包括例如非质子易位性nadh脱氢酶ii(ndh-2)。
[0056]
如本文所用，术语“微生物”、“微生物生物体”或“微生物体”意在意指包含在古细
菌域、细菌域或真核生物域内的作为微观细胞存在的任何生物体。因此，该术语意在涵盖具有微观大小的原核或真核细胞或生物体，并且包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物，诸如酵母和真菌。该术语还包括可培养用于生产生化物质的任何物种的细胞培养物。
[0057]
如本文所用，术语“增加的可用性”或其等同物意在意指生物体具有参照分子的更大产生、减少的消耗或两者，使得参照分子的总量在非天然存在的微生物生物体中增加。nadph是用于增加其在生物体中的可用性的示例性参照分子。本文公开了增加nadph可用性的示例性反应。本文还公开了增加例如1，3-丁二醇(1，3-bdo)、甲基丙烯酸甲酯(mma)和/或(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯的产生的示例性途径。
[0058]
如本文所用，术语“衰减”或其语法等同物意在意指衰减、降低或减少酶或蛋白质的活性或量。如果酶或蛋白质的活性或量的衰减导致活性或量下降到低于给定途径、反应或系列反应发挥作用所需的临界水平，则该酶或蛋白质的活性或量的衰减可模拟完全破坏。然而，模拟一种途径、反应或系列反应的完全破坏的酶或蛋白质的活性或量的衰减仍可足以使单独的途径、反应或系列反应继续发挥作用。例如，内源性酶或蛋白质的衰减可足以模拟用于产生本发明的nadh的相同酶或蛋白质的完全破坏，但酶或蛋白质的剩余活性或量仍可足以维持其他途径、反应或系列反应，诸如对宿主微生物生物体存活、繁殖或生长至关重要的途径、反应或系列反应。酶或蛋白质的衰减还可以是衰减、降低或减少酶或蛋白质的活性或量，其量足以增加本发明的因子(诸如nadph)的产率，但不一定模拟酶或蛋白质的完全破坏。
[0059]“外源”在用于本文中时，意在意指参照分子或参照活性被引入宿主微生物生物体中。所述分子可例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，诸如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质(诸如质粒)来引入。因此，在参照编码核酸的表达使用时，该术语是指将编码核酸以可表达形式引入微生物生物体中。当参照生物合成活性时，该术语是指引入宿主参照生物体中的活性。来源可以是例如引入宿主微生物生物体中后表达参照活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源”是指存在于宿主中的参照分子或活性。类似地，当参照编码核酸的表达使用时，该术语是指包含在微生物生物体内的编码核酸的表达。术语“异源”是指来源于除参照物种之外的来源的分子或活性，而“同源”是指来源于宿主微生物生物体的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可利用异源或同源编码核酸中的一种或两种。
[0060]
应当理解，当微生物生物体内包含超过一种的外源性核酸时，该超过一种的外源性核酸是指参照的编码核酸或生物合成活性，如上文所讨论。进一步应理解，如本文所公开的，此类超过一种的外源性核酸可在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或其组合上被引入宿主微生物生物体中，并且仍然被认为是超过一种的外源性核酸。例如，如本文所公开的，微生物生物体可被经工程改造以表达两种或更多种编码途径、反应或系列反应所需的期望酶或蛋白质的外源性核酸。在将两种编码期望活性的外源性核酸引入宿主微生物生物体中的情况下，应当理解，两种外源性核酸可作为单个核酸，例如在单一质粒上、在单独的质粒上引入，可在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍然可被认为是两种外源性核酸。类似地，应当理解，超过两种的外源性核酸可以任何期望的组合，例如在单个质粒上、在单独的质粒上引入宿主生物体中，可在单个位点或多个位点整合到宿主染色
体中，并且仍然被认为是两种或更多种外源性核酸，例如三种外源性核酸。因此，参照的外源性核酸或生物合成活性的数量是指编码核酸的数量或生物合成活性的数量，而不是引入宿主生物体的单独核酸的数量。
[0061]
如本文所用，术语“诱导型启动子”意在意指当与编码酶的外源性核酸可操作地连接时，引起细胞中酶的量仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时动态表达的核苷酸序列。示例性的诱导型启动子可被阻遏或活化基因表达的转录调控蛋白结合。阻遏蛋白或活化蛋白进而负责刺激，诸如营养素、蛋白质或某种其他环境信号的存在或缺失。
[0062]
如本文所用，术语“变体”意在意指不同于野生型酶的酶的形式或型式。示例性变体是酶的突变体型式，其中变体酶的氨基酸序列不同于同源氨基酸的一个或多个处的氨基酸序列。变体可相对于野生型酶具有不同的功能或活性。然而，变体不必是突变体，并且可涵盖多态性、旁系同源物或直系同源物。
[0063]
如本文所用，术语“未改变的”意在意指相对于类似的天然存在的生物体没有显著改变的事物。被称为未改变的辅因子是指以与在天然存在的生物体中观察到的相同或相似的水平产生的辅因子。
[0064]
如本文所用，术语“coa”或“辅酶a”意在意指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)，其存在是许多酶(脱辅基酶)形成活性酶系统的活性所需。辅酶a在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或其他酰基转移以及脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和其他乙酰化中起作用。
[0065]
如本文所用，术语“基因破坏”或其语法等同物意在意指使编码的基因产物无活性的遗传改变。遗传改变可以是例如整个基因的缺失、转录或翻译所需调控序列的缺失、导致截短基因产物的一部分基因的缺失，或通过使编码的基因产物失活的各种突变策略中的任一种。一种特别有用的基因破坏方法是完全基因缺失，因为它减少或消除了本发明的非天然存在的微生物中遗传逆转的发生。
[0066]
本发明的非天然存在的微生物生物体可含有稳定的遗传改变，其是指可培养超过五代而不损失改变的微生物生物体。通常，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，特别地，稳定的修饰将持续超过约25代，且更特别地，稳定的遗传修饰将超过50代，包括无限期地。
[0067]
如本文所用，术语“1，3-丁二醇”或“1，3-bdo”意在意指具有化学式c4h
10
o2且分子质量为90.12g/mol的丁二醇的四种稳定异构体之一。化学化合物1，3-丁二醇(1，3-butanediol)在本领域中被称为1，3-丁二醇(1，3-butylene glycol)(1，3-bg)并且也是通常称为bdo家族化合物的化合物家族的化学中间体或前体。
[0068]
如本文所用，具有化学式ch2＝c(ch3)co2ch3且分子质量为100.12g/mol的“甲基丙烯酸甲酯”或“mma”是甲基丙烯酸的甲酯(maa)。mma用作用于生产透明塑料聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)的单体。
[0069]
如本文所用，术语“(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯”是指式(i)化合物：
[0070][0071]
术语(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯通篇可与术语3-羟基丁酸(r)-(r)-3-羟基
丁基酯、(3r)-羟基丁酸(3r)羟基丁基酯和(r)-3羟基丁酸(r)-3-羟基丁基酯互换使用。
[0072]
代谢修饰是指从其天然存在的状态改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可具有对编码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。本文公开了示例性代谢修饰。
[0073]
在基因破坏的情况下，特别有用的稳定遗传改变是基因缺失。使用基因缺失来引入稳定的遗传改变对于降低恢复到遗传改变之前的表型的可能性特别有用。例如，可通过例如缺失编码催化一组代谢修饰内的一个或多个反应的酶的基因来实现生化物质的稳定的生长偶联产生。可借助多次缺失来进一步增强生化物质的生长偶联产生的稳定性，从而显著降低对于每种被破坏的活性发生多次补偿逆转的可能性。
[0074]
本领域技术人员将理解，遗传改变(包括本文所例示的代谢修饰)是参照适合的宿主生物(诸如大肠杆菌)和它们对应的代谢反应、或用于期望遗传物质(诸如用于期望的代谢途径、反应或系列反应的基因)的适合的来源生物体来描述的。然而，鉴于众多种生物体的完整基因组测序和基因组学领域的高水平技术，本领域技术人员将能够容易地将本文所提供的教导和指导应用于基本上所有其他生物体。例如，本文所例示的大肠杆菌代谢改变可通过掺入来自参照物种之外的物种的相同或类似编码核酸而容易地应用于其他物种。此类遗传改变通常包括例如物种同源物的遗传改变，且特别是直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。
[0075]
直系同源物是通过垂直传递(vertical descent)而相关并且在不同的生物体中负责基本相同或同一功能的一种或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶可被认为是环氧化物水解的生物学功能的直系同源物。当例如基因共有足够量的序列相似性以表明它们是同源的或者通过从共同祖先演化而相关时，它们通过垂直传递而相关。如果基因共有足够量的三维结构，但不一定共有足够量的序列相似性以表明它们已从共同祖先演化到无法鉴别一级序列相似性的程度，则它们也可被认为是直系同源物。直系同源基因可编码具有约25％到100％氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有小于25％的氨基酸相似性的蛋白质的基因的三维结构也显示相似性，则它们也可被认为通过垂直传递产生。酶类的丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织纤溶酶原活化剂和弹性蛋白酶)被认为通过由共同祖先垂直传递而产生。
[0076]
直系同源物包括通过例如演化而在结构或整体活性上趋异的基因或其编码的基因产物。例如，当一个物种编码展现出两种功能的基因产物并且当此类功能在第二个物种中被分离成不同的基因时，这三个基因和其对应的产物被认为是直系同源物。对于生化产物的产生，本领域技术人员将理解含待引入或破坏的代谢活性的直系同源基因将被选择用于构建非天然存在的微生物。展现出可分离活性的直系同源物的示例是不同的活性已在两个或更多个物种之间或单个物种内被分离成不同基因产物的情况。具体的示例是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)分离为作为纤溶酶原活化剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个示例是支原体5
’‑3’
外切核酸酶和果蝇dna聚合酶iii活性的分离。来自第一物种的dna聚合酶可被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶之一或两者的直系同源物，反之亦然。
[0077]
相比之下，旁系同源物是通过例如复制、之后演化趋异而相关的同源物，并且具有相似或共同但不同一的功能。旁系同源物可起源或来源于例如相同的物种或不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶i)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解
酶ii)可被认为是旁系同源物，因为它们代表两种不同的酶，从共同的祖先协同演化而来，催化不同的反应并且在同一物种中具有不同的功能。旁系同源物是来自同一物种的蛋白质，彼此之间具有显著的序列相似性，表明它们是同源的，或者通过从共同祖先协同演化而相关。旁系同源蛋白质家族群包括hipa同源物、荧光素酶基因、肽酶和其他。
[0078]
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，其可替代不同物种中的参照基因功能。替代包括例如与不同物种中的参照功能相比，能够在起源物种中执行基本相同或相似的功能。尽管一般地，非直系同源基因置换将被鉴别为与编码参照功能的已知基因在结构上相关，但结构上不太相关但功能相似的基因和其对应的基因产物仍将落入该术语在其用于本文中时的含义内。功能相似性要求例如与编码寻求被替代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区至少有某种结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或不相关的基因。
[0079]
因此，在鉴别和构建具有辅因子(诸如nadph)可用性增加的本发明的非天然存在的微生物生物体时，本领域技术人员将通过将本文所提供的教导和指导应用于特定物种而理解，代谢修饰的鉴别可包括直系同源物的鉴别和包含或失活。就参照微生物中存在编码催化相似或基本相似的代谢反应的酶的旁系同源物和/或非直系同源基因置换来说，本领域技术人员也可利用这些演化上相关的基因。
[0080]
可通过本领域技术人员熟知的方法来确定直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换。例如，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将揭示比较序列之间的序列同一性和相似性。基于此类相似性，本领域技术人员可确定相似性是否足够高以指示蛋白质通过从共同祖先演化而相关。本领域技术人员所熟知的算法(诸如align、blast、clustal w和其他算法)比较并确定原始序列的相似性或同一性，并且还确定序列中可被分配权重或评分的空位的存在或显著性。此类算法在本领域中也是已知的并且同样适用于确定核苷酸序列相似性或同一性。基于用于计算统计相似性的熟知方法或在随机多肽中发现相似匹配的几率以及所确定的匹配的显著性来计算用于确定相关性的足够相似性的参数。如果期望，本领域技术人员还可在视觉上优化两个或更多个序列的计算机比较。预计相关基因产物或蛋白质可具有高度相似性，例如，25％到100％的序列同一性。如果扫描足够大小的数据库(约5％)，则不相关的蛋白质可具有与预计会偶然发生的基本上相同的同一性。5％到24％的序列可代表或可不代表足以得出所比较的序列是相关的结论的同源性。在给定数据集的大小的情况下，可进行确定此类匹配的显著性的额外统计分析，以确定这些序列的相关性。
[0081]
用于使用例如blast算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数可如下文所述。简单地说，可使用blastp2.0.8版(1999年1月5日)和以下参数进行氨基酸序列比对：矩阵：0 blosum62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff：50；期望值：10.0；字号：3；过滤器：开。可使用blastn 2.0.6版(1998年9月16日)和以下参数进行核酸序列比对：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸：2；x_dropoff：50；期望值：10.0；字号：11；过滤器：关。本领域技术人员将知道可对上述参数进行哪些修改以例如增加或减少比较的严格性并确定两个或更多个序列的相关性。
[0082]
在某些实施方案中，本文提供具有增加的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)可用性的非天然存在的微生物生物体。在某些实施方案中，生物体包含一种或多种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸
选自atp-nadh激酶、nad(p)转氢酶亚基α部分2(pntab)、atp-nad 激酶(nadk)和nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)。在其他实施方案中，微生物生物体包含一种或多种在编码蛋白质或酶的基因中发生的基因衰减，所述基因衰减在所述破坏后导致所述非天然存在的微生物生物体的胞质溶胶中存在的nadph与nadh的比率增加。在某些实施方案中，微生物生物体包含以下的组合：一种或多种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸选自atp-nadh激酶、nad(p)转氢酶亚基α部分2(pntab)、atp-nad 激酶(nadk)和nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)；以及一种或多种在编码蛋白质或酶的基因中发生的基因衰减，所述基因衰减在所述破坏后导致所述非天然存在的微生物生物体的胞质溶胶中存在的nadph与nadh的比率增加。
[0083]
在一些实施方案中，微生物生物体包含一种以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸。在一个实施方案中，一种外源性核酸编码atp-nadh激酶。在另一实施方案中，一种外源性核酸编码gapn。
[0084]
在其他实施方案中，微生物生物体包含两种各自编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸。在一个实施方案中，两种外源性核酸编码pntab和nadk。在另一实施方案中，两种外源性核酸编码atp-nadh激酶和gapn。
[0085]
在另外的实施方案中，微生物生物体包含三种各自编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸。在一些实施方案中，三种外源性核酸编码atp-nadh激酶、pntab和nadk。在其他实施方案中，三种外源性核酸编码gapn、pntab和nadk。
[0086]
在某些实施方案中，微生物生物体包含四种各自编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸。在一个实施方案中，四种外源性核酸编码gapn、atp-nadh激酶、pntab和nadk。
[0087]
如本文所公开的，atp-nadh激酶催化nad转化为nadph。在具体实施方案中，atp-nadh激酶活性等同于nad(p)转氢酶和atp-nad 激酶的组合活性。在一些实施方案中，atp-nadh是atp-nad 激酶的变体。
[0088]
应当理解，atp-nadh激酶不需要仅对nadh具有底物特异性。在一些实施方案中，atp-nadh对nad 和nadh两者都具有底物特异性。还应理解，atp-nadh可以是atp-nad 激酶的天然变体，或atp-nad 的突变体。例如，atp-nad激酶可来自酿酒酵母(utrlp、yeflp和pos5p)，并且除了nad激酶活性外，还展现出nadh激酶活性。在其他实施方案中，可通过突变将atp-nad 激酶变体转化为atp-nadh。例如，参与nad 烟酰胺环结合的氨基酸附近的单个精氨酸(arg)残基可取代atp-nad 中的甘氨酸(gly)或极性氨基酸，以将底物特异性转化为atp-nadh。
[0089]
