疫苗缀合物的制作方法

1.本发明涉及包含b细胞和t细胞表位的缀合物、包含所述缀合物的疫苗组合物、它们在预防和治疗癌症(例如前列腺癌)中的用途，以及包含所述缀合物和/或疫苗组合物的试剂盒。还要求保护的是特定的含t细胞表位的抗原肽和编码它们的核酸，以及包含这些核酸的构建体和载体。


背景技术：

2.今天使用的许多有效疫苗是针对感染的疫苗，其中主要疫苗成分是减毒或灭活的病原体，例如脊髓灰质炎疫苗。另一种有效的疫苗策略是使用类毒素(即毒素的灭活形式)来刺激针对毒素本身的免疫应答。这样的疫苗特别适用于对抗由单一外毒素毒力因子介导的感染。众所周知且有效的类毒素疫苗包括破伤风和白喉疫苗。
3.然而，虽然这样的疫苗经常被证明是有效的，但这些传统方法在生产针对一些重要病原体的疫苗方面并不成功。这样的方法也不适合生产癌症疫苗，即预防和/或治疗癌症的疫苗。癌症疫苗是旨在使用抗原性癌症标志物刺激针对癌细胞的免疫应答的疫苗。需要新的方法来生产癌症疫苗，并且这些方法也可能有助于寻找针对传染病的疫苗。一种这样的方法是肽疫苗，其中掺入多个t细胞表位的单个肽(通常长度小于50个氨基酸)用作疫苗抗原。
4.wo 2011/115483公开了一种疫苗缀合物，其包含与抗原、免疫原或包含抗原或免疫原的载体缀合的源自破伤风毒素的肽。
5.大多数人在生命早期就接种了破伤风疫苗，尤其是在西方世界。根据世界卫生组织的数据，2015年全球有约86％的婴儿接种了破伤风疫苗，这意味着抗破伤风抗体在高比例人群中流通。如上所述，破伤风疫苗使用破伤风类毒素(ttd)，它是破伤风毒素(ttx)的灭活形式。这意味着产生的循环抗体对ttx/ttd中存在的表位具有特异性。
6.ttx包含通过二硫键连接的重链(α链)和轻链(β链)。ttx重链(其完整序列如seq id no:22所示)的n末端区域先前被发现包含重要的b细胞和t细胞表位(raju等(1996),j.autoimmun.9:79-88；fischer等(1994),mol.immunol.31:1141-1148)，包括包含序列gitelkkl(seq id no:23，对应于序列如seq id no:22所示的ttx重链的第383-390位氨基酸)的片段，包括序列figitelkkleskinkvf(seq id no:1)。
7.前列腺癌是全球第二常见的癌症类型，并且是包括英国在内的80多个国家男性中诊断的最常见的癌症。尽管前列腺癌通常进展缓慢，并不总是需要积极治疗，但据报道，2012年它是全球超过300000人死亡的原因。特别是对于转移性前列腺癌，目前的治疗选择有限，因此对有效治疗的医疗需求尚未得到满足。本发明旨在解决这种目前未满足的医疗需求。
8.多种前列腺癌抗原及其表位在本领域中是已知的并且公开在例如younger等(2008),prostate cancer prostatic dis.11:334-341；mcneel等(2001),cancer res.61:5161-5167；johnson&mcneel(2012),prostate 72:730-730；matsueda等(2005),
clin.cancer res.11:6933-6943；kiessling等(2012),cancers 4:193-217；kiessling等(2008),eur.urol.53:694-708；matera(2010)cancer treat.rev.36:131-141；qin等(2005),immunol.lett.99:85-93中。
9.一种与前列腺癌相关的抗原蛋白是谷氨酸羧肽酶2(gcpii)。gcpii是一种由前列腺癌细胞过表达(也可以由其他恶性肿瘤表达)的跨膜蛋白。作为前列腺癌的血清标志物，由于其膜结合形式，它的用途有限，然而成像技术已经成功开发并且是基于pet的。使用用gcpii肽脉冲的树突细胞，存在已在晚期疾病中显示部分临床反应的疫苗(salgaller等(1998),prostate 35(2):144-151)。
10.另一种与前列腺癌相关的抗原蛋白是前列腺酸性磷酸酶(pap)。pap是一种细胞结合型和分泌型糖蛋白，由前列腺细胞产生，并且主要位于前列腺上皮中。在发展为癌症的过程中，细胞结合的pap表达降低而可溶性表达增强，这可以标志向中/高风险前列腺癌的转变(zimmerman(2009),purinergic signal.5(3):273-275)。


技术实现要素：

11.本发明涉及包含含有cd8 和cd4 t细胞癌表位二者的抗原的缀合物，以及基于这样的癌表位的疫苗组合物。
12.在一个方面，本发明提供了一种缀合物，其包含与含t细胞表位的抗原缀合的至少一个含b细胞表位的肽，其中：
13.(i)所述至少一个含b细胞表位的肽包含最小破伤风类毒素表位(mtte)，所述mtte包含：
14.(a)至少10个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸在seq id no:22中连续并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl；或者
15.(b)与(a)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
16.其中所述含b细胞表位的肽不是完整的破伤风毒素β链；
17.(ii)所述含t细胞表位的抗原是从n末端到c末端包含以下的多肽：
18.(a)易位肽；
19.(b)cd8 t细胞癌表位；和
20.(c)cd4 t细胞癌表位；
21.其中蛋白酶体切割位点可任选地存在于所述cd8 t细胞表位和所述cd4 t细胞表位之间；并且
22.(iii)所述含t细胞表位的抗原的n末端缀合至所述含b细胞表位的肽；并且其中
23.(iv)所述至少一个含b细胞表位的肽和所述含t细胞表位的抗原的缀合是直接的或间接的。
24.在本发明的一个实施方案中，所述含b细胞表位的肽与所述含t细胞表位的抗原直接连接。
25.在本发明的一个实施方案中，所述含t细胞表位的抗原从n末端到c末端由以下组成：
26.i)易位肽；
27.ii)cd8 t细胞癌表位；
28.iii)间隔区；和
29.iv)cd4 t细胞癌表位；
30.其中所述间隔区提供蛋白酶体切割位点。
31.在本发明的一个实施方案中，所述含b细胞表位的肽通过接头与所述含t细胞表位的抗原连接。
32.在本发明的一个实施方案中，所述接头是肽序列或任何其他化学基团或部分。
33.在本发明的一个实施方案中，上述(ii)(a)中提及的易位肽介导将所述含t细胞表位的抗原或所述cd8 t细胞表位向宿主细胞的内质网中的tap驱动的转运。
34.在另一个方面，本发明提供了一种缀合物，其包含与含t细胞表位的抗原缀合的至少一个含b细胞表位的肽，其中：
35.(i)所述至少一个含b细胞表位的肽包含最小破伤风类毒素表位(mtte)，所述mtte包含：
36.(a)至少10个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸在seq id no:22中连续并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl；或者
37.(b)与(a)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
38.其中所述含b细胞表位的肽不是完整的破伤风毒素β链；
39.(ii)所述含t细胞表位的抗原包含cd8 t细胞癌表位和cd4 t细胞癌表位，其中所述cd8 t细胞癌表位选自seq id no:2-seq id no:6中任一个，或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列；并且所述cd4 t细胞癌表位选自seq id no:7-seq id no:11中任一个，或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；并且
40.(iii)所述含t细胞表位的抗原的n末端与所述含b细胞表位的肽缀合。
41.在另一个方面，本发明提供了一种缀合物，其包含与含t细胞表位的抗原缀合的至少一个含b细胞表位的肽，其中：
42.(i)所述至少一个含b细胞表位的肽包含最小破伤风类毒素表位(mtte)，所述mtte包含：
43.(a)至少10个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸在seq id no:22中连续并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl；或者；
44.(b)与(a)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
45.其中所述含b细胞表位的肽不是完整的破伤风毒素β链；
46.(ii)所述含t细胞表位的抗原是包含seq id no:18的20-35个氨基酸的肽或与这样的片段具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的肽；并且
47.(iii)所述含t细胞表位的抗原的n末端与所述含b细胞表位的肽缀合。
48.本发明的又一方面是包含至少一种本发明的缀合物的疫苗组合物。
49.在另一个方面，本发明提供了本发明的缀合物或疫苗组合物，其用于治疗。
50.在另一个方面，本发明提供了本发明的缀合物或疫苗组合物，其用于治疗或预防癌症，例如前列腺癌。
51.本发明的一个方面是一种用于预防或治疗癌症(例如前列腺癌)的方法，其包括向需要这种预防或治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所公开和要求保护的缀合物或疫苗组合物。
52.本发明的又一方面是本文公开和要求保护的缀合物或疫苗组合物在制备用于预防或治疗癌症(例如前列腺癌)的药物中的用途。
53.本发明的另一方面是一种多肽，其包含seq id no:13-seq id no:17中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，其中所述多肽从n末端到c末端包含：
54.(a)易位肽；
