用于增加辅因子的微生物和方法与流程

技术特征：
1.一种具有增加的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)可用性的非天然存在的微生物生物体，其包含(a)一种或多种编码以足以增加nadph可用性的量表达的酶的外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸选自由以下组成的组(i)atp-nadh激酶、nad(p)转氢酶亚基α部分2(pntab)，(ii)atp-nad 激酶(nadk)，和(iii)nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapn)，(b)一种或多种发生在编码蛋白质或酶的基因中的基因衰减，其在所述破坏后导致所述非天然存在的微生物生物体的胞质溶胶中存在的nadph与nadh的比率增加，或(c)(a)和(b)的组合。2.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含一种外源性核酸。3.根据权利要求2所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述一种外源性核酸编码atp-nadh激酶。4.根据权利要求2所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述一种外源性核酸编码gapn。5.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含两种外源性核酸。6.根据权利要求5所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述两种外源性核酸编码pntab和nadk。7.根据权利要求5所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述两种外源性核酸编码atp-nadh激酶和gapn。8.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含三种外源性核酸。9.根据权利要求8所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述三种外源性核酸编码atp-nadh激酶、pntab和nadk。10.根据权利要求8所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述三种外源性核酸编码gapn、pntab和nadk。11.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含四种外源性核酸。12.根据权利要求11所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述四种外源性核酸编码gapn、atp-nadh激酶、pntab和nadk。13.根据权利要求3、7、9或12中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述atp-nadh激酶是变体atp-nad 激酶。14.根据权利要求1到13中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中nadph/nadp比率增加。15.根据权利要求4、7、10或12中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述gapn以比内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶a(gapa)更高的水平表达。16.根据权利要求4、7、10、12或15中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所
述gapn与内源性gapa加上所述gapn的比率为至少约10％到约90％。17.根据权利要求15或16中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中内源性gapa包括衰减的gapa。18.根据权利要求17所述的非天然存在的微生物生物体，其中衰减的gapa包含降低的gapa表达。19.根据权利要求4、7、10、12、15-18中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述gapn增加nadph的产生。20.根据权利要求4、7、10、12或15-18中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述gapn来自甲烷营养细菌。21.根据权利要求1到20中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述gapn来自甲醇芽孢杆菌(bacillus methanolicus)。22.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述一种或多种基因衰减包括编码非质子易位性nadh脱氢酶ii(ndh-2)的基因中的基因衰减。23.根据权利要求22所述的非天然存在的微生物生物体，其中编码ndh-2的基因中的所述基因衰减包括ndh-2的缺失。24.根据权利要求22或23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述ndh-2的衰减降低nadph消耗。25.根据权利要求1到21中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述编码酶的外源性核酸由选自由内源性启动子、组成型启动子和诱导型启动子组成的组的启动子调控。26.根据权利要求1到25中任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其进一步包含1，3-丁二醇(1，3-bdo)途径、甲基丙烯酸甲酯(mma)途径、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径、氨基酸产生途径、3-羟基丁酰-辅酶a(3hb-coa)、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-aca)途径、六亚甲基二胺(hmda)途径或甲基丙烯酸(maa)途径。27.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含1,3-bdo途径。28.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述1，3-bdo途径包含乙酰乙酰-coa还原酶(coa依赖性，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰-coa还原酶(coa依赖性，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基，2-丁酮还原酶；乙酰乙酰-coa还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰-coa还原酶(醛形成)；和3-羟基丁酰-coa还原酶(醇形成)。29.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径。30.根据权利要求29所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯途径包含(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯形成酶；(3r)-羟基丁酰-coa：(r)-1，3-丁二醇转移酶；3-氧代丁酸(3r)羟基丁基酯形成酶；乙酰乙酰-coa：(r)-1，3-丁二醇转移酶；3-氧代丁酸(3r)-羟基丁基酯还原酶；(3r)-羟基丁酰-acp：(r)-1，3-丁二醇酯合酶和乙酰乙酰-acp：(r)-1，3-丁二醇酯合酶。31.根据权利要求27或29所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体
包含编码乙酰乙酰-coa还原酶(phab)的核酸。32.根据权利要求31所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述乙酰乙酰-coa还原酶是突变体乙酰乙酰-coa还原酶。33.根据权利要求32所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述突变体乙酰乙酰-coa还原酶使用nadh作为底物。34.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含3hb-coa途径。35.根据权利要求34所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述3hb-coa途径包含乙酰-coa硫解酶和3-羟基丁酰-coa脱氢酶。36.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含mma途径。37.根据权利要求36所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述mma途径包含：(a)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、2-羟基异丁酰-coa脱水酶和甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-coa脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。38.根据权利要求37所述的非天然存在的微生物生物体，其进一步包含第二mma途径，所述第二mma途径包含：(c)甲基丙烯酸(maa)-coa：甲醇转移酶、4-羟基丁酰-coa变位酶和3-羟基异丁酰-coa脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-coa变位酶、3-羟基异丁酰-coa：甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。39.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含氨基酸产生途径。40.根据权利要求39所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述氨基酸产生途径包括色氨酸产生途径、苏氨酸产生途径、赖氨酸产生途径或谷氨酸产生途径。41.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含6-aca途径。42.根据权利要求41所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述6-aca途径包含2-氨基-7-氧代辛二酸酮酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸氧化还原酶、2-氨基庚二酸脱羧酶、6-氨基己醛氧化还原酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶或2-氨基-7-氧代辛二酸氨基酸脱羧酶。43.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含己内酰胺途径。44.根据权利要求43所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述己内酰胺途径包含3-氧代己二酰-coa硫解酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、3-羟基己二酰-coa脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-coa还原酶、己二酰-coa还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-coa/酰基-coa转移酶和6-氨基己酰-coa合酶。45.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含
coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda和maa。55.一种用于经由基于碳水化合物的碳原料增加非天然存在的微生物生物体中的nadph可用性、由此增加一种或多种选自由以下组成的组的化合物的产率的方法：1，3-bdo、mma、(3r)-羟基丁酸(3r)-羟基丁基酯、氨基酸、3hb-coa、己二酸、己内酰胺、6-aca、hmda和maa，所述方法包括在多种条件下培养根据权利要求1到54所述的非天然存在的微生物生物体且持续足以产生产物的时间段。

技术总结
本公开提供具有增加的诸如NADPH的辅因子的可用性的微生物生物体，以用于增加各种产物的产生，所述各种产物包括1，3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁酸(3R)-羟基丁基酯、氨基酸、3HB-CoA、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，以及由这些中的任一种制成的产物。还提供一种或多种编码以足以增加NADPH可用性的量表达的酶的外源性核酸，其中所述外源性核酸包括ATP-NADH激酶、pntAB、nadK和gapN中的一种或多种。还提供一种或多种在诸如NDH-2的基因中发生的基因衰减，所述基因衰减导致NADPH与NADH的比率增加。本公开中还提供所述外源性核酸和基因缺失的各种组合。本公开还提供其制备和使用的方法，包括用于培养细胞以及用于所述各种产物的所述产生的方法。产生的方法。产生的方法。


技术研发人员：H
受保护的技术使用者：基因组股份公司
技术研发日：2020.10.22
技术公布日：2022/8/12