还应理解，atp-nadh变体可相对于atp-nad具有增加的nadh激酶活性。在一些实施方案中，atp-nadh变体的nadh激酶活性为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％或更大。在又另外的实施方案中，nadh激酶活性与nad激酶活性的比率为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％或更大。在一些实施方案中，本文所提供的非天然存在的微生物生物体具有增加的nadph/nadp比率。在一些实施方案中，增加的比率为约1.5倍。在其他实施方案中，增加的比率为约2.0倍。在另外的实施方案中，增加的比率为约
2.5倍。在一些实施方案中，增加的比率为约3.0倍。在又另外的实施方案中，增加的比率为约3.5倍。在一些实施方案中，增加的比率为约4.0倍。在其他实施方案中，增加的比率为约5.0倍。
[0090]
如前所述，微生物生物体还可表达编码以足以产生gapn的量表达的酶的外源性核酸。在一些实施方案中，gapn以比内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶a(gapa)更高的水平表达。在某些实施方案中，gapn与gapa gapn的比率为至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
[0091]
应当理解，gapn相对于gapa的更高表达将导致gapn相对于gapa的活性更大的活性。在一些实施方案中，gapn的更大活性可通过衰减的gapa来实现。在具体实施方案中，衰减的gapa包括降低的gapa表达。
[0092]
如本文所提供的，gapn是nadp依赖性酶，其在糖酵解期间催化甘油醛-3-磷酸(gap)氧化为3-磷酸甘油酸(3-pg或3-pga)，并在该过程中生成nadph。因此，在一些实施方案中，gapn增加了nadph的产生。在某些实施方案中，外源gapn来自甲烷营养细菌。在另外的实施方案中，gapn来自甲醇芽孢杆菌。应当理解，产生nadph的甲醇芽孢杆菌gapn的同源物也是适合的。因此，在一些实施方案中，gapn是甲醇芽孢杆菌gapn的同源物。下表1中提供了示例性同源物和它们与gapn的相对同源性。
[0093]
表1
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098][0099]
应当理解，本文所公开的外源性核酸的表达可由各种启动子(诸如内源性启动子、组成型启动子或诱导型启动子)调控。考虑到期望的表达水平和持续时间，本领域普通技术人员将理解使用哪种类型的启动子。例如，如果期望的表达水平是内源水平，则本领域普通技术人员将理解可使用内源性启动子来控制外源性核酸的表达。此外，如果期望表达是例如暂时的或在发酵期间的特定点，则可使用内源性启动子来控制外源性核酸的表达。然而，如果期望表达是例如恒定和稳健的，则可使用组成型启动子来控制外源性核酸的表达。因
此，在一些实施方案中，编码酶的外源性核酸由内源性启动子、组成型启动子或诱导型启动子调控。
[0100]
如本文所公开的，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含1，3-丁二醇(1，3-bdo)途径、甲基丙烯酸甲酯(mma)途径、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径、氨基酸生物合成途径、3hb-coa途径、甲基丙烯酸甲酯(mma)途径、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-aca)途径、六亚甲基二胺(hmda)途径或甲基丙烯酸(maa)途径。
[0101]
在某些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体进一步包含1，3-丁二醇(1，3-bdo)途径。在一些实施方案中，1，3-bdo途径包含选自以下的酶：1)乙酰乙酰-coa还原酶(coa依赖性，醛形成)、2)3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、3)3-羟基丁醛还原酶、4)乙酰乙酰-coa还原酶(coa依赖性，醇形成)、5)3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、6)4-羟基，2-丁酮还原酶、7)乙酰乙酰-coa还原酶(酮还原)、8)3-羟基丁酰-coa还原酶(醛形成)和9)3-羟基丁酰-coa还原酶(醇形成)。在一些实施方案中，1，3-bdo途径包含编码乙酰乙酰-coa还原酶(phab)的核酸。在具体实施方案中，乙酰乙酰-coa还原酶是突变体乙酰乙酰-coa还原酶。在一些实施方案中，突变体乙酰乙酰-coa还原酶使用nadh作为底物。可进一步将任何数量的编码这些酶的核酸引入宿主微生物生物体中，包括编码这些酶的核酸中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、直到全部九种。当引入一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种或八种外源性核酸时，此类核酸可以是另外九种核酸的任何排列。
[0102]
在某些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体进一步包含(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径。在一些实施方案中，(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：1)(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯形成酶、2)(3r)-羟基丁酰-coa：(r)-1，3-丁二醇转移酶、3)3-氧代丁酸(3r)羟基丁基酯形成酶、4)乙酰乙酰-coa：(r)-1，3-丁二醇转移酶、5)3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯还原酶、6)(3r)-羟基丁酰-acp：(r)-1，3-丁二醇酯合酶和7)乙酰乙酰-acp：(r)-1，3-丁二醇酯合酶。在一些实施方案中，(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径包含编码乙酰乙酰-coa还原酶(phab)的核酸。在具体实施方案中，乙酰乙酰-coa还原酶是突变体乙酰乙酰-coa还原酶。在一些实施方案中，突变体乙酰乙酰-coa还原酶使用nadh作为底物。可进一步将任何数量的编码这些酶的核酸引入宿主微生物生物体中，包括编码这些酶的核酸中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、直到全部八种。当引入一种、二种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸时，此类核酸可以是另外八种核酸的任何排列。
[0103]
在某些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含mma途径。在具体实施方案中，mma途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：(a)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、2-羟基异丁酰-coa脱水酶和甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。在一些实施方案中，mma途径进一步包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：(c)甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶、4-羟基丁酰-coa变位酶和3-羟基异丁酰-coa脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
[0104]
在其他实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含氨基酸产生途径。在能够产生氨基酸的生物体(例如细菌)中对氨基酸的生物合成已被充分表征
(关于细菌氨基酸生物合成和其调控的综述，参见umbarger，h.e.(1978)ann.rev.biochem.47：533-606)。谷氨酸通过α-酮戊二酸的还原胺化合成，α-酮戊二酸是柠檬酸循环中的中间体。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸随后各自由谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成是三步过程，其以3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)开始，并在氧化、转氨基和水解步骤后产生该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸两者均由丝氨酸产生；前者通过高半胱氨酸与丝氨酸的缩合来产生，且后者通过在由丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中将侧链β-碳原子转移到四氢叶酸来产生。苯丙氨酸和酪氨酸由糖酵解和磷酸戊糖途径前体4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸在9步生物合成途径中合成，所述生物合成途径仅在合成预苯酸后的最后两个步骤不同。色氨酸也是由这两个初始分子产生的，但其合成是11步途径。酪氨酸也可由苯丙氨酸在由苯丙氨酸羟化酶催化的反应中合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸都是糖酵解的最终产物丙酮酸的生物合成产物。天冬氨酸由草酰乙酸形成，草酰乙酸是柠檬酸循环的中间体。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸各自由天冬氨酸转化产生。异亮氨酸由苏氨酸形成。复杂的9步途径导致从5-磷酸核糖-1-焦磷酸(一种活化的糖)产生组氨酸。
[0105]
在一些实施方案中，氨基酸产生途径包括色氨酸产生途径，所述色氨酸产生途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：trpe、trpg-d、trpc-f、trpb或trpa。使用微生物产生色氨酸是本领域已知的，如美国专利号6,180,373和作为u.s.2015-0147788 a1公布的美国申请号14/371,465中所例示，所述专利中每一个的全部内容以引用方式并入本文。在其他实施方案中，氨基酸产生途径包括苏氨酸产生途径，所述苏氨酸产生途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：thra、thrb或thrc。使用微生物产生苏氨酸是本领域已知的，如美国专利号4,278,765中所例示，该专利的全部实施方案以引用方式并入本文。在一些实施方案中，氨基酸产生途径包括赖氨酸产生途径，所述赖氨酸产生途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：ask、dapa、lysc、asd、dapa、dapb、dapd、dapc/argd、dape、dapf、dapl、ddh或lysa。使用微生物产生赖氨酸是本领域已知的，如美国专利号8,048,651中所例示，该专利的全部内容以引用方式并入本文。然而，应当理解，利用nadph的任何氨基酸产生途径均可受益，并且上文所例示的途径并非意在进行限制。
[0106]
在其他实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含3hb-coa途径。在具体实施方案中，3hb-coa途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：乙酰-coa硫解酶和3-羟基丁酰-coa脱氢酶。
[0107]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含mma途径。使用微生物产生mma是本领域已知的，如美国专利号9,133,487和9,346,902中所例示，其各自的全部内容以引用方式并入本文。在某些实施方案中，mma途径包括随后用甲醇酯化以产生mma的maa途径。在具体实施方案中，mma途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：(a)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、2-羟基异丁酰-coa脱水酶和甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。在某些实施方案中，mma途径进一步包含至少一种编码选自第二mma途径的酶的外源性核酸，所述酶包括：(c)甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶、4-羟基丁酰-coa变位酶和3-羟基异丁酰-coa脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
[0108]
在某些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含6-aca途径。在具体实施方案中，6-aca途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：2-氨基-7-氧代辛二酸酮酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸氧化还原酶、2-氨基庚二酸脱羧酶、6-氨基己醛氧化还原酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶或2-氨基-7-氧代辛二酸氨基酸脱羧酶。在其他实施方案中，6-aca途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：3-氧代-6-氨基己酰-coa硫解酶；3-氧代-6-氨基己酰-coa还原酶；3-羟基-6-氨基己酰-coa脱水酶；6-氨基己-2-烯酰-coa还原酶；和6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶、6-氨基己酰-coa合酶或6-氨基己酰-coa水解酶。
[0109]
在其他实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含己内酰胺途径。在具体实施方案中，己内酰胺途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶和6-氨基己酰-coa合酶。
[0110]
在某些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含己二酸途径。在具体实施方案中，己二酸途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa水解酶、己二酰-coa连接酶、己二酰-coa转移酶和磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶。
[0111]
在其他实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含六亚甲基二胺(hmda)途径。在具体实施方案中，hmda途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶、6-氨基己酰-coa合酶、6-氨基己酰-coa还原酶(醛形成)、hmda转氨酶和hmda脱氢酶。在其他实施方案中，hmda途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶或6-氨基己酰-coa合酶；6-氨基己酰-coa还原酶(醛形成)；和六亚甲基二胺转氨酶或六亚甲基二胺脱氢酶。
[0112]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含maa途径。在具体实施方案中，maa途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源性核酸：(1)(i)琥珀酰-coa转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-coa变位酶；(iii)甲基丙二酰-coa差向异构酶；(iv)甲基丙二酰-coa还原酶(醛形成)；(v)甲基丙二酸半醛还原酶；和(vi)3-羟基异丁酸脱水酶；(2)(i)琥珀酰-coa转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-coa变位酶；(iii)甲基丙二酰-coa还原酶(醛形成)；(iv)甲基丙二酸半醛还原酶；和(v)3-羟基异丁酸脱水酶；或(3)(i)琥珀酰-coa转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-coa变位酶；(iii)甲基丙二酰-coa还原酶(醇形成)；和(iv)3-羟基异丁酸脱水酶。
[0113]
如本文所提供的，还可修饰微生物生物体以降低nadph的消耗。因此，可衰减和/或缺失一种或多种nadph依赖性酶。在某些实施方案中，具有增加的nadph可用性的微生物生物体可进一步包含一种或多种基因衰减。在具体实施方案中，一种或多种基因衰减在编码蛋白质或酶的基因中发生，所述基因衰减在破坏后导致所述非天然存在的微生物生物体的胞质溶胶中存在的nadph与nadh的比率增加。在另外的实施方案中，一种或多种基因衰减包
括编码非质子易位性nadh脱氢酶ii(ndh-2)的基因中的基因衰减。在又另外的实施方案中，编码ndh-2的基因中的基因衰减包括ndh-2的缺失并且ndh-2的衰减降低nadph消耗。
[0114]
在某些实施方案中，本发明提供具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体，其中非天然存在的微生物生物体具有至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：nadp 到nadph、nad 到nadp 、nadh到nad 、nad 到nadh、d-甘油醛3-磷酸到3-磷酸-d-甘油酸和d-甘油醛3-磷酸到3-磷酸-d-甘油酰磷酸。
[0115]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体进一步包含1，3-丁二醇途径。在一些实施方案中，1，3-丁二醇途径包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：葡萄糖到丙酮酸、丙酮酸到乙酰-coa、乙酰-coa到乙酰乙酰-cea、乙酰乙酰-coa到3-羟基丁酰-coa、3-羟基丁酰-coa到3-羟基丁醛和3-羟基丁醛到1，3-bdo。