55.(b)cd8 t细胞癌表位；和
56.(c)cd4 t细胞癌表位；
57.其中任选的蛋白酶体切割位点可以存在于所述cd8 t细胞癌表位和所述cd4 t细胞癌表位之间。
58.在本发明的一个方面，所述易位肽可以介导将所述多肽或至少所述cd8 t细胞表位向宿主细胞的内质网中的tap驱动的转运。
59.本发明的另一方面是一种多肽，其包含seq id no:106-seq id no:110任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，其中所述多肽从n末端到c末端包含：
60.(a)cd8 t细胞癌表位；和
61.(b)cd4 t细胞癌表位；
62.其中任选的蛋白酶体切割位点可以存在于所述cd8 t细胞癌表位和所述cd4 t细胞癌表位之间。
63.本发明还提供包含编码本发明的多肽的核苷酸序列或由其组成的核酸分子、包含本发明的核酸分子的构建体和包含本发明的核酸分子或构建体的载体。
64.在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒或组合疗法产品，其包含本发明的疫苗组合物和第二治疗活性剂。
65.本发明的一个方面提供了一种制备如本文所公开和要求保护的缀合物的方法，包括以下步骤：
66.(i)将至少一个含b细胞表位的肽连接到核心化合物上；以及
67.(ii)将含t细胞表位的抗原连接到(i)的产物上。
68.在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
69.(i)将至少一个包含硫醇基团的含b细胞表位的肽连接到包含至少一个马来酰亚胺基团和第二官能团的核心化合物，其中所述含b细胞表位的肽的硫醇基团与所述核心化合物的马来酰亚胺基团反应形成加合物，其中所述含b细胞表位的肽通过琥珀酰亚胺基团与所述核心化合物连接；
70.(ii)将包含能够与所述核心化合物的第二官能团反应以形成连接的反应性基团的含t细胞表位的抗原通过抗原的反应性基团与所述核心化合物的第二官能团反应连接到(i)的加合物，以形成包含各自连接到所述核心化合物的至少一个含b细胞表位的肽和含t细胞表位的抗原的缀合物；
71.(iii)使所述核心化合物的至少一个琥珀酰亚胺环开环，其中所述开环可以在步骤(ii)之前或之后发生。
72.在一个实施方案中，每个含b细胞表位的肽的c末端氨基酸包含硫醇基团。在另一
个实施方案中，每个含b细胞表位的肽的n末端氨基酸包含硫醇基团。在另一个实施方案中，硫醇基团提供在与含b细胞表位的肽、优选与其n末端或c末端氨基酸偶联的分子上。
73.在一个实施方案中，含t细胞表位的抗原的反应性基团是叠氮基团，其可以通过所述抗原的n末端氨基酸或通过所述抗原的c末端氨基酸与含t细胞表位的抗原偶联。
74.核心化合物中的官能团(该官能团能够与含t细胞表位的抗原的反应性基团反应，例如与叠氮基团反应)可以是包含炔部分的基团，例如环炔基团，例如c5-c10环炔基团，例如环辛炔基团，例如二苯基环辛炔基团。
75.在一个实施方案中，含b细胞表位的肽的硫醇基团由c末端半胱氨酸残基提供。在另一个实施方案中，步骤(iii)的开环是通过水解。
76.在又一个实施方案中，核心化合物包含一个、两个或至少三个(例如3个)马来酰亚胺基团，并且一个、两个或至少三个(例如3个)含b细胞表位的肽与其连接。含b细胞表位的肽可以相同或不同。
77.如本文所用的“含b细胞表位的肽”是包含被抗体识别的表位的抗原。
78.术语“抗原”通常是指能够诱导适应性免疫应答(无论是体液(抗体)还是细胞)的任何物质(最常见的是蛋白质)。然而，在本公开中，为了区分包含b细胞表位的缀合物的抗原与包含t细胞表位的缀合物的抗原，包含b细胞表位的抗原将始终称为“含b细胞表位的肽”，而包含t细胞表位的抗原将始终称为“含t细胞表位的抗原”。
79.如本文所用，术语“肽”可与术语“多肽”互换，是指通过肽键共价连接的氨基酸的聚合物。“肽”或“多肽”还可以包括一个或多个修饰的氨基酸，例如通过肉豆蔻基化、硫酸化、糖基化或磷酸化修饰的氨基酸。
80.术语“表位”是指给定抗原内足以在受试者中引发免疫应答的单个免疫原性位点，即表位是抗原决定簇，抗原的实际上被抗体或b/t细胞受体结合的特定部分。取决于免疫应答的类型，表位可以是线性序列或构象表位(保守的结合区)。因此，t细胞表位是抗原中与t细胞受体结合的位点，而b细胞表位是抗原中与b细胞受体(或抗体)结合的位点。
81.在一个实施方案中，并且如下文更详细描述的，可在施用缀合物之前向受试者施用(单独的)疫苗以诱导针对破伤风毒素的免疫应答(更具体地，诱导受试者产生针对破伤风毒素的抗体)。这样的疫苗可以包含例如破伤风类毒素，或破伤风毒素片段的组分，例如破伤风毒素重链的片段的组分。或者，可以被动施用抗破伤风毒素(例如抗ttd)抗体，例如使用来自高滴度抗ttd供体的分离的igg级分。
82.在本发明的一个方面，用于本发明的缀合物的含b细胞表位的肽包含来自ttx序列的b细胞表位，称为最小破伤风毒素表位(mtte)。
83.在本发明的一个实施方案中，存在于本发明的缀合物中的mtte包含以下或由以下组成：
84.(a)至少10个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸在seq id no:22中连续并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl；或者
85.(b)与(a)的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
86.seq id no:22对应于ttx重链。seq id no:23对应于ttx重链的第383-390位氨基酸，即seq id no:22的第383-390位氨基酸。
87.mtte可以包含至少12个或至少15个在seq id no:22中连续的氨基酸，例如至少18个在seq id no:22中连续的氨基酸，或由其组成，并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl。mtte可以包含至多20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个在seq id no:22中连续的氨基酸或由其组成，并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl。在本发明的另一些实施方案中，mtte可以包含与至少12个、15个或18个在seq id no:22中连续的氨基酸的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列。在本发明的另一些实施方案中，mtte可以包含与至多20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个在seq id no:22中连续的氨基酸的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列。
88.根据本发明，包含与至少10个在seq id no:22中连续的氨基酸的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列的mtte被称为seq id no:22的序列片段的“变体”(seq id no:22的序列片段是指10个或更多个氨基酸的序列，这些氨基酸在seq id no:22中连续并且包含seq id no:23所示的序列，但不构成完整的ttx重链)。当本发明的缀合物中存在的含b细胞表位的肽包含seq id no:22的序列片段的变体或由其组成时，重要的是该变体序列被抗ttx抗体识别。可以通过本领域已知的任何方法确定特定序列是否被抗ttx抗体识别。在本发明的示例性实施方案中，使用tettox elisa来确定抗ttx抗体与氨基酸序列的结合。如本文所定义的“tettox elisa”是对抗ttx抗体特异性的elisa测定。
89.本领域技术人员将理解如何进行elisa测定以鉴定抗ttx抗体是否结合目的seq id no:22的特定变体序列片段。这样的序列片段可以通过本领域已知的任何方法产生，例如化学合成。可以从接受破伤风类毒素疫苗的人类供体中以多克隆抗体血清获得抗ttx抗体。示例性的tettox elisa方案在wo 2011/115483中有详细描述，并且如其中公开的，可以如下进行tettox elisa：
90.用链霉亲和素包被96孔板(例如来自euro-diagnostica，阿纳姆，荷兰)，然后用含5％bsa的pbs封闭(200μl/孔，1小时，室温)。然后用含0.05％聚山梨醇酯20(例如20)的pbs洗板3次。
91.然后通过将板与100μl/孔的2μg/ml生物素化肽在含1％bsa的pbs中的溶液在室温下孵育1小时来用生物素化的目的肽(即，包含seq id no:22的变体序列片段的肽)包被板。然后将板用含0.05％聚山梨醇酯20的pbs洗涤3次，并应用第一抗体。通过将板与来自如上定义的人类受试者(即已接受破伤风类毒素疫苗的受试者)的100μl/孔血清溶液在室温下孵育1小时来应用第一抗体。血清可以用含1％bsa的pbs稀释，例如血清可稀释至少1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:500、1:1000、1:2000、1:4000直至1:100000或更多以确定滴度。然后将板用含0.05％聚山梨醇酯20的pbs洗3次。
92.然后通过将每个孔与适当的抗人igg抗体在室温下孵育1小时来应用第二抗体。抗人igg抗体可以与辣根过氧化物酶(hrp)缀合，例如可以使用小鼠抗人igg-hrp单克隆，克隆g18-145，becton dickinson no.555788。应用100μl/孔的第二抗体溶液，其在含0.05％聚山梨醇酯20的pbs中适当稀释。第二抗体可根据制造商的说明进行稀释，例如1:1000、1:
2000、1:5000稀释系数。然后用含0.05％聚山梨醇酯20的pbs洗板3次。
93.可以使用本领域已知的任何合适的方法来鉴定与目的肽结合的抗体，例如使用abts(2,2
’‑