[0116]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体进一步包含(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径。在一些实施方案中，(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：(r)-1，3-丁二醇和(3r)-羟基丁酸到(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、(r)-1，3-丁二醇和(3r)-羟基丁酰-coa到(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、(r)-1，3-丁二醇和(3r)-羟基丁基-acp到(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、(r)-1，3-丁二醇和乙酰乙酸到3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯、(r)-1，3-丁二醇和乙酰乙酰-coa到3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯、(r)-1，3-丁二醇和乙酰乙酰-acp到3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯、3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯到(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、乙酰-coa到丙二酰-coa、丙二酰-coa到乙酰乙酰-coa、乙酰-coa到乙酰乙酰-coa、乙酰乙酰-coa到乙酰乙酸、乙酰乙酰-coa到(3s)-羟基丁酰-coa、(3s)-羟基丁酰-coa到(3r)-羟基丁酰-coa、(3r)-羟基丁酰-coa到(3r)-羟基丁酸、(3r)-羟基丁酰-coa到(3r)-羟基丁醛、(3r)-羟基丁酸到(3r)-羟基丁醛、(3r)-羟基丁醛到(r)-1，3-丁二醇、丙二酰-acp到乙酰乙酰-acp、乙酰乙酰-acp到乙酰乙酰-coa、乙酰乙酰-acp到(3r)-羟基丁酰-acp、(3r)-羟基丁酰-acp到(3r)-羟基丁酰-coa、(3r)-羟基丁酰-acp到(3r)-羟基丁酸、(3r)-羟基丁酰-acp到(3r)-羟基丁醛和(3r)-羟基丁酰-acp到(r)-1，3-丁二醇。本领域技术人员将理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员可基于本文的教导容易地确定本文所公开的适于产生期望产物并且对于其可获得将底物转化为产物的适当活性的任何底物-产物对。因此，本发明提供含有至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸的非天然存在的微生物生物体，其中所述酶或蛋白质转化(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径的底物和产物，诸如作为u.s.2016-0108442 a1公布的美国申请号14/893,510中所公开的那些，该美国申请的全部内容以引用方式并入本文。
[0117]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体进一步包含mma途径。在一些实施方案中，mma途径包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：4-hb-coa到巴豆酰-coa和3hib-coa、巴豆酰-coa到3hb-coa、3hib-coa到maa-coa或甲基-3hib，以及maa-coa或甲基-3hib到mma。在又一实施方案中，本发明提供具有mma途径的非天然存在的微生物生物
体，其中非天然存在的微生物生物体包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：4hb-coa到巴豆酰-coa、巴豆酰-coa到(3r)-hb-coa或(3s)-hb-coa、(3r)-hb-coa或(3s)-hb-coa到2-hib-coa、2-hib-coa到maa-coa或2hib-me，以及maa-coa或2hib-me到mma。在再又一实施方案中，本发明提供具有1，3-bdo途径的非天然存在的微生物生物体，其中非天然存在的微生物生物体包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：4hb-coa到巴豆酰-coa、巴豆酰-coa到(3r)-hb-coa或(3s)-hb-coa、(3r)-hb-coa或(3s)-hb-coa到(3r)-或(3s)-1，3bdo。
[0118]
在一些实施方案中，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体进一步包含氨基酸生物合成途径。如上文所述，在能够产生氨基酸的生物体(例如细菌)中对氨基酸的生物合成已被充分表征(关于细菌氨基酸生物合成和其调控的综述，参见umbarger，h.e.(1978)ann.rev.biochem.47：533-606)。谷氨酸通过α-酮戊二酸的还原胺化合成，α-酮戊二酸是柠檬酸循环中的中间体。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸随后各自由谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成是三步过程，其以3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)开始，并在氧化、转氨基和水解步骤后产生该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸两者均由丝氨酸产生；前者通过高半胱氨酸与丝氨酸的缩合来产生，且后者通过在由丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中将侧链β-碳原子转移到四氢叶酸来产生。苯丙氨酸和酪氨酸由糖酵解和磷酸戊糖途径前体4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸在9步生物合成途径中合成，所述生物合成途径仅在合成预苯酸后的最后两个步骤不同。色氨酸也是由这两个初始分子产生的，但其合成是11步途径。酪氨酸也可由苯丙氨酸在由苯丙氨酸羟化酶催化的反应中合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸都是糖酵解的最终产物丙酮酸的生物合成产物。天冬氨酸由草酰乙酸形成，草酰乙酸是柠檬酸循环的中间体。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸各自由天冬氨酸转化产生。异亮氨酸由苏氨酸形成。复杂的9步途径导致从5-磷酸核糖-1-焦磷酸(一种活化的糖)产生组氨酸。
[0119]
在另外的实施方案中，本发明提供具有甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物生物体，其中非天然存在的微生物生物体包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：乙酰-coa和丙酮酸到柠苹酸、柠苹酸到柠康酸，以及柠康酸到甲基丙烯酸；乙酰-coa和丙酮酸到柠苹酰-coa、柠苹酰-coa到柠苹酸、柠苹酸到柠康酸，以及柠康酸到甲基丙烯酸；乌头酸到衣康酸、衣康酸到衣康酰-coa、衣康酰-coa到柠苹酰-coa、柠苹酰-coa到柠苹酸、柠苹酸到中康酸、中康酸到甲基丙烯酸等，诸如本文所述的反应。本领域技术人员将理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员可基于本文的教导容易地确定本文所公开的适于产生期望产物并且对于其可获得将底物转化为产物的适当活性的任何底物-产物对。因此，本发明提供含有至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸的非天然存在的微生物生物体，其中所述酶或蛋白质转化甲基丙烯酸途径(诸如本文所述途径)的底物和产物。另外提供甲基丙烯酸途径，其包含乙酰乙酰-coa硫解酶、乙酰乙酰-coa还原酶、巴豆酸酶、4-羟基丁酰-coa脱水酶(或4-羟基巴豆酰-coa水合酶)、4-羟基丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa合成酶或3-羟基异丁酰-coa水解酶或3-羟基异丁酰-coa转移酶和3-羟基异丁酸脱水酶。还提供甲基丙烯酸途径，其包含乙酰乙酰-coa硫解酶、乙酰乙酰-coa还原酶、巴豆酸酶、4-羟基丁酰-coa脱水酶、4-羟基丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa脱水酶和甲基丙烯酰-coa合成酶或甲基丙烯酰-coa水解酶
或甲基丙烯酰-coa转移酶。maa的制备是本领域已知的并且可见于例如作为u.s.2013-0065279a1公布的美国申请号13/436,811中，该美国申请的全部内容以引用方式并入本文。
[0120]
在另外的实施方案中，本发明提供具有己内酰胺途径的非天然存在的微生物生物体，其中非天然存在的微生物生物体包含至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸，所述酶或蛋白质进行选自由以下组成的组的从底物到产物的转化：己二酰-coa到己二酸、己二酰-coa到己二酸半醛、己二酸到己二酸半醛、己二酸半醛到6-羟基己酸、6-羟基己酸到6-羟基己酰-coa、6-羟基己酸到6-羟基己酰-磷酸、6-羟基己酸到己内酯、6-羟基己酰-coa到6-羟基己酰磷酸、6-羟基己酰磷酸到己内酯、6-羟基己酰-coa到己内酯、4-羟基丁酰-coa到3-氧代-6-羟基己酰-coa、到3-氧代-6-羟基己酰-coa到3，6-二羟基己酰-coa、3，6-二羟基己酰-coa到6-羟基己-2-烯酰-coa、6-羟基己-2-烯酰-coa到6-羟基己酰-coa、6-羟基己酰-coa到6-羟基己酸、环己酮到己内酯、己二酸半醛到环己烷-1，2-二酮、环己烷-1，2-二酮到2-羟基环己酮、到2-羟基环己酮到环己烷-1，2-二醇、环己烷-1，2-二醇到环异己酮、庚二酰-coa到2-酮基环异己酮-1-羧酰-coa、2-酮基环异己酮-1-羧酰-coa到2-酮基环己烷-1-羧酸、2-酮基环己烷-1-羧酸到环己酮、环己酮到环己酮肟，以及环己酮肟到己内酰胺。本领域技术人员将理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员可基于本文的教导容易地确定本文所公开的适于产生期望产物并且对于其可获得将底物转化为产物的适当活性的任何底物-产物对。因此，本发明提供含有至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸的非天然存在的微生物生物体，其中所述酶或蛋白质转化己内酰胺途径的底物和产物。
[0121]
在一些实施方案中，本文所提供的具有增加nadph的非天然存在的微生物生物体可具有己二酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：琥珀酰-coa和乙酰-coa到3-氧代己二酰-coa；3-氧代己二酰-coa到3-羟基己二酰-coa；3-羟基己二酰-coa到5-羧基-2-戊烯酰-coa；5-羧基-2-戊烯酰-coa到己二酰-coa；己二酰-coa到己二酸(参见例如wo2012/177721，其全部内容并入本文)。另外，非天然存在的微生物生物体可具有己二酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：琥珀酰-coa和乙酰-coa到3-氧代己二酰-coa；3-氧代己二酰-coa到3-氧代己二酸；3-氧代己二酸到3-羟基己二酸；3-羟基己二酸到己-2-烯二酸(在本文中还被称为5-羧基-2-戊烯酸)；己-2-烯二酸到己二酸。此外，非天然存在的微生物生物体可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：己二酰-coa到己二酸半醛；和己二酸半醛到6-氨基己酸。此外，非天然存在的微生物生物体可具有己内酰胺途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：己二酰-coa到己二酸半醛；己二酸半醛到6-氨基己酸；和6-氨基己酸到己内酰胺。另外，非天然存在的微生物生物体可具有己二酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：α-酮基己二酸到α-酮基己二酰-coa；α-酮基己二酰-coa到2-羟基己二酰-coa；2-羟基己二酰-coa到5-羧基-2-戊烯酰-coa；5-羧基-2-戊烯酰-coa到己二酰-coa；和己二酰-coa到己二酸。此外，非天然存在的微生物生物体可具有己二酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：α-酮基己二酸到2-羟基己二酸；2-羟基己二酸到2-羟基己二酰-coa；2-羟基己二酰-coa
到5-羧基-2-戊烯酰-coa；5-羧基-2-戊烯酰-coa到己二酰-coa；和己二酰-coa到己二酸。
[0122]
另外，非天然存在的微生物生物体可具有6-氨基己酰-coa途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：4-氨基丁酰-coa和乙酰-coa到3-氧代-6-氨基己酰-coa；3-氧代-6-氨基己酰-coa到3-羟基-6-氨基己酰-coa；3-羟基-6-氨基己酰-coa到6-氨基己-2-烯酰-coa；6-氨基己-2-烯酰-coa到6-氨基己酰-coa。此类途径的另外底物和产物可包括6-氨基己酰-coa到6-氨基己酸；6-氨基己酰-coa到己内酰胺；或6-氨基己酸-coa到6-氨基己酸半醛和6-氨基己酸半醛到六亚甲基二胺。非天然存在的微生物生物体还可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：4-氨基丁酰-coa和乙酰-coa到3-氧代-6-氨基己酰-coa；3-氧代-6-氨基己酰-coa到3-氧代-6-氨基己酸；3-氧代-6-氨基己酸到3-羟基-6-氨基己酸；3-羟基-6-氨基己酸到6-氨基己-2-烯酸；和6-氨基己-2-烯酸到6-氨基己酸。此类途径的另外底物和产物可包括6-氨基己酸到己内酰胺或6-氨基己酸到6-氨基己酰-coa、6-氨基己酰-coa到6-氨基己酸半醛和6-氨基己酸半醛到六亚甲基二胺。
[0123]
另外，非天然存在的微生物生物体可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)；2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)到2-氧代庚烷-1，7-二酸(2-ohd)；2-氧代庚烷-1，7-二酸(2-ohd)到己二酸半醛；和己二酸半醛到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)；2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)到6-氧代己-4-烯酸(6-ohe)；6-氧代己-4-烯酸(6-ohe)到己二酸半醛；和己二酸半醛到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)；2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)到2-氨基庚-4-烯-1，7-二酸(2-ahe)；2-氨基庚-4-烯-1，7-二酸(2-ahe)到2-氨基庚烷-1，7-二酸(2-ahd)；和2-氨基庚烷-1，7-二酸(2-ahd)到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)；2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)到2-氧代庚烷-1，7-二酸(2-ohd)；2-氧代庚烷-1，7-二酸(2-ohd)到2-氨基庚烷-1，7-二酸(2-ahd)；和2-氨基庚烷-1，7-二酸(2-ahd)到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到3-羟基己二酰-coa；3-羟基己二酰-coa到2，3-脱氢己二酰-coa；2，3-脱氢己二酰-coa到己二酰-coa；己二酰-coa到己二酸半醛；和己二酸半醛到6-氨基己酸。非天然
存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)；2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)到2，3-脱氢己二酰-coa；2，3-脱氢己二酰-coa到己二酰-coa；己二酰-coa到己二酸半醛；和己二酸半醛到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和琥珀酸半醛到4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1，7-二酸(hodh)到2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)；2-氧代庚-4-烯-1，7-二酸(ohed)到2-氧代庚烷-1，7-二酸(2-ohd)；2-氧代庚烷-1，7-二酸(2-ohd)到己二酰-coa；己二酰-coa到己二酸半醛；和己二酸半醛到6-氨基己酸。
[0124]
另外，非天然存在的微生物生物体可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：谷氨酸到谷氨酰-coa；谷氨酰-coa到3-氧代-6-氨基-庚二酰-coa；3-氧代-6-氨基-庚二酰-coa到3-羟基-6-氨基-庚二酰-coa；3-羟基-6-氨基-庚二酰-coa到6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-coa；6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-coa到6-氨基庚二酰-coa；6-氨基庚二酰-coa到2-氨基庚二酸；和2-氨基庚二酸到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸到2-氨基庚二酸；和2-氨基庚二酸到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：高赖氨酸到6-氨基己酰胺；和6-氨基己酰胺到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体或者可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：己二酸到己二酸半醛；己二酸到己二酰磷酸；和己二酰磷酸到己二酸半醛。
[0125]
另外，非天然存在的微生物生物体可具有6-氨基己酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：2-氨基-7-氧代辛二酸到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到6-氨基己醛；6-氨基己醛到6-氨基己酸；2-氨基-7-氧代辛二酸到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到6-氨基己醛；2-氨基-7-氧代庚酸到2-氨基庚二酸；和2-氨基庚二酸到6-氨基己酸。非天然存在的微生物生物体可进一步具有2-氨基-7-氧代辛二酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：谷氨酸-5-半醛到2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸；2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸到2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸；和2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸到2-氨基-7-氧代辛二酸。
[0126]
另外，非天然存在的微生物生物体可具有六亚甲基二胺(hmda)途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到[(6-氨基己酰)氧基]膦酸(6-ahop)；[(6-氨基己酰)氧基]膦酸(6-ahop)到6-氨基己酸半醛；和6-氨基己酸半醛到六亚甲基二胺。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行
选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到[(6-氨基己酰)氧基]膦酸(6-ahop)；[(6-氨基己酰)氧基]膦酸(6-ahop)到6-氨基己酰-coa；6-氨基己酰-coa到6-氨基己酸半醛；和6-氨基己酸半醛到六亚甲基二胺。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到6-氨基己酰-coa；6-氨基己酰-coa到6-氨基己酸半醛；和6-氨基己酸半醛到六亚甲基二胺。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸到[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸(6-aahop)；[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸(6-aahop)到6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛到6-乙酰氨基己胺；和6-乙酰氨基己胺到六亚甲基二胺。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸到6-乙酰氨基己酰-coa；6-乙酰氨基己酰-coa到6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛到6-乙酰氨基己胺；和6-乙酰氨基己胺到六亚甲基二胺。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸到[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸(6-aahop)；[(6-乙酰氨基己酰)氧基]膦酸(6-aahop)到6-乙酰氨基己酰-coa；6-乙酰氨基己酰-coa到6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛到6-乙酰氨基己胺；和6-乙酰氨基己胺到六亚甲基二胺。
[0127]
另外，非天然存在的微生物生物体可具有六亚甲基二胺(hmda)途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：谷氨酸到谷氨酰-coa；谷氨酰-coa到3-氧代-6-氨基-庚二酰-coa；3-氧代-6-氨基-庚二酰-coa到3-羟基-6-氨基-庚二酰-coa；3-羟基-6-氨基-庚二酰-coa到6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-coa；6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-coa到6-氨基庚二酰-coa；6-氨基庚二酰-coa到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛到3-氧代-7-氨基庚酸；3-氧代-7-氨基庚酸到3，7-二氨基庚酸；3，7-二氨基庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到5-氧代庚二酰膦酸；5-氧代庚二酰膦酸到3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛到3-氧代-7-氨基庚酸；3-氧代-7-氨基庚酸到3，7-二氨基庚酸；3，7-二氨基庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到5-氧代庚二酰-coa；5-氧代庚二酰-coa到3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛到3-氧代-7-氨基庚酸；3-氧代-7-氨基庚酸到3，7-二氨基庚酸；3，7-二氨基庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。
氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸到5-氨基庚二酰膦酸；5-氨基庚二酰膦酸到3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸到3，7-二氨基庚酸；3，7-二氨基庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸到2-氨基庚二酸；2-氨基庚二酸到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸到2-氨基庚二酸；2-氨基庚二酸到6-氨基庚二酰膦酸；6-氨基庚二酰膦酸到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：戊二酰-coa到3-氧代庚二酰-coa；3-氧代庚二酰-coa到3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸到3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸到2-氨基庚二酸；2-氨基庚二酸到6-氨基庚二酰-coa；6-氨基庚二酰-coa到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和4-氨基丁醛到2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸；2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸到2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸；2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸到2-氧代-7-氨基庚酸；2-氧代-7-氨基庚酸到高赖氨酸；和高赖氨酸到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：丙酮酸和4-氨基丁醛到2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸；2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸到2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸；2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸到2-氧代-7-氨基庚酸；2-氧代-7-氨基庚酸到6-氨基己醛；和6-氨基己醛到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到6-氨基己酸半醛；和6-氨基己酸半醛到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：6-氨基己酸到6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸到6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛到6-乙酰氨基己胺；6-乙酰氨基己胺到hmda。非天然存在的微生物生物体或者可具有hmda途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：2-氨基-7-氧代辛二酸到2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到6-氨基己醛；6-氨基己醛到hmda；2-氨基-7-氧代辛二酸到2-氧代-7-氨基庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸到高赖氨酸；高赖氨酸到hmda；2-氧代-7-氨基庚酸到高赖氨酸；2-氧代-7-氨基庚酸到6-氨基己醛；2-氨基-7-氧代辛二酸到2,7-二氨基辛二酸；和2，7-二氨基辛二酸到高赖氨酸。非天然存在的微生物生物体可进一步具有2-氨基-7-氧代辛二酸途径，其中微生物生物体含有至少一种编码多肽的外源性核酸，所述多肽进行选自以下的从底物到产物的转化：谷氨酸-5-半醛到2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸；2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸到2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸；和2-氨
基-5-烯-7-氧代辛二酸到2-氨基-7-氧代辛二酸。
[0128]
虽然本文一般描述为含有增加的nadph可用性的微生物生物体，但应当理解，本发明另外提供非天然存在的微生物生物体，其包含至少一种编码以足以增加nadph中间体可用性的量表达的酶的外源性核酸。例如，如本文所公开的，nadph可通过两步法产生，该方法例示为通过nadk将nad 转化为nadp ，然后通过pntab将nadp 和nadh转化为nad 和nadph(图6a)。在一些实施方案中，本发明提供非天然存在的微生物生物体，其包含至少一种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，其中微生物生物体产生nadph中间体。
[0129]
还应理解，增加的nadph可用性可用于增加诸如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的产物的产生。因此，应当理解，本发明在一些实施方案中另外提供非天然存在的微生物生物体，其包含1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径酶，其中所述途径含有至少一种nadph依赖性酶，并且所述途径酶以足以产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸途径的中间体或另一产物中间体的量表达。因此，除了含有产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径的微生物生物体之外，本发明另外还提供非天然存在的微生物生物体，其中微生物生物体产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体。
[0130]
进一步应理解，本发明另外提供非天然存在的微生物生物体，其包含至少一种编码以足以增加nadph副产物可用性的量表达的酶的外源性核酸。例如，nadph可通过由gapn将nadp 和d-甘油醛3-磷酸酶促转化为3-磷酸-d-甘油酸和nadph以及2个氢分子来产生，其中3-磷酸-d-甘油酸是nadph副产物。类似地，例如，atp-nadh激酶可将nadh和nad 转化为nadph和nadp ，其中nadp 是nadph副产物。因此，在一些实施方案中，本发明提供非天然存在的微生物生物体，其包含至少一种编码以足以增加nadph副产物可用性的量表达的酶的外源性核酸。因此，除了含有增加的nadph可用性的微生物生物体之外，本发明还另外提供非天然存在的微生物生物体，其包含至少一种编码以足以增加nadph副产物可用性的量表达的酶的外源性核酸。
[0131]
应当理解，本文所公开的任何途径(如通篇所述并且全部内容以引用方式并入)可用于生成非天然存在的微生物生物体，所述微生物生物体根据需要产生含有nadph依赖性酶的任何途径中间体或产物。如本文所公开的，此类产生中间体的微生物生物体可与表达下游途径酶的另一微生物生物体组合使用以产生期望产物。然而，应当理解，产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体的非天然存在的微生物生物体可用于产生作为期望产物的中间体。
[0132]
本发明在本文中一般参照代谢反应、其反应物或产物或具体参照一种或多种核酸或基因来描述，所述核酸或基因编码与所参照的代谢反应、反应物或产物相关或催化所参照的代谢反应、反应物或产物的酶，或与所参照的代谢反应、反应物或产物相关的蛋白质。除非本文另有明确说明，否则本领域技术人员将理解，对反应的参照也构成对反应的反应物和产物的参照。类似地，除非本文另有明确说明，否则对反应物或产物的参照也参照反应，并且对这些代谢组分中任一种的参照也参照编码催化参照的反应、反应物或产物的酶或参与参照的反应、反应物或产物的蛋白质的一种或多种基因。同样，鉴于代谢生物化学、
酶学和基因组学的熟知领域，本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应编码的酶和其催化的反应或与反应相关的蛋白质以及反应的反应物和产物的参照。
[0133]
可通过引入编码一种或多种参与一种或多种生物合成反应的酶或蛋白质的可表达核酸来产生本发明的用于增加辅因子(诸如nadph)的可用性的非天然存在的微生物生物体，所述生物合成反应增加此类辅因子(诸如nadph)的可用性。可通过引入编码一种或多种参与例如一种或多种1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径的酶或蛋白质的可表达核酸来进一步产生本发明的非天然存在的微生物生物体。取决于选择用于生物合成的宿主微生物生物体，可表达用于一些或全部特定反应或系列反应的核酸，所述特定反应或系列反应增加nadph的可用性，以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。例如，如果所选宿主缺乏一种或多种用于期望生物合成途径的酶或蛋白质，则将用于一种或多种缺乏酶或蛋白质的可表达核酸引入该宿主中用于随后的外源表达。或者，如果所选宿主展现出一些途径基因的内源表达，但缺乏其他途径基因，则需要用于一种或多种缺乏酶或蛋白质的编码核酸，以实现增加的nadph可用性，以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。因此，可通过引入外源性酶或蛋白质活性来产生本发明的非天然存在的微生物生物体以获得期望的反应或系列反应。或者，可通过引入一种或多种外源性酶或蛋白质活性来获得期望的反应或系列反应，所述外源性酶或蛋白质活性与一种或多种内源性酶或蛋白质一起产生期望产物，诸如增加的nadph可用性，以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。
[0134]
宿主微生物生物体可选自例如细菌、酵母、真菌或任何适用于发酵过程的多种其他微生物，以及在例如细菌、酵母、真菌或任何适用于发酵过程的多种其他微生物中生成的非天然存在的微生物生物体。示例性的细菌包括选自以下的物种：大肠杆菌、产酸克雷伯菌(klebsiella oxytoca)、琥珀酸厌氧螺菌(anaerobiospirillum succiniciproducens)、琥珀酸放线杆菌(actinobacillus succinogenes)、琥珀酸曼氏杆菌(mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌、氧化葡糖杆菌(gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(clostridiunm acetobutylicum)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。示例性的酵母或真菌包括选自以下的物种：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、土曲霉(aspergillus terreus)、黑曲霉(aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、须根霉菌(rhizopus arrhizus)、米根霉(rhizobus oryzae)等。大肠杆菌是特别有用的宿主生物体，因为它是经充分表征的适于基因工程的微生物生物体。其他特别有用的宿主生物体包括酵母，诸如酿酒酵母。应当理解，任何适合的微生物宿主生物体均可用于引入代谢和/或遗传修饰以产生期望产物。
[0135]
取决于具有增加的nadph可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的所选宿主微生物生物体的组分，本发明的非天然存在的微生物生
物体将包含至少一种编码酶(其量足以增加nadph的可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸)的外源性核酸和最多达所有的编码核酸，包括用于例如一种或多种1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成途径的编码核酸。例如，可通过外源表达对应的编码核酸而在缺乏途径酶或蛋白质的具有增加的nadph可用性的宿主中建立1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。在缺乏例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径的所有酶或蛋白质的宿主中，可包含该途径中所有酶或蛋白质的外源表达，尽管应当理解，即使宿主含有至少一种途径酶或蛋白质，也可表达途径的所有酶或蛋白质。例如，在表达一种或多种用于增加nadph产生的酶或蛋白质的宿主中可包括用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的途径中的所有酶或蛋白质的外源表达。
[0136]
鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，以可表达的形式引入非天然存在的微生物生物体(其包含至少一种编码酶的外源性核酸，所述酶以足以增加nadph可用性的量表达，以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸)中的另外编码核酸的数量将至少与所选宿主微生物生物体的生物合成途径缺乏(诸如所选宿主微生物生物体的1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途缺乏)相当。因此，本发明的非天然存在的微生物生物体可具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或最多达所有编码酶或蛋白质的核酸，所述酶或蛋白质引起反应或系列反应，用于增加nadph的可用性，以用于产生例如本文所公开的1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。在一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体还可包含其他遗传修饰，所述遗传修饰促进或优化增加的nadph可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成，或将其他有用的功能赋予给宿主微生物生物体。一种此类其他功能性可包括例如促进一种或多种前体(增加nadph可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸所需)或一种或多种途径前体(增加例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的可用性所需)的合成。例如，前体可以是用于增加nadph可用性的前体，诸如nad 或nadp 。或者，前体可以是用于增加例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的产生的途径前体。
[0137]