连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))和h2o2。使用abts，根据每个孔中溶液在415nm处的光密度测量过氧化物酶活性，光密度可以使用酶标仪(例如bio-rad 680型)测量。
94.可以在每个板中包括阴性对照，例如来自没有可检测到的抗ttx抗体的人类受试者的血清。bsa溶液也可用作阴性对照。合适的阴性对照的另一个实例是与具有乱序mtte序列而不是seq id no:22的变体序列片段的目的肽一起使用的目的第一抗体血清。示例性的乱序mtte序列具有seq id no:98所示的氨基酸序列，其对应于seq id no:1的乱序版本。也可以包括阳性对照。这种阳性对照可以是目的变体序列的天然(野生型)序列。对照和实验测定都可以至少一式两份或一式三份进行。
95.目的肽可以单独接受来自至少10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、100、120、150、200或250或更多人类受试者的血清样品。人类受试者可以是随机选择的，或者可以是具有高滴度抗ttx抗体的人类受试者，例如至少100国际单位(iu)/ml，如使用ttx的野生型片段作为目的肽使用上述tettox elisa测定。
96.包含seq id no:22的序列片段的变体或由其组成的如本文所述的mtte被至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的测试的人血清样品中的抗体结合。或者，mtte被所有测试的人血清样品(即100％的样品)中的抗体结合。技术人员将理解如何确定elisa是否给出阳性结果，表明第一抗体与目的肽的结合。如果对于特定血清样品确定的光密度比对于阴性对照确定的光密度高至少2.0、2.5、3.0、3.5或更多倍，则可以认为肽被血清样品中的抗体结合。
97.在上述的tettox elisa中，第一抗ttx抗体可以作为从供体制备的纯化抗ttx抗体提供，而不是直接在来自人类受试者的血清中提供。例如，可以使用(sanquin，阿姆斯特丹，荷兰)。在这种情况下，将tetaquin在含1％bsa的pbs中以不同浓度稀释，并将100μl/孔稀释的tetaquin应用于目的肽。该程序的其余部分可以如上文详述的那样执行。
98.在一个实施方案中，本发明的缀合物中存在的mtte包含seq id no:1所示的氨基酸序列或与seq id no:1所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。seq id no:1是18个氨基酸的序列，其对应于ttx重链的第381-398位氨基酸(即seq id no:22的第381-390位氨基酸)。seq id no:23的序列位于seq id no:1的第3-10位。如wo 2011/115483中详述的，seq id no:1的第3-5和11位对于其在刺激免疫应答中的功能特别重要。
99.在本发明的其他实施方案中，mtte包含与seq id no:1所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，其中对应于seq id no:1的第3-5和11位的位置处的氨基酸相对于seq id no:1的第3-5和11位处的氨基酸没有变化。
100.在另一些实施方案中，本发明的缀合物中存在的mtte包含seq id no:30-seq id no:86中任一个中所示的氨基酸序列或与seq id no:30-seq id no:86中任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
101.含b细胞表位(mtte)的肽可以包含在mtte的n末端和/或c末端的间隔区序列。n末端间隔区序列可用于将mtte与含b细胞表位的肽的n末端分开，而c末端间隔可用于将mtte与含b细胞表位的肽的c末端分开。含b细胞表位的肽的任何不构成mtte部分的部分可被认为是间隔区。在本发明的一个实施例中，间隔区序列位于mtte的c末端。
102.间隔区序列可以是任何长度。在本发明的一个实施方案中，间隔区序列的长度为至少5个氨基酸且长度为至多20个氨基酸，例如5至18个氨基酸，或5至15个，或5至12个，或6至18个，或6至15个，或6至12个，或8至18个，或8至15个，或8至12个氨基酸。间隔区序列可以是任何氨基酸序列。
103.在本发明的一个实施方案中，间隔区的长度为至少5个氨基酸并且不是源自ttx序列。ttx蛋白被编码为前毒素形式的单一蛋白，随后被切割以产生重链和轻链。全长ttx蛋白具有seq id no:26(uniprot登录号p04958)所示的氨基酸序列，并且ttx轻链具有seq id no:27所示的氨基酸序列。因此在这个实施方案中，间隔区具有不存在于重或轻ttx链中的序列，即它不存在于seq id no:22或seq id no:27中。
104.在本发明的一个实施方案中，间隔区序列包含seq id no:28、seq id no:99或seq id no:102所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
105.在本发明的一个实施方案中，含b细胞表位的肽包含半胱氨酸残基。在另一些实施方案中，含b细胞表位的肽仅包含一个半胱氨酸残基。半胱氨酸残基可位于mtte内，或在间隔区内，或在含b细胞表位的肽的n或c末端。半胱氨酸残基可用于将含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原缀合。在本发明的一个实施方案中，半胱氨酸残基位于含b细胞表位的肽的c末端。例如，含b细胞表位的肽可以包含从n末端到c末端由以下组成的肽，或由其组成：具有seq id no:1的mtte，具有seq id no:28或seq id no:99的间隔区，以及半胱氨酸残基。这种含b细胞表位的肽分别具有seq id no:21或seq id no:100所示的序列(seq id no:21的含b细胞表位的肽从n末端到c末端包含seq id no:1的mtte和具有seq id no:102的间隔区)，并且因此，本发明的缀合物的含b细胞表位的肽可以包含seq id no:21或seq id no:100的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
106.含b细胞表位的肽因此可以通过源自含b细胞表位的肽的硫醇基团与含t细胞表位的抗原缀合。在具体实施方案中，如上文详述，硫醇基团是半胱氨酸残基的侧链硫醇基团。然而，硫醇基团可以在半胱氨酸残基以外提供。事实上，含b细胞表位的肽根本不需要包含半胱氨酸残基。硫醇基团可以由任何包含这种基团的化合物提供。含b细胞表位的肽可以与含硫醇基团的分子缀合。肽与分子的缀合必须通过在所得缀合物中留下游离硫醇基团的方式进行，从而游离硫醇基团可用于将含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原缀合。在含b细胞表位的肽与含硫醇基团的分子缀合的情况下，该分子优选与肽的n末端或c末端氨基酸缀合。
107.含b细胞表位的肽可以通过本领域已知的任何方法合成，例如使用蛋白质表达系统，或通过非生物系统中的化学合成，例如通过液相合成或固相合成。
108.可以通过本领域已知的任何方法将含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原缀合。例如，含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原的缀合可通过含b细胞表位的肽的n末端氨
基，或通过其c末端羧基，或通过任何反应性侧链基团。例如，可以通过丝氨酸或苏氨酸的羟基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基或赖氨酸的ε-氨基进行缀合。或者可以通过位于含b细胞表位的肽内的半胱氨酸残基的硫醇基团进行缀合。或者，含b细胞表位的肽可通过非共价相互作用与含t细胞表位的抗原缀合。
109.含b细胞表位的肽可以与含t细胞表位的抗原直接或间接缀合。如下文将更详细描述的，含b细胞表位的肽可通过共价或非共价键(例如肽键)与含t细胞表位的抗原直接缀合，或可通过连接基团或部分间接缀合。这可以是基于肽的接头基团(即肽序列)，或者它可以是基于非肽的接头部分或基团。
110.在一个实施方案中，本发明的缀合物包含至少一个如本文定义的含b细胞表位的肽，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或20个含b细胞表位的肽。在另一些实施方案中，本发明的缀合物包含至多50个、40个、30个、25个、20个、15个或10个如本文所定义的含b细胞表位的肽。在又一个实施方案中，本发明的缀合物包含至少两个如本文所定义的含b细胞表位的肽，或至少三个如本文所定义的含b细胞表位的肽。在一个实施方案中，本发明的缀合物包含三个含b细胞表位的肽。
111.根据本发明的一个或多个含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原的缀合可以通过含t细胞表位的抗原的n末端氨基酸，例如通过含t细胞表位的抗原的n末端氨基酸的侧链基团或含t细胞表位的抗原的n末端氨基。或者，一个或多个含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原的缀合可以通过含t细胞表位的抗原的c末端氨基酸，例如通过含t细胞表位的抗原的c末端氨基酸的侧链基团或含t细胞表位的抗原的c末端羧基。
112.本发明的一个实施方案是包含一个含b细胞表位的肽的缀合物，其中含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原通过含b细胞表位的肽的c末端与含t细胞表位的抗原的n末端之间的肽键直接缀合，即缀合物可以由包含含b细胞表位的肽和含t细胞表位的抗原二者的单个肽链组成。或者，含b细胞表位的肽和含t细胞表位的抗原可通过肽接头连接。
113.将含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原(或包含含t细胞表位的抗原的载体)缀合的方法是本领域已知的，例如在hermanson(1996),bioconjugate techniques,academic press；us 6,180,084；和us 6,264,914中，并且包括例如用于将半抗原连接到载体蛋白的方法，如在应用免疫学中常规使用的(参见harlow&lane(1988),"antibodies:a laboratory manual",cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny，通过引用并入本文)。
114.接头部分可用于将含b细胞表位的肽与含t细胞表位的抗原缀合。接头部分可以以化学部分或化合物的形式提供，其包含反应性基团或官能团，用于与在相应的含b细胞表位的肽和含t细胞表位的抗原上或中提供的相应或同源的官能团或反应性基团反应。这样的接头部分可以被认为是肽和抗原分别连接或偶联以形成缀合物的核心化合物。在本发明的一个实施方案中，缀合物包含与(i)至少一个含b细胞表位的肽和(ii)含t细胞表位的肽连接的核心化合物(或接头部分)。
115.在本发明的一个实施方案中，本发明的缀合物的含b细胞表位的肽通过肽接头与含t细胞表位的抗原缀合。
116.在另一个实施方案中，接头部分(例如核心化合物)可以包含马来酰亚胺基团，用于与肽和/或抗原中存在的硫醇基团缀合(即连接)。硫醇基团可存在于含b细胞表位的肽
中，因此其通过琥珀酰亚胺基团与缀合物中的核心化合物连接。在另一些实施方案中，接头部分(例如核心化合物)可以包含其他(即任何)能够与待缀合的肽和抗原中存在的功能性或反应性基团反应的功能性或反应性基团。因此，接头部分(例如核心化合物)可以包含两个或更多个化学基团，这些化学基团与待缀合的肽和抗原中或上的化学基团反应。存在于肽和抗原中或肽和抗原上的这样的化学基团可称为同源化学基团(或同源反应性/官能团)。
117.在一个实施方案中，核心化合物中的与存在于含b细胞表位的肽中的化学/反应性/官能团反应的化学/反应性/官能团不同于核心化合物中的与存在于含t细胞表位的抗原中的化学/反应性/官能团反应的化学/反应性/官能团，并且分别存在于肽和抗原中的同源化学/反应性/官能团是不同的。广泛的不同反应性基团(或官能团)和这样的反应性基团/官能团可基于的偶联化学是本领域已知的并在文献中报道，并且可以使用任何这样的反应性基团(或替代地称为反应性部分或官能团或官能部分)。
118.在一个实施方案中，反应性基团(例如与含t细胞表位的抗原反应的反应性基团)是或包含炔基，例如环炔基。环炔基可以是例如c5-c10环炔基，例如环辛炔基。在一个实施方案中，反应性基团可以是或可以包含二苯基环辛炔基。炔烃反应性基团可以与在待缀合的肽或抗原中或肽或抗原上(例如含t细胞表位的抗原中或其上)提供的叠氮基反应。在一个实施方案中，含b细胞表位的肽通过肽中的硫醇基团和核心化合物中的马来酰亚胺基团之间的硫醇-马来酰亚胺键(即，通过琥珀酰亚胺基团)偶联到化合物核心，并且含t细胞表位的抗原通过抗原中存在的叠氮基和核心化合物中的炔基之间的键偶联到化合物核心。
119.可以通过本领域已知的任何方式将叠氮基引入到肽中，例如引入到含t细胞表位的抗原中，例如在其n末端处。因此，含叠氮基的部分可以与抗原，例如与其n末端氨基酸偶联。例如，可以在n末端引入叠氮基羧酸基团，例如叠氮基-c2-c8羧酸，例如叠氮基六烯酰基或叠氮基丙酰基。这可以通过使抗原与叠氮基羧酸反应以将叠氮基羧酸与抗原的n末端氨基酸偶联来实现，例如通过抗原的n末端氨基和叠氮羧酸的羧酸基团之间的酰胺键。或者，可以在抗原的肽合成过程中将在侧链中包含叠氮基的氨基酸衍生物引入抗原中，并且可以存在于抗原肽链中的任何位置。
120.接头可以是、或包含、或基于或衍生自具有二苯基环辛炔peg间隔区的三氨基-2,2-二甲基丙酸。这具有式i所示的结构：
[0121][0122]
式i的中间体化合物中的氨基可通过保护基团(例如boc(叔丁氧羰基)基团)保护。这样的保护基团可以在随后的反应之前除去。
[0123]
在一个实施方案中，式i化合物的氨基可以用具有式ii所示结构的丙酰马来酰亚胺官能化，以产生具有式iii所示结构的官能化接头。如上文讨论的，这样的官能化接头可
被视为接头部分或核心化合物。
[0124]
式ii
[0125][0126]
三个含b细胞表位的肽(bcecp)可以通过硫醇基团与马来酰亚胺基团缀合到式iii的结构上。硫醇基团与马来酰亚胺基团的缀合在本领域中是常见的，并且通过将硫醇盐迈克尔加成到马来酰亚胺双键以形成琥珀酰亚胺基硫醚(site)而发生。
[0127]
含t细胞表位的抗原(tceca)可首先与己酰叠氮化物(式iv)缀合：
[0128]
式iv：
[0129]
在式iv的结构中，含t细胞表位的抗原可以通过在含t细胞表位的抗原的n末端氨基和叠氮基己酸的羧基之间形成的酰胺键直接结合到叠氮基己酸基团。然而，如上所述，叠氮基可替代地作为在抗原肽链的任何位置处引入的衍生氨基酸的侧链的一部分引入。式iv的叠氮基己酰基抗原或任何含叠氮基的抗原可以在碳-碳三键的位置处与接头缀合。所得结构如式v所示：
[0130][0131]
本发明的一个实施方案是式v所示结构的缀合物，其中三个硫原子中的每一个是相关的含b细胞表位的肽的半胱氨酸残基的硫醇基团的硫。wo 2011/115483中教导了制备这样的缀合物的方法。
[0132]
本发明的另一些实施方案是式vi或式vii结构的缀合物：
[0133][0134][0135]
式vi或式vii的缀合物可以通过式v的缀合物的开环获得。
[0136]
如本领域技术人员已知且显而易见的，site的琥珀酰亚胺环的水解产生异构的琥珀酰胺酸硫醚(sate)。同样在本发明范围内的是式vi缀合物的结构异构体、对映异构体、非对映异构体和立体异构体，或式vii缀合物的结构异构体、对映异构体、非对映异构体和立体异构体。式vi和式vii的缀合物的排列或立体化学和/或其组合的任何变化都在本发明的
范围内。
[0137]
site的琥珀酰亚胺环的水解可以在适当的条件下自发发生(参见例如fontaine等，同上)。开环可以在ph 5或更高，例如约ph 6(例如在ph 5.5和ph 6.5之间)，或在ph 7或更高或ph 8或更高的水溶液中进行。该溶液可以包含另外的溶剂，例如提高缀合物溶解度的溶剂，例如乙腈或叔丁醇。溶液可以被缓冲，例如可以使用碳酸盐缓冲剂(例如碳酸氢钠)维持所需的ph。开环可以在高于室温的温度下进行，例如至少25℃、30℃、40℃或50℃或更高，例如25℃至35℃或约30℃。例如，开环可以在约30℃、在约6的ph下在包含乙腈和叔丁醇和nahco3缓冲剂的溶液中进行。开环发生在包含b细胞表位的肽与接头核心缀合之后，但可发生在含t细胞表位的抗原与接头核心缀合之前或之后。合成后，可以通过本领域已知的任何方法纯化缀合物，例如通过使用hplc。
[0138]
本发明的a型缀合物因此包含含有在cd4 t细胞癌表位的n末端的cd8 t细胞癌表位的抗原。
[0139]
cd8 t细胞癌表位是由i类mhc(mhc i)分子呈递的表位；cd4 t细胞癌表位由ii类mhc(mhc ii)分子呈递。cd8 t细胞识别抗原-mhc i复合物，而cd4 t细胞识别抗原-mhc ii复合物。如本领域技术人员所知，mhc i分子基本上由所有有核细胞表达，而mhc ii分子通常由专职抗原呈递细胞(apc)和活化的t细胞以及一些肿瘤细胞表达。apc特别包括树突细胞、巨噬细胞和b细胞，但其他细胞类型也可被视为apc。mhc i分子主要呈递由细胞溶质/细胞内蛋白质降解产生的肽；mhc ii分子呈递由外源蛋白质降解产生的肽。mhc i分子的主要功能是呈递来自细胞内病原体(例如病毒)的表位和由天然基因突变产生的表位(例如癌抗原)。mhc ii分子主要用于呈递来自细胞外病原体和/或毒素等的表位，例如细菌或寄生虫感染。一些apc(例如树突细胞)能够在称为交叉呈递的过程中呈递由mhc i分子上的外源蛋白质降解产生的肽。交叉呈递对于激活cd8 细胞以对抗通常不感染apc的细胞内感染以及攻击产生健康apc中未发现的抗原的肿瘤细胞等方面很重要。
[0140]
cd8 t细胞也称为细胞毒性t细胞(ctl)。当由mhc i呈递的cd8 t细胞表位被ctl识别时，ctl的反应是释放杀死靶细胞的细胞毒素。相反，当cd4 t细胞表位被cd4 t细胞(辅助t细胞)识别时，cd4 t细胞被激活以支持免疫系统其他部分的免疫应答。
[0141]
根据本发明的cd8 t细胞癌表位可以是任何癌来源的肽，当由mhc i呈递时，其被cd8 t细胞识别。对肽的序列或长度没有限制，只要它可以被cd8 t细胞识别即可。通常肽为9-10个氨基酸长，但在一些情况下可以为8-15个氨基酸长。类似地，根据本发明的cd4 t细胞癌表位可以是任何癌来源的肽，当由mhc i呈递时，其被cd4 t细胞识别。对肽的序列或长度没有限制，只要它可以被cd4 t细胞识别即可。通常它为至少11个氨基酸长，可以高达30个氨基酸长。
[0142]
cd8 t细胞表位的长度通常为8-10个氨基酸，尽管这可能会有所不同。如本文所定义的cd8 t细胞癌表位的长度可以为8-15个氨基酸。如本文所定义的cd4 t细胞癌表位的长度可以为11-30个氨基酸。如本文所用，含t细胞表位的抗原可以是15-50或20-50个氨基酸长。在本发明的实施方案中，抗原可以为至少15个、20个、25个、26个、27个或30个氨基酸长。在另一些非限制性实施方案中，抗原可以为至多100个、90个、80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个或34个氨基酸长。例如，含t细胞表位的抗原可以是15-40个氨基酸长，例如20-40个、25-35个或28-34个氨基酸长。
[0143]
t细胞表位可以通过实验鉴定，例如通过t细胞表位作图，其方法是本领域已知的(例如流式细胞术，参见kern等(1998),nat med 4:975-978)。也可以使用生物信息学方法预测t细胞表位(参见例如desai&kulkarni-kale(2014),methods mol.biol.1184:333-364)。如本文所定义的t细胞表位可以通过本领域已知的任何方法来鉴定。