通常，选择宿主微生物生物体，使得其产生用于增加nadph可用性的前体和/或增加期望产物(诸如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸)的可用性所需的途径前体，所述产物呈天然产生的分子形式或呈工程改造的产物形式，其提供期望前体的从头产生、或由宿主微生物生物体天然产生的前体的增加产生。如本文所公开的，可对宿主生物体进行工程改造以增加前体的产生。另外，已经工程改造以产生期望前体的微生物生物体可用作宿主生物体并进一步经工程改造以表达用于增加nadph的产生以及例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径的酶或蛋白质。
[0138]
在一些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物生物体由宿主生成，该宿主含有增加nadph的可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的酶促能力。在该具体实施方案中，增加nadph的合成或积累以例如驱动1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径反应分别朝向1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的产生可能有用。增加的合成或积累可通过例如
编码一种或多种本文所提供的用于增加nadph可用性的酶或蛋白质的核酸的过表达来实现。能够增加nadph的可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的本文所公开的一种或多种酶和/或一种或多种蛋白质的过表达可例如通过一种或多种内源性基因的外源表达或通过一种或多种异源基因的外源表达而发生。因此，天然存在的生物体可容易地生成为本发明的非天然存在的微生物生物体，其例如通过过表达一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种(取决于途径中酶的数量，即最多达所有)核酸，产生增加的nadph可用性，以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁(3r)-羟丁基酸酯、mma或氨基酸，所述核酸编码本文所公开的可增加nadph可用性的酶或蛋白质，以及例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径酶或蛋白质。另外，非天然存在的生物体可通过内源性基因的诱变生成，所述内源性基因导致本文所公开的可增加nadph可用性的酶以及例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径酶的活性增加。
[0139]
在特别有用的实施方案中，采用编码核酸的外源表达。外源表达赋予根据宿主和应用定制表达和/或调控元件的能力，以实现由用户控制的期望表达水平。然而，诸如通过去除负调控效应物或者当连接到诱导型启动子或其他调控元件时诱导基因的启动子，还可在其他实施方案中利用内源表达。因此，具有天然存在的诱导型启动子的内源性基因可通过提供适当的诱导剂而上调，或者内源性基因的调控区可经工程改造以掺入诱导型调控元件，由此允许在期望时间调控内源性基因的增加表达。类似地，可包括诱导型启动子作为引入非天然存在的微生物生物体中的外源性基因的调控元件。
[0140]
应当理解，在本发明的方法中，可将一种或多种外源性核酸中的任一种引入微生物生物体中以产生本发明的非天然存在的微生物生物体。可引入核酸以赋予例如一种或多种增加nadph可用性的酶。在某些实施方案中，可引入核酸以赋予具有例如增加的nadph可用性的微生物生物体，以及将例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径赋予给微生物。或者，可引入编码核酸以产生中间微生物生物体，所述中间微生物生物体具有催化一些所需反应的生物合成能力，从而赋予例如具有增加的nadph可用性以及例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成能力的微生物有机体。例如，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体(其中nadph用作例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中的辅因子)可包含至少两种编码期望酶或蛋白质的外源性核酸，诸如atp-nadh激酶和乙酰乙酰-coa还原酶的组合；nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)和(3r)-羟基丁酰3-氧代丁酸还原酶的组合；以及atp-nad 激酶和3-羟基丁醛还原酶的组合等。因此，应当理解，生物合成途径的两种或更多种酶或蛋白质的任何组合可包含在本发明的非天然存在的微生物生物体中。类似地，应当理解，生物合成途径的三种或更多种酶或蛋白质的任何组合可包含在本发明的非天然存在的微生物生物体，只要期望生物合成途径的酶和/或蛋白质的组合导致对应的期望产物的产生即可。类似地，如本文所公开的生物合成途径的四种或更多种酶或蛋白质的任何组合可根据期望包含在本发明的非天然存在的微生物生物体中，只要期望生物合成途径的酶和/或蛋白质的组合导致对应的期望产物的产生即可。类似地，如本文所公开的生物合成途径的四种、五种、六种、七种、八种或更多种酶或蛋白质的任何组合可根据需要包含在本发明的非天然存在的微生物生物体中，只要期望生物合成途径的酶和/或蛋白质的组
合导致对应的期望产物的产生即可。
[0141]
除了如本文所述的例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成之外，具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物和用于增加nadph可用性的本发明方法还可与彼此以及与本领域所熟知的其他微生物生物体和方法以各种组合利用，以通过其他途径实现产物生物合成。例如，除了使用例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生产者之外，在具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体中产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的一种替代方案是借助添加能够将例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体转化为例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的另一微生物生物体。一种此类程序包括例如产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体的微生物生物体的发酵。1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体然后可用作如本文所公开的具有增加的nadph可用性的第二非天然存在的微生物生物体的底物，所述第二非天然存在的微生物生物体将1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体转化为1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。可将1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间产物直接添加到具有增加的nadph可用性的第二非天然存在的微生物生物体的另一培养物中，或者可通过例如细胞分离使1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中间体生产者的原始培养物耗尽这些微生物生物体，然后可利用随后向发酵液中添加具有增加的nadph可用性的第二非天然存在的微生物生物体来产生最终产物而无中间体纯化步骤。
[0142]
在其他实施方案中，本文所公开的具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体和用于增加nadph可用性的本发明方法可装配在众多种亚途径中以实现例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成。在这些实施方案中，可将用于本发明期望产物的生物合成途径分离到不同的微生物生物体中，并且可将不同的微生物生物体共培养以产生最终产物。在此类生物合成方案中，一种微生物生物体的产物是用于第二种微生物生物体的底物，直到合成最终产物。例如，1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成可通过构建含有用于将一种途径中间体转化为另一种途径中间体或产物的生物合成途径的微生物生物体来实现，并且经由nadph依赖性酶进行将一种途径中间体转化为另一种途径中间体或产物的一种或多种微生物生物体可被构建为具有增加的nadph可用性，如本文所公开的。或者，1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸还可通过在同一容器中使用两种微生物进行共培养或共发酵，从一种或多种具有增加的nadph可用性的微生物生物体合成地产生，其中第一种微生物产生mma途径中间体或1，3-bdo途径中间体，且第二种微生物将中间体分别转化为1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。
[0143]
鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，对于非天然存在的微生物生物体和本发明的方法，连同其他微生物生物体，与具有亚途径的其他非天然存在的微生物生物体的共培养物，以及与本领域所熟知的其他化学和/或生物化学程序的组合，存在众多种组合和排列，以在如本文所公开的构建为具有增加的nadph可用性的非天然存在的生物体中产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。
[0144]
类似地，本领域技术人员理解，可基于用于引入一种或多种基因破坏的期望特征来选择宿主生物体，以增加nadph可用性，以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。因此，应当理解，如果要将遗传修饰引入宿主生物体中以破坏基因，则可类似地破坏催化相似但不相同的代谢反应的任何同源物、直系同源物或旁系同源物，以确保期望的代谢反应被充分破坏。因为在不同生物体之间的代谢网络中存在某些差异，所以本领域技术人员将理解，给定生物体中被破坏的实际基因可能在生物体之间不同。然而，鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，本发明的方法可应用于如本文所公开的构建为具有增加的nadph可用性的任何适合宿主微生物，以鉴别在目标物种中构建将增加例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成的生物体所需的同源代谢改变。在特定实施方案中，使得能够增加例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的产生的增加的nadph可用性将1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成与生物体的生长偶联，并且如果期望且如本文所公开的，可将例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的产生强制性地与生物体的生长偶联。
[0145]
用于增加nadph可用性的编码核酸以及用于增加例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径酶或蛋白质的核酸的来源可包括例如所编码的基因产物能够催化所参照反应的任何物种。此类物种包括原核生物体和真核生物体两者，包括但不限于细菌，包括古细菌和真细菌，以及真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人。此类来源的示例性物种包括例如大肠杆菌、福氏埃希杆菌(escherichia fergusonii)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus jannaschii)、问号钩端螺旋体(leptospira interrrogans)、硫还原地杆菌(geobacter sulfurreducens)、橙色绿屈挠菌(chloroflexus aurantiacus)、玫瑰弯菌属种rs-1(roseiflexus sp.rs-1)、聚集绿屈挠菌(chloroflexus aggregans)、木糖氧化无色杆菌(achromobacter xylosoxydans)、梭菌属种(clostrdia species)(包括克鲁佛梭菌(clostridium kluyveri)、共生梭菌(clostridium symbiosum)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(clostridium saccharoperbutylacetonicum)、永达尔梭菌(clostridium ljungdahlii))、阴道毛滴虫g3(trichomonas vaginalis g3)、布鲁斯锥虫(trypanosoma brucei)、发酵氨基酸球菌(acidaminococcus fermentans)、梭杆菌属种(fusobacterium species)(包括核粒梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、死亡梭杆菌(fusobacterium mortiferum))、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、褐鼠(rattus norvegicus)、智人(homo sapiens)、酵母属种(saccharomyces species)(包括酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))、曲霉属种(apsergillus species)(包括土曲霉、米曲霉(aspergillus oryzae)、黑曲霉)、玉米赤霉(gibberella zeae)、树干毕赤酵母(pichia stipitis)、分枝杆菌属种(mycobacterium species)(包括耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)、鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)(包括副结核亚种))、砂嗜盐孢菌(salinispora arenicola)、假单胞菌属种(pseudomonas species)(包括假单胞菌属种cf600、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa))、罗尔斯通菌属种(ralstonia species)(包括富养罗尔斯通菌(ralstonia eutropha)、富养罗尔斯通菌jmp134、富养罗尔斯通菌h16、皮氏罗尔斯通菌(ralstonia pickettii))、植物乳杆菌、
wiley and sons，baltimore，md(1999)。
[0148]
可使用本领域所熟知的技术(包括但不限于缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化)，将参与用于增加nadph的可用性以产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的途径的外源性核酸序列稳定地或瞬时地引入宿主细胞中。对于大肠杆菌或其他原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cdna中的一些核酸序列可编码靶向信号，诸如n末端线粒体靶向信号或另一靶向信号，如果期望，其可在转化到原核宿主细胞中之前被去除。例如，线粒体前导序列的去除导致大肠杆菌中的表达增加(hoffmeister等，j.biol.chem.280：4329-4338(2005))。对于酵母或其他真核细胞中的外源性表达，基因可在胞质溶胶中表达而不添加前导序列，或者可通过添加合适的靶向序列(诸如适于宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号)而靶向于线粒体或其他器官，或靶向于分泌。因此，应当理解，可将对核酸序列的适当修饰(以去除或包含靶向序列)掺入外源性核酸序列中以赋予期望的性质。此外，可用本领域所熟知的技术对基因进行密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
[0149]
一种或多种表达载体可被构建成包含一种或多种如本文所例示的各自编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，所述外源性核酸可操作地连接到在宿主生物体中起作用的表达控制序列。在一些实施方案中，一种或多种表达载体可进一步构建成包含如本文所例示的一种或多种例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径编码核酸，所述核酸可操作地连接到在宿主生物中起作用的表达控制序列。适用于本发明的微生物宿主生物体中的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括可操作用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或包括标志物。另外，表达载体可包含一种或多种可选标记基因和适当的表达控制序列。还可包含可选标记基因，所述可选标记基因例如提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷或供应不在培养基中的关键营养素。表达控制序列可包括本领域所熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两种或更多种外源编码核酸时，可将两种核酸插入例如单个表达载体或单独的表达载体中。对于单一载体表达，可将编码核酸可操作地连接到一种共同的表达控制序列，或连接到不同的表达控制序列，诸如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可使用本领域所熟知的方法来确认参与代谢或合成途径的外源性核酸序列的转化。此类方法包括例如核酸分析，诸如mrna的rna印迹(northern blot)或聚合酶链式反应(pcr)扩增，或用于基因产物表达的免疫印迹，或测试所引入的核酸序列或其对应的基因产物的表达的其他适合分析方法。本领域技术人员理解，外源性核酸以足以产生期望产物的量表达，并且进一步理解，可使用本领域熟知且如本文所公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。
[0150]
在一些实施方案中，本发明提供用于增加非天然存在的微生物生物体中的nadph可用性的方法，其包括在多种条件下培养上述非天然存在的微生物生物体且持续足以增加nadph可用性的时间段。此类培养可在基本上厌氧的培养基中并且可包括具有任何数量的如上文所述的外源性核酸的生物体。
[0151]
如上文所述，这些具有增加的nadph可用性的培养的生物体可进一步具有例如1，3-bdo途径、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径、mma途径、氨基酸生物合成途径、3hb-coa途径、己二酸途径、己内酰胺途径、6-aca途径、hmda途径或maa途径、或利用nadph的任何其