[0144]
含t细胞表位的抗原包含在cd4 t细胞癌表位n末端的cd8 t细胞癌表位。表位可以直接或间接连接。因此，cd8 t细胞癌表位可以紧邻cd4 t细胞癌表位的n末端，即表位可以直接相邻，在cd8 t细胞癌表位的c末端氨基酸和cd4 t细胞癌表位的n末端氨基酸之间没有插入氨基酸。或者，两个表位可以被至少一个氨基酸的间隔区隔开。这种间隔区可以是任何长度，例如1-10个氨基酸，例如1-9个、1-8个、1-7个或1-6个氨基酸，例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸。
[0145]
癌相关表位可以是来自与癌症相关的野生型蛋白质的表位，例如通常在癌症或某些癌症中过表达的蛋白质。许多这样的癌症相关蛋白的实例是本领域已知的。
[0146]
在本发明的一个实施方案中，cd8 t细胞癌表位和cd4 t细胞癌表位中的至少一种来源于与前列腺癌相关的蛋白质。在本发明的另一方面，cd8 和cd4 t细胞癌表位来源于与前列腺癌相关的蛋白质。在这种情况下，cd8 和cd4 t细胞癌表位可能来自相同的前列腺癌相关蛋白，或来自不同的前列腺癌相关蛋白。
[0147]
cd8 和/或cd4 t细胞癌表位可来源的前列腺癌相关蛋白的一个实例是谷氨酸羧肽酶2(gcpii)。gcpii具有uniprot登录号q04609，并且由基因folh1编码。人gcpii的氨基酸序列如seq id no:24所示。
[0148]
前列腺癌相关蛋白的另一个实例是前列腺酸性磷酸酶(pap)。pap具有uniprot登录号p15309，并且由基因acpp编码。人pap的氨基酸序列如seq id no:25所示。
[0149]
在本发明的一个实施方案中，cd8 t细胞癌表位和/或cd4 t细胞癌表位来源于人gcpii(即来自seq id no:24)或来源于人pap(即seq id no:25)。cd8 t细胞表位可以包含seq id no:24或seq id no:25的8-15个氨基酸的片段，或与这样的片段具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。如本文所用的词语“片段”是指在seq id no:24或seq id no:25中连续的氨基酸的序列。
[0150]
在cd8 t细胞癌表位内形成或发现的seq id no:24或seq id no:25的片段(或其在cd8 t细胞癌表位内形成或发现的变体)可以为8-15个氨基酸长，例如8-10个氨基酸，或8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸长。在一个实施方案中，该片段为9-10个氨基酸长。cd8 t细胞表位可以包含seq id no:24或seq id no:25的8-10个氨基酸的片段，或与任何这样的片段具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，该片段为9个氨基酸长，即cd8 t细胞癌表位包含seq id no:24或seq id no:25的9个氨基酸的片段，或与任何这样的片段具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。该片段可以位于seq id no:24或seq id no:25内的任何位置。
[0151]
cd4 t细胞癌表位可包含seq id no:24或seq id no:25的11-30个氨基酸的片段，或与这样的片段具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，cd4 t细胞癌表位包含seq id no:24或seq id no:25中连续的11-20个氨基酸的序列，或与seq id no:24或seq id no:25中连续的11-20个氨基酸的序列
no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11可以结合各种hla-drα/β异二聚体(并且结合可能不限于hla-dr)。
[0157]
当本发明的t细胞表位与本文定义的那些表位具有小于100％的序列同一性(即它是变体t细胞表位)时，表位必须是被也识别天然序列的tcr识别的功能性表位变体，以刺激针对天然抗原的免疫应答。这可以使用本领域已知的功能测定来确定，例如基于t细胞响应刺激产生的细胞因子如ifnγ和tnf来测量t细胞活化的测定法。对于被认为是功能性变体表位的变体表位序列，识别它的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的t细胞也应该识别天然表位序列。最优选地，识别变体表位序列的所有t细胞也识别天然表位序列。
[0158]
本发明的缀合物中的含t细胞表位的抗原可以在cd8 t细胞癌表位和cd4 t细胞癌表位之间包含蛋白酶识别位点(即被蛋白酶识别和切割的位点，也称为蛋白酶切割位点)。任何已知的蛋白酶识别位点都可以使用，只要它适合标记含t细胞表位的抗原以在两个表位之间进行切割即可。识别位点可以用于任何胞质或内质网(er)蛋白酶：即，在人细胞的胞质或er内发现的任何蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶识别位点是蛋白酶体识别位点(或切割位点)。
[0159]
可以使用适当的计算机程序和软件预测蛋白酶体切割位点，例如在线程序netchop(nielsen等(2005),immunogenetics 57(1-2):33-41)，可在http://www.cbs.dtu.dk/services/netchop访问。为了通过mhc i复合物正确呈递cd8 t细胞癌表位，表位的c末端必须由蛋白酶体(特别是免疫蛋白酶体)正确生成。
[0160]
蛋白酶体切割位点可以位于含t细胞表位的抗原的cd8 t细胞癌表位和cd4 t细胞癌表位之间。蛋白酶体切割位点可以直接位于cd8 t细胞癌表位和cd4 t细胞癌表位之间，即在该实施方案中，cd8 t细胞表位和cd4 t细胞表位之间不存在额外的氨基酸，它们通过cd8 t细胞表位的c末端氨基酸和cd4 t细胞表位的n末端氨基酸之间的肽键彼此直接连接。或者，蛋白酶体切割位点可由位于cd8 t细胞表位和cd4 t细胞表位之间的额外氨基酸提供，即在该实施方案中，cd8 t细胞癌表位的c末端氨基酸与cd4 t细胞癌表位的n末端氨基酸通过一些额外的氨基酸分开，这些氨基酸形成设计的切割位点，用于体内适当的表位加工。
[0161]
当蛋白酶体切割位点由位于cd8 和cd4 t细胞表位之间的额外氨基酸(即氨基酸间隔区)提供时，间隔区可以为任意数量氨基酸长。在本发明的一个实施方案中，间隔区不超过6个氨基酸长，例如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸长。间隔区可以是任何氨基酸序列，但是为在两个表位之间提供蛋白酶体切割位点的序列。因此，间隔区的序列将取决于侧翼表位的序列。
[0162]
当蛋白酶体切割位点由间隔区提供时，蛋白酶体切割位点可位于间隔区内，即蛋白酶体可在间隔区的两个氨基酸之间切割含t细胞表位的抗原，使得在抗原切割后间隔区的残基保留在cd8 t细胞癌表位的c末端和cd4 t细胞癌表位的n末端。在本发明的一个实施方案中，由间隔区提供的切割位点位于间隔区的n末端残基和cd8 t细胞癌表位的c末端氨基酸之间，使得在抗原切割后间隔区残基仅保留在cd4 t细胞癌表位的n末端，而cd8 t细胞癌表位上没有。
[0163]
形成本发明的缀合物的一部分的含t细胞表位的抗原包含位于cd8 t细胞癌表位n末端的易位肽。在本发明的一个方面，易位肽介导含t细胞表位的抗原或至少位于其中的
cd8 t细胞癌表位向宿主细胞的内质网中的tap驱动的转运。
[0164]
在本发明的一个方面，易位肽是被tap复合物识别并形成易位肽的n末端的氨基酸的短序列，例如3-5个氨基酸长的肽，例如3个、4个或5个氨基酸长的肽。在本发明的又一方面，易位肽是介导至少cd8 t细胞癌表位的tap驱动的转运的肽。在本发明的一个实施方案中，易位肽具有氨基酸序列arww(seq id no:12)，或与其具有至少75％或80％序列同一性的氨基酸序列。
[0165]
在一个实施方案中，易位肽和cd8 t细胞癌表位在含t细胞表位的抗原中彼此直接相邻(即易位肽的c末端氨基酸直接位于cd8 t细胞癌表位的n末端氨基酸的n末端，因此这两个氨基酸通过肽键连接)。
[0166]
在本发明的一个实施方案中，易位肽形成含t细胞表位的抗原的n末端，其c末端直接是cd8 t细胞癌表位，后者又直接在cd4 t细胞癌表位或紧跟cd4 t细胞癌表位的间隔区的n末端。表位之间蛋白酶体切割位点的存在允许分离表位，从而产生由易位肽和cd8 t细胞癌表位组成的片段，该片段的长度允许tap驱动的易位。
[0167]
能够介导tap驱动的易位的肽可以通过tap易位测定实验鉴定。jongsma&neefjes(2013),antigen processing:methods and protocols(peter van endert编辑),第5章(第53-65页)中详细描述了tap易位测定。
[0168]
在本发明的一个实施方案中，缀合物包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含：cd8 t细胞表位，该cd8 t细胞表位包含seq id no:2所示的序列或与其具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；以及cd4 t细胞表位，该cd4 t细胞表位包含seq id no:7所示的序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成(缀合物i)。
[0169]
在本发明的一个实施方案中，缀合物i的含t细胞表位的抗原包含具有seq id no:12所示的序列的易位肽，以及具有序列qqqppp(seq id no:29)的间隔区，其将两个t细胞表位分开。缀合物i的含t细胞表位的抗原可以包含seq id no:13所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0170]