他功能途径。因此，在一些实施方案中，本发明提供用于增加非天然存在的微生物生物体中的nadph可用性的方法，其中增加nadph可用性使得1，3-丁二醇(1，3-bdo)、甲基丙烯酸甲基酯(mma)、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、3hb-coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda或maa增加。然而，应当理解，可修饰具有增加的nadph的非天然存在的微生物生物体以增加在其产生中使用nadph的任何产品的产生，并且上文所提供的示例不意在限制。
[0152]
本文还提供经由基于碳水化合物的碳原料增加非天然存在的微生物生物体中的nadph可用性、由此增加例如以下化合物的产率的方法：1，3-bdo；mma；(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯；氨基酸，诸如赖氨酸、苏氨酸、色氨酸或谷氨酸；3hb-coa；己二酸；己内酰胺；6-氨基己酸(6-aca)；六亚甲基二胺(hmda)；或甲基丙烯酸(maa)，所述方法包括在多种条件下培养上述非天然存在的微生物生物体且持续足以产生产物的时间段。
[0153]
可使用熟知方法进行适合的纯化和/或测定，以测试nadph以及下游产物(诸如例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸)的产生。可为每个待测试的工程改造菌株生长适合的重复，诸如一式三份培养物。例如，可监测经工程改造的产生宿主中的产物和副产物形成。可通过诸如hplc(高效液相色谱)、gc-ms(气相色谱-质谱)和lc-ms(液相色谱-质谱)的方法，或使用本领域所熟知的常规程序的其他适合的分析方法来分析最终产物和中间体以及其他有机化合物。还可用培养上清液测试发酵液中产物的释放。可通过hplc(使用例如用于葡萄糖和醇的折射率检测器和用于有机酸的uv检测器(lin等，biotechnol.bioeng.90：775-779(2005)))或本领域所熟知的其他适合的测定和检测方法，对副产物和残余葡萄糖进行定量。还可使用本领域所熟知的方法测定来自外源dna序列的单个酶或蛋白质活性。
[0154]
可使用本领域熟知的多种方法将利用nadph进行产生的化合物(诸如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma、氨基酸、3hb-coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda或maa)的产生与培养物中的其他组分分离。此类分离方法包括例如萃取程序以及包括以下的方法：连续液-液萃取、全蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤。所有上述方法都是本领域所熟知的。
[0155]
可培养本文所述的具有增加的nadph可用性的任何非天然存在的微生物生物体以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，可培养1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生产者，用于生物合成产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。
[0156]
例如，为了产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸，在具有碳源和其他必需营养素的培养基中培养重组菌株。有时期望并且非常期望在发酵器中维持厌氧条件以降低整个工艺的成本。可例如通过首先用氮气吹扫培养基、然后用隔片和卷边盖密封烧瓶来获得此类条件。对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株，可通过在隔片上打一个小孔以进行有限通气来施加微需氧或基本厌氧的条件。示例性厌氧条件已在先前描述并且是本领域所熟知的。示例性的需氧和厌氧条件描述于例如2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。发酵可以如本文所公开的分批、补料分批或连续方式进行。在一些实施方案中，本文所公开的具有增加的nadph可用性的微生物生物体将在高需氧条件下展现出改善的性能。
[0157]
如果期望，培养基的ph值可视需要通过添加碱(诸如naoh或其他碱)或酸来维持在
期望的ph值，特别是中性ph值，诸如约7的ph值，以将培养基维持在期望的ph值。可通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来确定生长速率，并通过随时间监控碳源耗减来确定葡萄糖摄取速率。
[0158]
生长培养基可包括例如可向非天然存在的微生物供应碳源的任何碳水化合物源。此类来源包括例如糖，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。碳水化合物的其他来源包括例如可再生原料和生物质。可用作本发明方法中的原料的生物质的示例性类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或原料部分。此类生物质原料含有例如可用作碳源的碳水化合物底物，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解除上文所例示的那些之外的可再生原料和生物质也可用于培养具有增加的nadph可用性以用于产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的本发明微生物生物体。
[0159]
除了可再生原料(诸如上文所例示的那些)之外，具有增加的nadph可用性以用于产生诸如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的本发明微生物生物体还可经修饰以在作为其碳源的合成气上生长。在该具体实施方案中，在具有增加的nadph可用性的产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物体中表达一种或多种蛋白质或酶，以为合成气或其他气态碳源的利用提供代谢途径。
[0160]
合成气体(也被称为合成气或发生炉煤气(producer gas))是煤和碳质材料(诸如生物质材料，包括农作物和残余物)气化的主要产物。合成气主要是h2和co的混合物，并且可从任何有机原料(包括但不限于煤、煤油、天然气、生物质和废弃有机物质)的气化获得。气化通常在高燃料与氧气的比率下进行。尽管主要是h2和co，但合成气还可包含较少量的co2和其他气体。因此，合成气体提供了成本有效的气态碳源，诸如co和另外的co2。
[0161]
wood-ljungdahl途径催化co和h2转化为乙酰-coa和其他产物，诸如乙酸。能够利用co和合成气的生物体通常还具有通过wood-ljungdahl途径所涵盖的相同的基本酶和转化组利用co2和co2/h2混合物的能力。早在揭示co也可被相同的生物体使用并且涉及相同的途径之前，就认识到co2由微生物h2依赖性地转化为乙酸。许多产乙酸菌已显示在co2存在下生长并产生诸如乙酸的化合物，只要氢存在以供应必要的还原当量(参见例如drake，acetogenesis，第3-60页，chapman和hall，newyork，(1994))。这可以通过以下方程式来概括：
[0162]
2 co2 4 h2 n adp n pi
→
ch3cooh 2h2o n atp
[0163]
因此，具有wood-ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可利用co2和h2混合物来产生乙酰-coa和其他期望产物。
[0164]
wood-ljungdahl途径是本领域所熟知的，并且由12个反应组成，所述反应可分为两个支路：(1)甲基支路和(2)羰基支路。甲基支路将合成气转化为甲基四氢叶酸(甲基-thf)，而羰基支路将甲基-thf转化为乙酰-coa。甲基支路中的反应由以下酶或蛋白质按顺序催化：铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸环化脱水酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。羰基支路中的反应由以下酶或蛋白质按顺序催化：甲基四氢叶酸：类咕啉蛋白甲基转移酶(例如，acse)、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白(例如，acsf)、铁氧还蛋白、乙酰-coa合酶、一氧化碳脱氢酶和镍蛋白装配蛋白(例如，cooc)。遵循本文所提供的关于引入足够数量的编码核酸以生成增加的nadph可
用性以用于产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的教导和指导，本领域技术人员将理解，关于至少引入编码宿主生物体中不存在的wood-ljungdahl酶或蛋白质的核酸，也可进行相同的工程改造设计。因此，将一种或多种编码核酸引入本发明的微生物生物体中使得修饰的生物体含有完整的wood-ljungdahl途径将赋予合成气利用能力。
[0165]
另外，还原(逆)三羧酸循环和/或氢化酶活性也可用于将co、co2和/或h2转化为乙酰-coa和其他产物，诸如乙酸。能够经由还原性tca途径固定碳的生物体可利用以下酶中的一种或多种：atp柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸：铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-coa合成酶、琥珀酰-coa转移酶、富马酸还原酶、富马酸酶、苹果酸脱氢酶、nad(p)h：铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶和氢化酶。具体来说，将通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶从co和/或h2提取的还原当量用于经由还原性tca循环将co2固定为乙酰-coa或乙酸。可通过诸如乙酰-coa转移酶、乙酸激酶/磷酸转乙酰酶和乙酰-coa合成酶的酶将乙酸转化为乙酰-coa。可通过丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶和糖异生酶将乙酰-coa转化为1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma、3hb-coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda或maa前体、甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸。遵循本文所提供的关于引入足够数量的编码核酸以在构建成具有增加的nadph可用性的生物体中生成例如1，3-bdo途径、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径、mma途径或氨基酸生物合成途径的教导和指导，本领域技术人员将理解，关于至少引入编码宿主生物体中不存在的还原性tca途径酶或蛋白质的核酸，也可进行相同的工程改造设计。因此，将一种或多种编码核酸引入本发明的微生物生物体中使得修饰的生物体含有完整的还原性tca途径将赋予合成气利用能力。
[0166]
因此，鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，可产生具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体，其当在诸如碳水化合物的碳源上生长时，分泌本发明的生物合成化合物。此类化合物包括例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸，以及1，3-bdo途径、(3r)-羟基丁基(3r)-羟基丁酸途径、mma途径或氨基酸生物合成途径中的任何中间代谢物。所需要的只是工程改造一种或多种所需的酶或蛋白质活性以实现期望化合物或中间体的生物合成，包括例如包含1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径中的一些或全部。因此，本发明提供具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体，当其在碳水化合物或另一碳源上生长时，产生和/或分泌1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物，并且当其在碳水化合物或另一碳源上生长时，分别产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径或1，3-bdo途径中所示的任何中间代谢物。本发明的产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的微生物生物体可从中间体起始合成。
[0167]
使用如本文所例示的本领域熟知的方法构建本发明的非天然存在的微生物生物体以外源性地表达至少一种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的核酸。在一些实施方案中，微生物生物体被进一步构建为以足以产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的量外源表达至少一种编码1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径酶或蛋白质的核酸。应当理解，在足以产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的条件下培养具有增加的nadph可用性的本发明微生物生物体。依照本文所提供的教导和指导，具有增加的nadph可用性的本发明的非天然存在的微生物生物体可实现增加的1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的
生物合成，导致约0.1-200mm或更高的细胞内浓度。通常，1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的细胞内浓度为约30-300mm，特别是约50-200mm，且更特别是约70-150mm，包括约70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm或更高。还可从本发明的非天然存在的微生物生物体实现这些示例性范围中的每一个之间和之上的细胞内浓度。
[0168]
在一些实施方案中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性厌氧条件已在先前描述并且是本领域所熟知的。用于发酵工艺的示例性厌氧条件描述于本文中并且描述于例如2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。这些条件中的任一种均可与非天然存在的微生物生物体以及本领域所熟知的其他厌氧条件一起采用。在此类厌氧或基本厌氧的条件下，具有增加的nadph可用性的1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生产者可以5-10mm或更高的细胞内浓度以及本文所例示的所有其他浓度分别合成例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。应当理解，即使上述描述是指细胞内浓度，产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的微生物生物体也可在细胞内分别产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸和/或将产物分泌到培养基中。
[0169]
除了本文所公开的培养和发酵条件之外，用于在如本文所公开的具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体中实现例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成的生长条件还可包括向培养条件中添加渗透保护剂。在某些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物生物体可如本文所述在存在渗透保护剂的情况下持续、培养或发酵。简单地说，渗透保护剂是指充当渗透溶质并帮助如本文所述的微生物生物体在渗透胁迫下存活的化合物。渗透保护剂包括但不限于甜菜碱、氨基酸和糖(海藻糖)。此类渗透保护剂的非限制性示例是甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭(dimethylthetin)、二甲基锍基丙酸(dimethylslfonioproprionate)、3-二甲基锍基-2-甲基丙酸、哌可酸(pipecolic acid)、二甲基锍基乙酸、胆碱、l-肉碱和四氢嘧啶。在一个方面，渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域普通技术人员应理解，适于保护本文所述微生物免受渗透胁迫的渗透保护剂的量和类型将取决于所用的微生物生物体。培养条件中渗透保护剂的量可以是例如不超过约0.1mm、不超过约0.5mm、不超过约1.0mm、不超过约1.5mm、不超过约2.0mm、不超过约2.5mm、不超过约3.0mm、不超过约5.0mm、不超过约7.0mm、不超过约10mm、不超过约50mm、不超过约100mm或不超过约500mm。
[0170]
培养条件可包括例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所述，可在厌氧或基本上厌氧的培养条件下获得本发明的生物合成产物的特别有用的产率。
[0171]
如本文所述，用于从具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体实现例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物生物体可在厌氧或基本厌氧的条件下持续、培养或发酵。简单地说，厌氧条件是指没有氧的环境。基本上厌氧的条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持在0％到10％饱和。基本上厌氧的条件还包括使细胞在维持小于1％氧的气氛的密封室内的液体培养基中或固体琼脂上生长或静息。可通过用n2/co2混合物或一种或多种其他适合的非氧气体吹扫培养物来维持氧的百分比。
[0172]
本文所述的培养条件可按比例放大和连续生长，用于制造例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸。示例性的生长程序包括例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法都是本领域所熟知的。发酵程序对于生物合成生产商业量的例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸特别有用。通常，并且与非连续培养程序一样，例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的连续和/或接近连续的产生将包括在足以持续和/或几乎持续指数阶段的生长的营养素和培养基中培养具有增加的nadph可用性的本发明的非天然存在的分别产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的生物体。此类条件下的连续培养可包括例如生长1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。另外，连续培养可包括1周、2周、3周、4周或5周或更多周且最长达几个月的更长时间段。或者，如果适合特定应用，则可将本发明的生物体培养数小时。应当理解，连续和/或接近连续的培养条件还可包括这些示例性时段之间的所有时间间隔。进一步应理解，培养本发明的微生物生物体的时间是足够长的时间段，以产生足够量的用于期望目的的产物。
[0173]
发酵程序是本领域所熟知的。简单地说，用于生物合成产生例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的发酵可用于例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离、或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵程序的示例是本领域所熟知的。
[0174]
除了使用例如具有增加的nadph可用性的本发明的1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生产者用于连续产生大量的例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的上述发酵程序之外，如果期望，还可使1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生产者例如同时进行化学合成程序以将产物转化为其他化合物，或者可将产物从发酵培养物中分离并依序进行化学转化以将产物转化为其他化合物。
[0175]
为了生成更好的生产者，可利用代谢建模来优化生长条件。建模还可用于设计另外优化途径利用的基因敲除(参见例如美国专利公开us 2002/0012939、us 2003/0224363、us 2004/0029149、us 2004/0072723、us 2003/0059792、us 2002/0168654和us 2004/0009466，以及美国专利号7,127,379)。建模分析允许可靠地预测在具有增加的nadph可用性的非天然存在的微生物生物体中将代谢转向更有效地产生1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸对细胞生长的作用。
[0176]
一种用于鉴别和设计有利于期望产物生物合成的代谢改变的计算方法是optknock计算框架(burgard等，biotechnol.bioeng.84：647-657(2003))。optknock是一种代谢建模和模拟程序，其提出导致过量产生靶产物的遗传稳定的微生物的基因缺失或破坏策略。具体来说，该框架检查微生物的完整代谢和/或生化网络，以提出迫使期望的生化物质变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过借助策略性放置的基因缺失或其他功能性基因破坏将生化产生与细胞生长偶联，在生物反应器中长时段保持后施加于工程改造菌株的生长选择压力由于强制性生长偶联的生化产生而使性能得以改善。最后，当构建基因缺失时，所设计的菌株回复到其野生型状态的可能性可以忽略，因为由optknock选择的基因将从基因组中完全去除。因此，该计算方法可用于鉴别导致期望产品生物合成的替代途径，或与非天然存在的微生物生物体结合使用以进一步优化期望产物的生物合成。
[0177]
简单地说，optknock是在本文中用于指用于对细胞代谢建模的计算方法和系统的术语。optknock程序涉及将特定约束纳入通量平衡分析(fba)模型中的模型和方法的框架。这些约束包括例如定性动力学信息、定性调控信息和/或dna微阵列实验数据。optknock还通过例如收紧通过通量平衡模型导出的通量边界以及随后在存在基因添加或缺失的情况下探测代谢网络的性能极限来计算各种代谢问题的解。optknock计算框架允许构建允许有效查询代谢网络的性能极限的模型表述，并提供用于解决所产生的混合整数线性规划问题的方法。本文称为optknock的代谢建模和模拟方法描述于例如2002年1月10日提交的美国公开2002/0168654、2002年1月10日提交的国际专利号pct/us02/00660和2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中，所述公开和专利的全部内容以引用方式并入。
[0178]
用于鉴别和设计有利于产物生物合成产生的代谢改变的另一计算方法是称为simpheny
tm
的代谢建模和模拟系统。该计算方法和系统描述于例如2002年6月14日提交的美国公开2003/0233218和2003年6月13日提交的国际专利申请号pct/us03/18838中。simpheny
tm
是一种计算系统，其可用于产生计算机模拟的网络模型，并模拟通过生物系统的化学反应的质量、能量或电荷的通量，以限定含有系统中化学反应的任何和所有可能函数性的解空间，从而确定生物系统的允许活动范围。该方法被称为基于约束的建模，因为解空间由诸如以下的约束限定：所包含反应的已知化学计量以及与通过反应的最大通量相关的反应热力学和容量约束。可询问由这些约束限定的空间，以确定生物系统或其生化组分的表型能力和行为。
[0179]
这些计算方法与生物现实一致，因为生物系统是灵活的，并且可以许多不同的方式达到相同的结果。生物系统是通过演化机制设计的，这些机制受到所有生命系统必须面对的基本约束的限制。因此，基于约束的建模策略涵盖这些一般现实。此外，经由约束的收紧而对网络模型连续施加进一步限制的能力导致解空间的大小减小，由此增强可预测生理表现或表型的精度。
[0180]
鉴于本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将能够应用用于代谢建模和模拟的各种计算框架来设计和实施宿主微生物生物体中期望化合物的生物合成。此类代谢建模和模拟方法包括例如上文例示为simpheny
tm
和optknock的计算系统。为了说明本发明，本文参照用于建模和模拟的optknock计算框架描述了一些方法。本领域技术人员将知道如何使用optknock将代谢改变的鉴别、设计和实施应用于本领域所熟知的任何此类其他代谢建模和模拟计算框架和方法。
[0181]
上述方法将提供待破坏的一组代谢反应。该组内的每个反应或代谢修饰的消除可在生物体的生长阶段期间产生作为专性产物的期望产物。由于反应是已知的，因此双层optknock问题的解也将提供编码一种或多种催化该组反应内每个反应的酶的相关基因。一组反应和其编码参与每个反应的酶的对应基因的鉴别通常是自动化过程，通过将反应与具有酶和编码基因之间的关系的反应数据库相关联来实现。
[0182]
一旦被鉴别，则通过至少一个编码该组反应内每个代谢反应的基因的功能性破坏而在靶细胞或生物体中实施该组反应，该组反应待破坏以便实现期望产物的产生。一种实现反应组的功能破坏的特别有用的手段是通过缺失每个编码基因。然而，在一些情况下，通过其他遗传畸变(包括例如调控区如启动子或针对调控因子的顺式结合位点的突变、缺失或者通过大量位置中任一位置处编码序列的截短)破坏该反应可能是有益的。这些导致基
因组不完全缺失的后者畸变可能是有用的，例如，当期望产物偶联的快速评估或当不太可能发生遗传回复变异时。
[0183]
为了鉴别上文描述的导致进一步的待破坏的反应组或可导致生物合成(包括期望产物的生长偶联的生物合成)的代谢修饰的双层optknock问题的另外的富有成效的解，可实施称为整数切割的优化方法。该方法通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束迭代地解决上文所例示的optknock问题而进行。整数切割约束有效地阻止解程序选择在任何先前迭代中鉴别的恰好相同的反应组，所述迭代将产物生物合成与生长强制偶联。例如，如果先前鉴别的生长偶联的代谢修饰指定反应1、2和3进行破坏，则接下来的约束阻止在后续解中同时考虑相同的反应。整数切割方法是本领域所熟知的并且可被发现描述于例如burgard等，biotechnol.prog.17：791-797(2001)中。与本文参照其与用于代谢模型和模拟的optknock计算框架的组合用途所述的所有方法一样，减少迭代计算分析中的冗余的整数切割方法也可与本领域所熟知的其他计算框架(包括，例如simpheny
tm
)一起应用。
[0184]
本文所例示的方法允许构建生物合成产生期望产物的细胞和生物体，包括靶生化产物的产生与经工程改造以含有所鉴别的遗传改变的细胞或生物体的生长的强制性偶联。因此，本文所述的计算方法允许鉴别和实施代谢修饰，所述代谢修饰通过选自optknock或simpheny
tm
的计算机模拟方法鉴别。代谢修饰组可包括例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能破坏，包括例如通过基因缺失破坏。
[0185]
如上文所讨论的，optknock方法的开发前提是当遭受长期的生长选择时突变微生物网络可朝向其计算地预测的最大生长表型演化。换句话说，该方法利用生物体在选择压力下自我优化的能力。optknock框架允许基于网络化学计量强迫形成生化产生和细胞生长之间的偶联的基因缺失组合的穷尽枚举。最佳基因/反应敲除的鉴别需要解决双层优化问题，所述解选择活性反应组，使得所得网络的最佳生长解过量产生目标生化物质(burgard等，biotechnol.bioeng.84：647-657(2003))。
[0186]
大肠杆菌代谢的计算机模拟的化学计量模型可用于鉴别用于代谢途径的必需基因，如先前所例示以及例如美国专利公开us 2002/0012939、us 2003/0224363、us 2004/0029149、us 2004/0072723、us 2003/0059792、us 2002/0168654和us 2004/0009466以及美国专利号7,127,379中所述。如本文所公开的，optknock数学框架可用于精确地定位导致期望产物的生长偶联产生的基因缺失。此外，双层optknock问题的解仅提供一组缺失。为了枚举所有有意义的解，即导致增长偶联产生形成的所有敲除组，可实施称为整数切割的优化技术。如上文所讨论的，这需要通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束迭代地解决optknock问题。
[0187]
如本文所公开的，可将编码增加nadph产生的期望活性的酶的核酸引入宿主生物体中。类似地，可将编码例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径的期望活性的核酸引入宿主生物体中。在一些情况下，可能期望修饰增加nadph或例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸生物合成途径酶或蛋白质的产生的酶的活性，以分别增加例如1，3-bdo、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、mma或氨基酸的产生。例如，可将增加蛋白质或酶活性的已知突变引入编码核酸分子中。另外，可应用优化方法来增加酶或蛋白质的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调控物的活性。
[0188]
一种此类优化方法是定向演化。定向演化是涉及引入靶向特异性基因的突变以改
271：13-20(2001))；用于产生杂合酶的增量截短(incremental truncation for the creation of hybrid enzymes，itchy)，其产生具有目的基因或基因片段的1个碱基对缺失的组合文库(ostermeier等，proc.natl.acad.sci.usa 96：3562-3567(1999)；和ostermeier等，nat.biotechnol.17：1205-1209(1999))；用于产生杂合酶的硫代增量截短(thio-itchy)，其与itchy相似，不同之处在于使用硫代磷酸dntp来生成截短(lutz等，nucleic acids res 29：e16(2001))；scratchy，其组合两种用于重组基因的方法(itchy和dna改组)(lutz等，proc.natl.acad.sci.usa 98：11248-11253(2001))；随机漂变诱变(rndm)，其中经由eppcr进行突变，之后筛选/选择那些保留有用活性的突变(bergquist等，biomol.eng.22：63-72(2005))；序列饱和诱变(sesam)，即随机诱变方法，其使用硫代磷酸核苷酸的随机掺入和切割生成随机长度片段池，所述随机长度片段池被用作模板以在“通用”碱基(诸如肌苷)存在下延伸，并且含有肌苷的补体的复制产生随机碱基掺入，并因此产生诱变(wong等，biotechnol.j.3：74-82(2008)；wong等，nucleic acids res.32：e26(2004)；和wong等，anal.biochem.341：187-189(2005))；合成改组，其使用设计为编码“靶中所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸并允许改组的后代具有极高多样性(ness等，nat.biotechnol.20：1251-1255(2002))；核苷酸交换和切除技术next，其利用dutp掺入、之后相继用尿嘧啶dna糖基化酶和哌啶处理的组合以进行终点dna片段化(muller等，nucleic acids res.33：e117(2005))。
[0191]
其他方法包括不依赖序列同源性的蛋白质重组(shiprec)，其中使用接头促进两个远缘或不相关基因之间的融合，并且在这两个基因之间生成一系列嵌合体，从而产生单交叉杂合物之文库(sieber等，nat.biotechnol.19：456-460(2001))；基因位点饱和诱变(gene site saturation mutagenesis
tm
，gssm
tm
)，其中起始材料包括超螺旋双链dna(dsdna)质粒，其含有插入物和两个在期望突变位点简并的引物(kretz等，methods enzymol.388：3-11(2004))；组合盒式诱变(ccm)，其涉及使用短寡核苷酸盒替代具有大量可能的氨基酸序列改变的限制区域(reidhaar-olson等，methods enzymol.208：564-586(1991)；和reidhaar-olson等，science 241：53-57(1988))；组合多重盒式诱变(cmcm)，其基本上与ccm相似，并以高突变速率使用eppcr来鉴别热点和热区域，随后通过cmcm延伸以覆盖蛋白质序列空间的限定区域(reetz等，angew.chem.int.ed engl.40：3589-3591(2001))；致突变株技术(mutator strains technique)，其中条件性ts致突变质粒利用mutd5基因(其编码dna聚合酶iii突变亚基)使选择期间的随机和自然突变频率增加20到4000倍且在无需进行选择时阻止有害突变的积累(selifonova等，appl.environ.microbiol.67：3645-3649(2001))；low等，j.mol.biol.260：359-3680(1996))。
[0192]
另外的示例性方法包括精确诱变(look-through mutagenesis，ltm)，其为评估和优化所选氨基酸的组合突变的多维诱变方法(rajpal等，proc.natl.acad.sci.usa 102：8466-8471(2005))；基因重装配，其为dna改组方法，其可同时应用于多个基因或创建单一基因的大型嵌合体文库(多个突变)(由verenium公司供应的可调基因重装配(tunable genereassembly)
tm
(tgr
tm
)技术)；计算机模拟的蛋白质设计自动化(pda)，其为优化算法，其锚定具有特定折叠的结构上限定的蛋白质主链且可为使折叠和总体蛋白质能量学稳定的氨基酸取代搜寻序列空间，并且一般对具有已知三维结构的蛋白质最有效地起作用
(hayes等，proc.natl.acad.sci.usa 99：15926-15931(2002))；和迭代饱和诱变(ism)，其涉及使用结构/功能知识来选择用于酶改善的可能位点，使用诸如stratagene quikchange(stratagene；san diego ca)的诱突方法在所选位点处进行饱和诱变，筛选/选择期望性质，和使用一个或多个改善的克隆，在另一位点处重新开始，且继续重复直到实现期望活性为止(reetz等，nat.protoc.2：891-903(2007)；和reetz等，angew.chem.int.ed engl.45：7745-7751(2006))。
[0193]
上述用于诱变的方法中的任一种均可单独使用或以任一组合使用。另外，如本文所述，定向演化方法中的任一种或组合可与自适应演化技术结合使用。
[0194]
在本技术通篇中引用了各种出版物。这些出版物(包括genbank和gi号出版物)的全部公开内容在此以引用方式并入本技术中，以便更全面地描述本发明所属的现有技术状态。尽管已参照上文提供的实施例描述了本发明，但应当理解，可在不脱离本发明的精神的前提下做出各种修改。
[0195]
实施例
[0196]
实施例i
[0197]
与厌氧工艺或微需氧工艺下的bdo产生菌株相比，微需氧工艺降低nadph的水平和比率
[0198]
以下实施例证实，与厌氧工艺和微需氧工艺下的bdo产生菌株相比，微需氧工艺降低nadph的水平和比率。
[0199]
为了产生1，3-bdo，在具有碳源和其他必需营养素的培养基中培养大肠杆菌菌株。使用产生bdo的菌株，在厌氧或微需氧条件下生长菌株。通过首先用氮气吹扫培养基、然后用隔片和卷边盖密封烧瓶来产生厌氧条件。通过首先用氮气冲洗带盖的厌氧瓶5min、然后在接种后用23g针头(bectondickenson)刺穿隔片来建立微需氧条件。在生长期间将针保持在瓶中以允许少量空气进入。使菌株在相应条件下生长以产生1，3-丁二醇(1，3-bdo)，并且测量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、总nadp[h]和总nad[h]水平，以及nadh/nad比率和nadph/nadp比率。
[0200]
如图1中所示，与其他条件相比，微需氧工艺中nadph水平和nadph/nadp比率显著下降。醇脱氢酶(adh)和醛脱氢酶(ald)是参与将3-羟基丁酰-coa(3hb-coa)转化为1，3-bdo的关键酶，并且依赖于nadph。这些结果表明，增加的nadph可用性可增加1，3-bdo的产生。
[0201]
实施例ii
[0202]
nadk和pntab的过表达改善1，3-丁二醇的滴度、速率和产率
[0203]
以下实施例证实，表达nad(p)转氢酶亚基α部分2(pntab)和nad激酶(nadk)的菌株显著改善了1，3-丁二醇(1，3-bdo)的滴度、速率和产率。
[0204]
在微需氧条件下培养有或无表达nadk和pntab的质粒的ech-10228大肠杆菌菌株。简单地说，在补充有10mm nahco3、20g/l d-葡萄糖和100mm mops(用以改善缓冲能力)、10μg/ml硫胺素和用于质粒维持的适当抗生素的m9基本盐类培养基(6.78g/l na2hpo4、3.0g/l kh2po4、0.5g/l nacl、1.0g/l nh4cl、1mm mgso4、0.1mm cacl2)中进行用于代谢物产生或生物转化的20毫升瓶培育。所有菌株均使用微需氧条件，我们通过首先用氮气冲洗带盖的厌氧瓶5min，然后在接种后用23g针头(bectondickenson)刺穿隔片来建立所述微需氧条件。
在生长期间将针保持在瓶中以允许少量空气进入。所有培养物均在35℃生长。在2-1biostatb 生物反应器(sartorius-stedim biotech)中，使用补充有20g/l d-葡萄糖的改良m9基本培养基((6.78g/l na2hpo4、3.0g/l kh2po4、0.5g/l nacl、2.0g/l nh4cl、1.0g/l(nh4)2so4、1mm mgso4、0.1mm cacl2)，利用11初始培养体积进行发酵。将温度保持在35℃，并且使用2m nh4oh(需氧阶段)或na2co3(微需氧阶段)将ph值保持在6.95。将搅动速率设置为700rpm。进给浓缩葡萄糖以将容器中的葡萄糖浓度维持在0.5到5.0g/l。