在本发明的另一个实施方案中，缀合物包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含：cd8 t细胞癌表位，该cd8 t细胞癌表位包含seq id no:3所示的序列或与其具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；以及cd4 t癌细胞表位，该cd4 t细胞癌表位包含seq id no:8所示的序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成(缀合物ii)。
[0171]
在本发明的一个实施方案中，缀合物ii的含t细胞表位的抗原包含具有seq id no:12所示序列的易位肽，以及具有序列aaa的间隔区，其将两个t细胞表位分开。缀合物ii的含t细胞表位的抗原可以包含seq id no:14所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0172]
在本发明的另一个实施方案中，缀合物包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含：cd8 t细胞癌表位，该cd8 t细胞癌表位包含seq id no:4所示的序列或与其具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；以及cd4 t癌细胞表位，该cd4 t细胞癌表位包含seq id no:9所示的序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成(缀合物iii)。
50个氨基酸长，例如20-45个、20-40个、20-35个、25-40个、25-35个、30-50个、35-50个、30-40个或35-40个氨基酸长。在本发明的一个实施方案中，缀合物vi的含t细胞表位的抗原为至多50个氨基酸长。
[0181]
ny-eso-1肽可以被加工成mhc分子上呈递的t细胞表位，例如seq id no:19(gnjatic等(2000),proc.natl.acad.sci.u.s.a.97(20):10917-10922)所示的氨基酸序列，或与其具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。seq id no:19对应于ny-eso-1的第92-100位氨基酸(即seq id no:18的第92-100位氨基酸)。seq id no:19的肽被hla-cw3识别。seq id no:19的序列(或其变体)可以位于含t细胞表位的抗原的n末端、c末端或中间。
[0182]
在本发明的一个实施方案中，缀合物vi的含t细胞表位的抗原包含seq id no:101的cd4 t细胞癌表位(mandic等(2005)，j.immunol.174：1751-1759)或与其具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。seq id no:101对应于ny-eso-1的第87-101位氨基酸(即seq id no:18的第87-101位氨基酸)。seq id no:101的序列(或其变体)可以位于含t细胞表位的抗原的n末端、c末端或中间。
[0183]
在本发明的又一个实施方案中，缀合物vi的含t细胞表位的抗原包含seq id no:20的氨基酸序列，或与seq id no:20具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。seq id no:20对应于ny-eso-1的第79-105位氨基酸(即seq id no:18的第79-105位氨基酸)。当缀合物vi的含t细胞表位的抗原包含seq id no:20的变体序列(或seq id no:19或seq id no:101的变体序列或seq id no:18的变体片段)或由其组成时，它必须对等效的天然序列具有等效的免疫原性(即它必须在功能上等效)。上面讨论了可以分析抗原序列的功能等效性的方法。
[0184]
缀合物vi的含t细胞表位的抗原可以包含一个或多个cd8 t细胞癌表位，和/或一个或多个cd4 t细胞癌表位。它可以包含如上定义的易位肽，和/或一个或多个蛋白酶体切割位点。但是，不要求存在这些特征中的任何一个。
[0185]
本发明的另一方面是c型缀合物。c型缀合物包含与含t细胞表位的抗原缀合的至少一个含b细胞表位的肽，其中：
[0186]
(i)所述至少一个含b细胞表位的肽包含最小破伤风类毒素表位(mtte)，所述mtte包含：
[0187]
(a)至少10个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸在seq id no:22中连续并且包含seq id no:23所示的氨基酸序列gitelkkl；或者
[0188]
(b)与(a)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
[0189]
其中所述含b细胞表位的肽不是完整的破伤风毒素β链；
[0190]
(ii)所述含t细胞表位的抗原包含cd8 t细胞癌表位和cd4 t细胞癌表位，其中所述cd8 t细胞癌表位选自seq id no:2-seq id no:6中任一个，或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列；并且所述cd4 t细胞癌表位选自seq id no:7-seq id no:11中任一个，或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；并且
[0191]
(iii)所述含t细胞表位的抗原的n末端与所述含b细胞表位的肽缀合。
[0192]
因此，c型缀合物类似于a型缀合物，包含可用于a型缀合物中的t细胞表位(如上所述)，但不同之处在于含t细胞表位的抗原缺少易位肽。优选地，在c型缀合物的含t细胞表位
的抗原中，t细胞表位排列成使得cd8 t细胞表位在cd4 t细胞表位的n末端。如上文详述，含t细胞表位的抗原可包含位于t细胞表位之间的蛋白酶切割位点，其可由间隔区提供。t细胞表位序列的变化(由序列同一性定义)也可以如上文关于a型缀合物所述。
[0193]
优选地，cd8 和cd4 t细胞表位在c型缀合物的含t细胞表位的抗原中配对，如关于a型缀合物所述。因此，在一个实施方案中，c型缀合物包含seq id no:2或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列的cd8 t细胞表位，以及seq id no:7或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的cd4 t细胞表位。包含这些表位的示例性肽如seq id no:106所示。因此，在该实施方案中，c型缀合物可包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含seq id no:106所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0194]
在另一个实施方案中，c型缀合物包含seq id no:3或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列的cd8 t细胞表位，以及seq id no:8或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的cd4 t细胞表位。包含这些表位的示例性肽如seq id no:107所示。因此，在该实施方案中，c型缀合物可包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含seq id no:107所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0195]
在另一个实施方案中，c型缀合物包含seq id no:4或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列的cd8 t细胞表位，以及seq id no:9或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的cd4 t细胞表位。包含这些表位的示例性肽如seq id no:108所示。因此，在该实施方案中，c型缀合物可包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含seq id no:108所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0196]
在另一个实施方案中，c型缀合物包含seq id no:5或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列的cd8 t细胞表位，以及seq id no:10或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的cd4 t细胞表位。包含这些表位的示例性肽如seq id no:109所示。因此，在该实施方案中，c型缀合物可包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含seq id no:109所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0197]
在另一个实施方案中，c型缀合物包含seq id no:6或与其具有至少65％序列同一性的氨基酸序列的cd8 t细胞表位，以及seq id no:11或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的cd4 t细胞表位。包含这些表位的示例性肽如seq id no:110所示。因此，在该实施方案中，c型缀合物可包含含t细胞表位的抗原，该抗原包含seq id no:110所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0198]
c型缀合物的所有其他方面(例如，含b细胞表位的肽、缀合物等)可以如上文对于a型缀合物所述。
[0199]
本发明的缀合物的含t细胞表位的抗原可以通过本领域已知的任何方法合成，如上文关于含b细胞表位的肽所详述的。含t细胞表位的抗原可以在非生物系统中化学合成。液相合成或固相合成(例如boc或fmoc合成)可用于产生期望的含t细胞表位的抗原。
[0200]
如上所述，本发明的缀合物中的含b细胞表位的肽和含t细胞表位的抗原由序列同一性定义。可以通过任何常规方法评估序列同一性。序列之间的序列同一性程度可以通过对序列进行成对或多重比对的计算机程序来确定。例如emboss needle或emboss stretcher(两者均为rice,p.等(2000),trends genet.16,(6)第276—277页)可用于成对
序列比对，而clustal omega(sievers f等(2011),mol.syst.biol.7:539)或muscle(edgar,r.c.(2004),nucleic acids res.32(5):1792-1797)可用于多序列比对，然而可使用任何其他合适的程序。无论比对是成对的或多重的，它都必须在全局范围内(即跨越整个参考序列)而不是局部进行。
[0201]
序列比对和％同一性计算可以使用例如标准clustal omega参数确定：矩阵gonnet，空位开放罚分6，空位延伸罚分1。或者，可以使用标准emboss needle参数：矩阵blosum62，空位开放罚分10，空位延伸罚款0.5。可替代地使用任何其他合适的参数。
[0202]
为本技术的目的，当通过不同方法获得的序列同一性值存在争议时，使用默认参数的emboss needle进行全局成对比对获得的值应视为有效。
[0203]
在包括与所提供的参考序列具有小于100％序列同一性的氨基酸序列(即变体序列)的本发明实施方案中，可以通过一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代来实现修饰参考序列以产生变体序列。
[0204]
当通过替换特定氨基酸残基来修饰序列时，该取代可以是保守氨基酸取代。如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸往往具有相似的性质，因此对多肽的结构或功能重要的氨基酸的保守取代可预期对多肽结构/功能的影响小于相同的位置的非保守氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守氨基酸取代可被认为是其中特定氨基酸残基被同一家族中的不同氨基酸取代的取代。氨基酸残基的取代可以替代地为非保守取代，其中一个氨基酸被具有属于不同家族的侧链的另一个取代。
[0205]
本发明范围内的氨基酸取代或添加可以使用由遗传密码编码的蛋白质氨基酸、不由遗传密码编码的蛋白质氨基酸或非蛋白质氨基酸来进行。可以使用蛋白质氨基酸进行任何氨基酸取代或添加。构成本文公开的肽序列的氨基酸可包括非天然存在的氨基酸，但其是天然存在的氨基酸的修饰。假设这些非天然存在的氨基酸不改变序列并且不影响功能，它们可用于产生本文所述的肽而不降低序列同一性，即被认为提供肽的氨基酸。例如，可以使用氨基酸衍生物如甲基化氨基酸。
[0206]
本发明的另一方面是疫苗组合物，其包含至少一种本发明的缀合物，所述缀合物选自缀合物i、缀合物ii、缀合物iii、缀合物iv和缀合物v中的任一种，任选地与缀合物vi组合，以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。因此，疫苗组合物可以包含缀合物i、缀合物ii、缀合物iii、缀合物iv或缀合物v中的任一种。或者，疫苗组合物可以包含缀合物i-vi中的两种或更多种，即任意组合的缀合物i-vi中的2种、3种、4种、5种或6种。
[0207]
本发明的一个实施方案是包含缀合物i、缀合物ii、缀合物iii、缀合物iv和缀合物v的疫苗组合物。
[0208]
本发明的另一个实施方案是包含缀合物i、缀合物ii、缀合物iii、缀合物iv、缀合物v和缀合物vi的疫苗组合物。
[0209]
本发明的另一个实施方案是包含缀合物i、缀合物ii、缀合物iv和缀合物v的疫苗
组合物。
[0210]
本发明的又一个实施方案是包含缀合物i、缀合物iii和缀合物v的疫苗组合物。
[0211]
本发明的另一个实施方案是包含缀合物i、缀合物iii、缀合物iv和缀合物v的疫苗组合物。
[0212]
本发明的又一个实施方案是一种疫苗组合物，其包含基于患者和肿瘤的遗传谱选择的一种单一缀合物。
[0213]
疫苗组合物中可以存在根据本发明的每种缀合物的单一类型(即每种缀合物i相同，每种缀合物ii相同，每种缀合物iii相同，每种缀合物iv相同，每种缀合物v相同且每种缀合物vi相同)。或者，疫苗组合物中可以存在本发明缀合物中至少一种的多种类型(即，可以存在缀合物i-vi中至少一种的至少2种不同缀合物)。在一些实施方案中，存在本发明的每种缀合物的多种类型(即存在缀合物i-vi中每一种的至少2种不同缀合物)。
[0214]
seq id no:2的cd8 t细胞癌表位被hla-a24识别，seq id no:3-seq id no:4的那些被hla-a2识别，seq id no:5的那些被hla-a1识别，并且seq id no:6的那些被hla-a3、hla-a11、hla-a31和hla-a33识别。
[0215]
在中欧，这些hla等位基因在人群中的频率如下：
[0216]
hla-a等位基因频率hla-a128％hla-a250％hla-a329％hla-a1110％hla-a2418％hla-a315％hla-a332％以上7种中的至少一种96％
[0217]“频率”是指携带每种等位基因的人群中个体的比例。在分析的人群中，绝大多数人携带至少一个hla-a等位基因，该等位基因由缀合物i-v携带的cd8 t细胞表位结合。通过识别多个cd8 t细胞表位，这些表位组合起来识别最常见的hla-a等位基因，可以为给定的个体生成或选择有效的疫苗。
[0218]
本发明的疫苗组合物可以根据制药领域已知的技术和程序以任何常规方式配制。如本文所用，“药学上可接受的”是指与本发明的疫苗组合物的其他成分相容以及接受者生理学上可接受的成分。组合物和载体或赋形剂材料等的性质可以根据选择和期望的施用途径、治疗目的等以常规方式选择。
[0219]
液体疫苗组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式，可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格溶液、等渗氯化钠、不挥发油(例如可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如edta；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡聚糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
[0220]
疫苗组合物还可包含一种或多种佐剂。可以包含在疫苗组合物中的常见佐剂包括铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝、qs-21和角鲨烯。
[0221]
其他常用的疫苗成分在本领域中是已知的并且包括例如α-生育酚和人血清白蛋白。一种或多种缓冲剂也可用于调节组合物的ph，例如磷酸钠或磷酸钾、己二酸二钠、琥珀酸、氢氧化钠/盐酸、组氨酸、硼酸钠或氨丁三醇。
[0222]
本发明进一步提供了本发明的缀合物或疫苗组合物，其用于治疗。如本文所用，“治疗”是指治疗受试者的任何医学病症。这样的治疗可以是预防性的(即预防)或治疗性的，包括治愈性的(或旨在治愈)或姑息性的(即仅设计用于限制、缓解或改善病症的症状的治疗)。治疗性治疗包括医学病症的任何医学治疗，即给予或打算给予患有该病症的受试者任何临床益处的治疗。如本文所定义的受试者是指任何哺乳动物，例如农场动物，例如牛、马、绵羊、猪或山羊，宠物动物例如兔、猫或狗，或灵长类动物例如猴、黑猩猩、大猩猩或人。最优选地，受试者是人。特别地，受试者可以是男性人类(男人)。
[0223]
本发明的一个方面是如本文所述和要求保护的缀合物或疫苗组合物，其用于预防或治疗癌症。本发明的又一方面是预防或治疗需要这样的预防或治疗的受试者中的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的缀合物或包含如本文所述和要求保护的缀合物的疫苗组合物。本发明的又一方面是如本文所述和要求保护的缀合物或疫苗组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
[0224]
癌症在本文中被广义地定义为包括任何肿瘤病症，无论是恶性的、恶变前的还是非恶性的。包括实体瘤和非实体瘤。术语“癌细胞”与“肿瘤细胞”同义。
[0225]
如本文所用，癌症可以是其中产生或上调由本发明的一种或多种缀合物携带的任何表位的任何癌症(或更具体地，其中包含由本发明的一种或多种缀合物携带的表位或由本发明的一种或多种缀合物携带的表位来源的表位的任何蛋白质被上调)。可以通过本发明的方法治疗的癌症包括黑素瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、膀胱癌或尿路上皮癌、食道癌、口腔癌和肺癌。前列腺癌是指原发性前列腺癌(即定位于前列腺的前列腺癌)和转移性前列腺癌。在本发明的一个方面，如本文所述和要求保护的缀合物或疫苗组合物可用于治疗位于受试者体内其他地方(即不在前列腺中)的前列腺癌转移。
[0226]