[0205]
确认使用表达质粒对nadk和pntab的表达。如表2中所示，pntab和nadk两者的质粒表达均大于相应的野生型(wt)表达水平，并且pntab质粒表达类似或高于染色体过表达水平。这证实，相对于野生型水平，使用质粒过表达pntab和nadk可提供表达的大幅增加。
[0206]
表2：
[0207]
蛋白质ech-10228(无质粒)ech-10228(p115-nadk-p115-pntab)1，3-bdo产生菌株pntab0.081.130.67nadk0.021.980.03
[0208]
将菌株培养50小时并测量1，3-bdo的滴度、速率和产率。表达pntab和nadk的菌株在低氧转移速率(otr)条件下显著改善了1，3-bdo滴度、速率和产率(图1)。另外，pntab和nadk的过表达产生显著更高的1，3-bdo和乙醇的比速率(图2)。在pntab和nadk过表达后，还观察到4-羟基-2-丁酮(4oh2b)和葡萄糖的更高比速率(图2)。此外，乙醇的比速率比1，3-bdo的比速率维持得更长(图2)。这些结果证实，pntab和nadk的过表达可增加1，3-bdo的产生率。
[0209]
产物浓度的测量证实pntab和nadk的过表达产生更大浓度的1，3-bdo、乙醇和氨基酸丙氨酸(图3)。结果还证实了不同的丙酮酸动力学。例如，pntab和nadk过表达产生较低的c3副产物，诸如缬氨酸和2-羟基戊酸(图3)。此外，相对于l15863宿主，过表达pntab和nadk的l16182菌株(p115-nadk-p115-pntab)中的乙酸减少了4倍。在l16182菌株中观察到乙酸的4倍降低。总之，这些结果证实pntab和nadk过表达增加1，3-bdo以及乙醇和丙氨酸的滴度。
[0210]
对包含过表达nadk和pntab的ech-10228宿主培养物的l16182菌株的碳分布分析表明，五种关键副产物占超过10％的产率损失。具体来说，乙醇占4.8％，3-羟基丁酸占2.1％，4-羟基-2-丁酮占1.3％，丙氨酸占1.5％，并且缬氨酸占1.2％。
[0211]
另外，确定了总碳消耗百分比的菌株间差异。包含过表达pntab和nadk的ech-10228宿主的l16182菌株与l15863菌株的比较显示1，3-bdo产生增加6.8％。此外，生物量减少大约5％，丙酮酸和丙氨酸减少大约2％，且乙酸减少大约1.4％。包含过表达pntab和nadk的ech-10228宿主的l16182菌株相对于包含不过表达pntab和nadk的ech-10228宿主的l15863宿主的比较揭示，在过表达pntab和nadk的宿主中，生物量减少2.1％，缬氨酸和2-羟基戊酸减少2.4％，且3-羟基丁酸、丙酮酸和乳酸减少0.5％。
[0212]
接着，在6、10、24和30小时测量代谢组学。代谢组学结果证实，在ech-10228宿主中过表达nadk和pntab的l16182菌株产生更高浓度的总nadph，以及更高的nadph/nadp比率(图4)。这些氧化还原趋势与ech-9838宿主中的pntab和nadk过表达一致。重要的是，nadph池的两倍增加并未显著改变nadh池(图4)。
[0213]
1，3-bdo途径和coa代谢物的测量揭示，在过表达pntab和nadk的菌株中，在6-10小
时后，3-羟基丁酰-coa(3hb-coa)的浓度高2-3倍，3hb-coa/coa和乙酰-coa/coa的比率也有相似的增加。这些增加与1，3-bdo和丙酮酸再消耗的峰值比速率一致(图5)。在24-30小时后，3hb-coa的浓度和乙酰-coa/coa比率较低(图5)。在30-48小时后，观察到1，3-bdo、乙醇和丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)通量的更低比速率(图5)。总之，这些结果表明，3hb-coa可用性可有助于降低1，3-bdo产生的比速率。此外，在随后的时间段期间较低的乙酰-coa/coa比率表明1，3-bdo的比速率下降而乙醇的比速率维持的原因。
[0214]
过表达nadk和pntab的l16182菌株相对于l15863菌株的比较证实，nadk和pntab的过表达导致较低的3hb-coa浓度，以及较低的3hb-coa/coa比率和乙酰-coa/coa比率。此外，过表达nadk和pntab的宿主中副产物3hb-coa的水平甚至低于在厌氧条件下生长的菌株。过表达nadk和pntab的宿主中coa水平的测量显示，coa水平与厌氧条件下产生的那些相当。结果进一步证实，pntab-nadk过表达产生较低的磷酸戊糖中间体，这与通过磷酸戊糖途径的较低通量一致。
[0215]
总之，这些结果证实，nadk-pntab过表达显著增加nadph/nadp比率和nadp[h]池大小，而不会负面地影响nadh水平。另外，微需氧条件下pntab和nadk的过表达使nadph/nadp的比率恢复到厌氧条件下观察到的水平。重要的是，pntab和nadk的过表达也增加了1，3-bdo的滴度、速率和产率。
[0216]
实施例iii
[0217]
nadk的突变直接将nadh转化为nadph并增加还原型辅因子可用性和1，3-bdo产生
[0218]
以下实施例证实，表达直接将nadh转化为nadph的nadk变体(atp-nadh激酶)的菌株增加还原型辅因子可用性和1，3-bdo产生。
[0219]
为了确定是直接将nadh转化为nadph的nadk变体，而不是作为涉及nadk和pntab的两步过程，将菌株l16933(nadk和pntab)与菌株l17786(过表达nadk变体)进行比较(图6b)。当两种菌株如上文所述在高通气条件下生长时，过表达nadk变体的菌株产生更高的nad(p)h水平并且具有更高的nad(p)h/nad(p)比率(图7)。此外，过表达nadk变体的l17786菌株由于稍后阶段更好的氧化还原而减少了3hb-coa和乙酰-coa的积累，这导致了更好的1，3-bdo通量(图7)。
[0220]
接着，监测通气对这两种菌株中1，3-bdo产生的作用。当这两种菌株在低通气条件下生长时，1，3-bdo产生的滴度、速率或产生产率几乎没有差异(图8a和图8b)。然而，当菌株在高通气条件下生长时，与过表达nadk和pntab的菌株l16933相比，过表达nadk变体的l17786菌株展示出1，3-bdo的更高滴度、更大速率和增加产生。这些结果证实，nadk变体能够在高通气条件下表现更好。
[0221]
表3：
[0222]
菌株(最终时间点)产率[g/g]滴度[g/l]速率[g/l/h]l150860.18239.61.10l169330.29974.22.36l17786-高通气0.36597.12.81
[0223]
通过比较l15086菌株、l16933(pntab和nadk)菌株和l17786(nadk变体)菌株中1，3-bdo的滴度、产率、速率和比速率，进一步证实1，3-bdo产生的改善。与上述结果一致，与过表达nadk和pntab的l16933菌株相比，过表达nadk变体的l17786菌株展示出1，3-bdo的更高
滴度、更高产率、更大速率和比速率(图9a-图9d)。此外，相对于l15086菌株，两种菌株都展示出1，3-bdo的更高滴度、更大速率、增加产率和更大比产率(图9a-图9d)。相对于l15086菌株，对l16933(pntab和nadk)菌株的1，3-bdo滴度、速率和产率的定量揭示，l16933菌株具有大约高2倍的滴度、高2倍的速率和高1.5倍的产率。相对于l15086菌株，对l17786(nadk变体)菌株的1，3-bdo滴度、速率和产率的定量揭示，l17786菌株具有大约高2.5倍的滴度、高2.5倍的速率和高2.0倍的产率。此外，相对于l16933(pntab和nadk)菌株，对l17786(nadk变体)菌株的1，3-bdo滴度、速率和产率的定量揭示，l17786菌株具有大约高1.25倍的滴度、高1.25倍的速率和高1.25倍的产率。
[0224]
％c分布的定量揭示，1，3-bdo产生的大部分改善是丙酮酸以及丙酮酸衍生副产物和tca产物减少的直接作用。分布到途径产物1，3-bdo、3-羟基丁酸(3hb)或4-羟基-2-丁酮(4oh2b)或c2产物(乙酸或乙醇)中的碳分数无显著差异。生物量的有效减少导致1，3-bdo的比速率的增加。
[0225]
l16933(pntab和nadk)菌株或l17786(nadk变体)菌株相对于l15086菌株之间的比较揭示，1，3-bdo的大部分改善是丙酮酸和丙酮酸衍生副产物以及tca产物减少的直接作用。分布到途径产物和c2中的碳分数无显著差异。此外，生物量的减少导致1，3-bdo产生的比速率增加。
[0226]
与丙酮酸的减少一致，相对于l16933菌株和l15086菌株两者，l17786(nadk变体)菌株具有更低浓度的丙酮酸和谷氨酸。另外，生物量相对于l15086菌株减少。
[0227]
在高通气条件下的表现能力在l17786(nadk变体)菌株中得到改善，并且使1，3-bdo的滴度、速率和产率显著改善。对l17786(nadk变体)菌株副产物的测量揭示，在高通气条件下，3-羟基丁酸(3hb)和丙氨酸仍然是主要副产物。总之，这些结果证实l17786(nadk变体)菌株展现出在1，3-bdo速率、滴度和产率方面的改善。此外，nadk变体菌株能够产生更高的nad(p)h水平和更高的nad(p)h/nad(p)比率，这有助于增加1，3-bdo途径通量。另外，nadk变体菌株在高通气条件下显示出改善的性能。
[0228]
实施例iv
[0229]
表达nadk变体的菌株展现出改善的1，3-bdo滴度、速率和产率
[0230]
接着，将l16933菌株(nadk和pntab)与l17786菌株(nadk变体)在中通气和高通气条件下的性能进行比较。将菌株培养超过30小时并连续测量1，3-bdo的滴度、速率、产生产率和比速率(图10a-图10d)。结果表明，相对于l16933菌株，l17786菌株在两种通气条件下均展现出1，3-bdo的滴度、速率和产率的改善(表4)。另外，观察到l17786菌株在中通气下的1，3-bdo产率最高。重要的是，结果证实，在高通气下，l16933菌株的1，3-bdo的滴度、速率、产生产率和比速率显著下降，而l17786菌株在高通气条件下具有更高的滴度和更高的速率。
[0231]
表4：
[0232]
菌株产率[g/g]滴度[g/l]速率[g/l/h]l16933-中通气0.33987.62.64l16933-高通气0.29974.22.36l17786-中通气0.37896.52.78l17786-高通气0.36597.12.81
[0233]
比较l17786和l16933菌株之间在中通气或高通气条件下的碳分布揭示，l17786菌株在两种条件下都优于l16933菌株。此外，与l17786菌株相比，在l16933菌株中观察到更高的丙酮酸和tca代谢物积累。
[0234]
中通气和高通气条件之间l16933的碳分布的比较揭示，在较高通气条件下，l16933菌株的性能急剧下降。相比之下，l17786在中通气和高通气条件之间的碳分布揭示，l17786菌株较稳健且对较高通气较不敏感。
[0235]
副产物谱揭示，l17786菌株的副产物积累减少。具体来说，相对于l16933菌株，l17786菌株展示出较低浓度的丙氨酸、丙酮酸、谷氨酸、甲酸、乳酸和乙酸。然而，尽管存在丙酮酸谱，但在整个微需氧发酵期间仍观察到丙氨酸的稳定增加。
[0236]
进一步分析用于1，3-bdo产生的条件和相关副产物。在前12小时期间，相对于稍后的时间点(12小时到结束)，两种菌株在高通气条件下的1，3-bdo、4-羟基-2-丁酮(4oh2b)、c2副产物和氧化还原的通量均增加(表5)。前12小时期间产生的产物和副产物的比较表明，相对于l16933菌株，l17786菌株增加3-羟基丁酸(3hb)途径副产物(表5)。相对于l16933菌株，对于l17786菌株，在后期阶段，丙酮酸、c2和4oh2b途径副产物展现出降低的通量(表5)。
[0237]
表5
[0238][0239]
丙酮酸(pyr)；乙酸和乙醇(c2副产物)；1，3-丁二醇(1，3-bdo)；4-羟基-2-丁酮(4oh2b)；3-羟基丁酸(3hb)。
[0240]
总之，这些结果表明l17786相对于l16933菌株展现出改善的性能。特定来说，l17786菌株在高通气下表现更好，而l16933菌株在较高通气条件下展现出性能的急剧下降。
[0241]
实施例v
[0242]
通量建模
[0243]
进行l17786菌株与l16933菌株相比在高通气条件下的通量建模。对总通量的分析揭示，向丙酮酸副产物(主要是丙氨酸和丙酮酸)穿梭的丙酮酸显著减少(图13)。另外，与l16933菌株相比，l17786菌株的c2副产物减少(图13)。例如，与l16933菌株相比，l17786菌株中的乙酸和乙醇两者均较低(图13)。
[0244]
1，3-bdo途径通量的测量值增加了大约25％(图13)。然而，观察到类似水平的c4副
产物(4-羟基-2-丁酮(4oh2b)和3-羟基丁酸(3hb))(图13)。重要的是，可用于从c3到c2(即，丙酮酸到乙酰-coa、乙酸和乙醇)的途径的氧化还原显著增加(3.7倍)。随后，根据发酵的前12小时且在12小时到结束，进一步分析l17786菌株与l16933菌株相比在高通气条件下的通量建模。对前12小时期间的总通量分析揭示，对于l17786菌株，较少的丙酮酸(26％)指向副产物。另外，对于l17786菌株观察到c2副产物(乙酸和乙醇)的减少(8％)。与来自总通量建模的结果一致，在前12小时期间，l17786菌株的1，3-bdo途径通量增加(14％)(图14)。值得注意的是，对于l17786菌株，3-羟基丁酸(3hb)显著增加(68％)，同时nad(p)h水平和nad(p)h/nad(p)比率更高(图14)。这些结果进一步表明，对于l16933菌株，从c3到c2的途径存在氧化还原限制。
[0245]
对从12小时到结束的总通量的分析表明，对于l17786菌株，有较少的指向副产物的丙酮酸(70％)(图15)。另外，l17786菌株的c2副产物(乙酸和乙醇)减少(30％)(图15)。途径通量的测量揭示，对于l17786菌株，1，3-bdo途径通量增加(18％)，且c4副产物减少(40％)(图15)。对于l17786菌株，还观察到可用于从c3到c2的途径的氧化还原显著增加(2.3倍)(图15)。
[0246]
总之，这些结果表明，对于l17786菌株，更高的氧化还原水平以及氧化还原比率产生更好的1，3-bdo滴度、速率和产率。总之，这揭示l17786菌株在较高的通气条件下更稳健。
[0247]
实施例vi
[0248]
gapa相对于gapn
[0249]
将内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶a(gapa)的氧化还原平衡分析与nad(p)依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)进行比较。gapa是大肠杆菌所固有的酶，其将糖酵解通量与nadh生成偶联，其中每次经由丙酮酸/甲酸脱氢酶、三羧酸(tca)循环或磷酸戊糖(pp)途径的氧化还原生成，生成1个co2(图16)。相比之下，外源性gapn将nadph生成与糖酵解通量偶联。与pp途径和tca循环不同，不生成co2(图16)。另外，nadph生成没有膜蛋白表达。
[0250]
在上文提供的实施例中，证实nadph的生成改善1，3-bdo的产生。为了确定gapn增加nadph生成的能力是否能够增加1，3-bdo产率，将表达野生型pntab的亲本菌株与不存在pntab的表达gapn的菌株进行比较。结果表明，对于较高的0.8mol/mol的1，3-bdo产率，gapn活性优于野生型pntab活性。重要的是，在没有pntab的情况下，发现gapn活性与1，3-bdo成比例。
[0251]
此外，1，3-bdo瞬时产率在微需氧生长期间增加，并且在产生阶段期间维持。
[0252]
然后将表达野生型pntab的亲本菌株与不存在pntab的表达gapn的菌株在三种不同途径下进行比较，每种途径对nadph的需求增加。在第一种途径中，当将nadh依赖性phab(phab 1500al)与nadh依赖性醛脱氢酶(ald)和nadph依赖性醇脱氢酶(adh)组合以将葡萄糖转化为1，3-bdo时，只需要一个nadph分子。在第二种途径中，当将nadph依赖性phab(phab 1500gm)与nadh依赖性ald和nadph依赖性adh组合以将葡萄糖转化为1，3-bdo时，需要两个nadph分子。在第三种途径中，当将nadph依赖性phab(phab 1500gm)与nadph依赖性ald和nadph依赖性adh组合以将葡萄糖转化为1，3-bdo时，需要三个nadph分子。对于需要增加nadph需求的每种途径，gapn活性更有益(图18)。
[0253]
总之，gapn提供了将糖酵解通量与nadph生成偶联的机会，而不会损失co2或依赖于pntab和nadk。另外，观察到gapn对gapa的相对活性从微需氧生长到生产阶段增加。此外，
在缺失pntab的菌株中，gapn相对于gapa的相对活性与1，3-bdo产率成比例。
[0254]
实施例vii
[0255]
gapn菌株的评价
[0256]
接着，评价gapn菌株产生1，3-bdo的能力。比较并评价具有不同修饰的七种不同菌株(表6)。
[0257]
表6：
[0258]
菌株背景l19034δgapa：：p119-cds_10662a(bmp)l19035δgapa：：p119-cds_10663a(bmm)l19036δnadk变体，wtpntabδgapa：：p119-cds_10662al19037δnadk变体，wtpntabδgapa：：p119-cds_10663al19012δnadk变体，wtpntabl18832对照菌株l178752017q2菌株平板对照
[0259]
使菌株在plexibox中在100％空气(300标准立方厘米每分钟；sccm)下在400rpm的恒定搅动下生长24小时。ssm52％葡萄糖烧瓶预培养和ssm54％葡萄糖48wp主培养。初始光密度(od)为0.4，并且填充体积包括1.6ml、1.4ml、1.2ml和1.0ml，有技术重复。
[0260]
对gapn菌株l19034、l19035、l19036和l19037中1，3-bdo的滴度、速率和产率的测量揭示，gapn菌株产生1，3-bdo(图19a-图19d)。这证实gapn菌株为1，3-bdo产生提供nadph的能力。然而，还观察到gapn菌株的滴度较低。由于gapa的完全缺失预计会减少nadh的产生，因此这些结果表明，将gapa调整为gapn表达而不是完全缺失将是有益的。
[0261]
实施例viii
[0262]
gapn和gapa表达调整
[0263]
可修饰gapa和gapn的表达以增加氧化还原可用性。为了增加nadph的产生，而不降低nadh的产生，gapn水平可在表达内源性gapa的菌株中过表达。gapn水平可被过表达，使得它们高于gapa水平。因此，gapa和gapn两者都将被表达，但外源gapn将以更高的水平表达。
[0264]
为了进一步增加氧化还原可用性，可使用nadph依赖性phab(phab1500gm)或nadh依赖性phab(phab 1500al)(图17)进行菌株构建。另外，可使用允许将nadh直接转化为nadph的nadk变体进行菌株构建，甚至可进一步增加氧化还原可用性(图17)。
[0265]
nadph可用性增加的集合效应可促进3-羟基丁醛(3hb-ald)转化为1，3-bdo并导致1，3-bdo产生的增加。类似地，维持内源性gapa水平可促进nadh的产生，由此使得3hb-coa能够转化为3hb-ald。总之，这证实gapn和gapa表达调整可使得能够增加氧化还原可用性。氧化还原辅因子可用性的这种增加可增加1，3-bdo的产生。
[0266]
在本技术通篇中引用了各种出版物。这些出版物(包括genbank和gi号出版物)的全部公开内容在此以引用方式并入本技术中，以便更全面地描述本发明所属的现有技术状态。尽管已参照上文提供的实施例描述了本发明，但应当理解，可在不脱离本发明的精神的前提下做出各种修改。