本发明的缀合物或疫苗也可用于治疗局部前列腺癌，即尚未扩散或转移到身体其他区域的前列腺癌。在本发明的一个实施方案中，如本文所述和要求保护的缀合物或疫苗组合物可用于治疗处于转移风险(例如中/高风险)的受试者或处于前列腺癌复发风险的受试者中的局部前列腺癌，例如延迟或防止复发。本发明的另一个实施方案是如本文所公开和要求保护的缀合物或疫苗组合物在癌症免疫疗法中的用途。
[0227]
重要的是，将施用本发明的缀合物或疫苗组合物的受试者优选具有预先存在的针对ttx，更具体地针对seq id no:1的抗体。预期受试者是否具有针对ttx或seq id no:1的抗体可以通过例如如上所述的tettox elisa确定。如果预期受试者不具有抗ttx抗体，则受试者可以接受包含ttd的破伤风疫苗，以驱动受试者中抗ttx抗体的产生。因此，本发明中提供的治疗方法包括在施用本发明的缀合物或疫苗组合物之前施用疫苗以诱导针对ttx的免疫应答。诱导对ttx的免疫应答的疫苗可在施用本发明的缀合物或疫苗组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周之前施用，并且可以包含ttd。
[0228]
或者，如果预期受试者不具有抗ttx抗体，则缀合物或疫苗组合物可以与外源性抗
ttx抗体组合施用，以向受试者提供对ttx的被动体液免疫应答。例如，本发明的缀合物或疫苗组合物可以与包含抗ttx抗体(例如tetaquin或任何等效的抗ttx抗体制剂)的溶液或血清组合(即，同时，或不久之前或之后)施用于受试者。
[0229]
如本文所述和要求保护的缀合物或疫苗组合物可以通过肠胃外途径施用于受试者，例如施用可以是皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、病灶内或皮内施用。作为团注的施用可能是有用的。
[0230]
术语“治疗有效量”是指足以显示对受试者病症的益处的治疗活性剂的量，例如减缓或抑制癌症的生长，或甚至导致癌症的尺寸减小。
[0231]
本发明的治疗方法可以进一步包括施用第二或另外的治疗活性剂，例如抗癌剂。第二或另外的治疗活性剂可以例如是化学治疗剂或另外的免疫治疗剂，例如靶向癌症抗原的抗体或重定向t细胞。或者，第二或另外的治疗活性剂可以是例如抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂或如上所述的免疫调节剂。替代地或另外，本发明的治疗方法可以与其他疗法如手术、激素疗法和/或放射疗法组合。
[0232]
本发明的另一方面是一种试剂盒，其包含如本文所公开和要求保护的缀合物或疫苗组合物，以及第二治疗活性剂，例如如上定义的药剂。当试剂盒包含本发明的缀合物或疫苗组合物和第二治疗活性剂二者时，缀合物/组合物和第二药剂可以分开、顺序或同时施用于受试者。这样的试剂盒可替代地定义为组合或组合产品。该试剂盒可用于治疗，特别是用于癌症治疗。
[0233]
因此，在另一方面，本发明还提供了如本文所定义的缀合物或疫苗组合物和第二治疗活性剂(更特别是第二抗癌剂)作为组合制剂用于在治疗中分开、顺序或同时使用，例如在癌症的治疗或预防中。
[0234]
本发明还提供了一种多肽，所述多肽包含seq id no:13-seq id no:17任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，其中所述多肽从n末端到c末端包含：
[0235]
(a)易位肽；
[0236]
(b)cd8 t细胞癌表位；和
[0237]
(c)cd4 t细胞癌表位；
[0238]
其中蛋白酶体切割位点任选存在于所述cd8 t细胞癌表位和所述cd4 t细胞癌表位之间，任选其中所述切割位点由间隔区提供；
[0239]
其中所述易位肽能够介导所述多肽或所述cd8 t细胞癌表位向宿主细胞的内质网中的tap驱动的转运。
[0240]
可以看出，本发明的这组多肽精确对应于缀合物i-v的含t细胞表位的抗原(当所述含t细胞表位的抗原分别包含seq id no:13-seq id no:17中任一所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成时)，因此关于那些缀合物的含t细胞表位的抗原的所有讨论同样适用于本发明的这些多肽。
[0241]
在另一个方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽包含seq id no:106-seq id no:110中任一所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，其中所述多肽从n末端到c末端包含：
[0242]
(a)cd8 t细胞癌表位；和
[0243]
(b)cd4 t细胞癌表位；
[0244]
其中任选的蛋白酶体切割位点可以存在于所述cd8 t细胞癌表位和所述cd4 t细胞癌表位之间。
[0245]
可以看出，本发明的这组多肽精确对应于上述本发明的c型缀合物的含t细胞表位的抗原)，因此关于那些缀合物的含t细胞表位的抗原的所有讨论同样适用于本发明的这些多肽。
[0246]
如本文所定义，多肽(例如本发明的多肽)包含通过肽键连接的氨基酸。如本文所定义的多肽还可以包含一个或多个非肽部分。也就是说，本文定义的“多肽”可以由通过肽键连接的氨基酸组成，但替代地可以另外包含非氨基酸和/或非肽部分。任何化学部分可以包括在本文定义的多肽中，包括例如载体或官能团。因此，本发明的多肽还可以包括多肽化合物。在一个具体实施方案中，多肽化合物包含与羧酸叠氮化物例如己酰叠氮化物部分连接的本发明多肽(即，本发明的多肽化合物可以具有如上式iv中所示的结构)。其他有用的羧酸叠氮化物包括叠氮丙酸等。
[0247]
本发明进一步提供了一种核酸分子，其包含编码本发明多肽的核苷酸序列或由其组成。遗传密码是众所周知的，因此技术人员将能够基于所提供的编码多肽序列容易地产生本发明的核酸分子。本发明的核酸分子可以是分离的核酸分子并且可以包括dna(包括cdna)或rna或dna或rna的化学衍生物，包括具有放射性同位素或化学加合物例如荧光团、生色团或生物素(“标签”)的分子。因此，核酸可以包含修饰的核苷酸。所述修饰包括碱基修饰例如溴尿苷、核糖修饰例如阿拉伯糖苷和2’,3
’‑
二脱氧核糖以及核苷酸间键修饰例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯氨基硫代磷酸酯(phosphoranilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)和磷酰胺酯(phosphoroamidate)。术语“核酸分子”特别包括单链和双链形式的dna和rna。
[0248]
这样的分子可以通过重组方式或通过化学合成产生，例如使用亚磷酰胺法的固相合成。
[0249]
本发明进一步提供了包含本发明的核酸分子的构建体，例如重组构建体。核酸分子可以在所述构建体中可操作地连接到表达控制序列。这样的表达控制序列通常会是启动子。因此，构建体可以包含启动子。任选地，构建体可以另外包含另外的一种或多种多肽编码序列和/或一种或多种调节序列。任选的一种或多种多肽编码序列可以在相同启动子的控制下或在不同启动子的控制下。因此，本发明涵盖编码多于一种本发明多肽的构建体。在这方面，构建体可以包含两个或更多个本发明的核酸序列。
[0250]
术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸分子在单个核酸片段上的缔合，从而一个核酸分子的功能受到另一个核酸分子的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接到调节序列。
[0251]
术语“调节序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、操纵子、增强子和翻译前导序列。如本文所用，术语“启动子”是指能够控制编码序列或rna表达的核苷酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可以
整体来源于天然基因，或者由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的核苷酸片段。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，不同长度的核酸片段可能具有相同的启动子活性。
[0252]
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子或构建体的载体。可以构建包含一种或多种本发明的核酸分子(或构建体)的载体。载体的选择可以取决于本发明的核酸分子将在其中表达的宿主生物体或细胞、将用于转化宿主细胞的方法和/或用于蛋白质表达(或载体的任何其他预期用途)的方法。本领域技术人员非常了解为了成功转化、选择和繁殖包含本发明的核酸或构建体的细胞而必须存在于载体中的遗传元件。技术人员还将认识到不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式，因此可能需要筛选多个事件以获得表现出期望表达水平的细胞。这样的筛选可以通过dna的southern分析、mrna的northern分析、蛋白质的western分析等来完成。
[0253]
本发明的范围还包括用于产生本发明的缀合物的方法，特别是用于产生这样的缀合物的方法，其包含一种或多种，或更特别地两种或更多种含b细胞表位的肽，并且其中含b细胞表位的肽和含t细胞表位的抗原通过各自偶联或连接至作为接头部分的核心化合物而缀合。
[0254]
因此，在另一个方面，本发明提供了一种产生如上所述的本发明的缀合物的方法。
[0255]
本发明的一个实施方案是一种制备本发明的缀合物的方法，包括以下步骤：
[0256]
(i)提供核心化合物，它是包含二苯基环辛炔peg间隔区的三氨基-2,2-二甲基丙酸接头化合物，其中三个氨基被丙酰马来酰亚胺基团官能化；
[0257]
(ii)提供三个如本文所定义的含b细胞表位的肽，其中所述肽分子在c末端包含硫醇基团，优选地其中所述硫醇基团是所述含b细胞表位的肽的c末端半胱氨酸残基的侧链；
[0258]
(iii)通过在核心化合物的每个马来酰亚胺环和肽分子的硫醇基团之间形成琥珀酰亚胺基硫醚，将三个含b细胞表位的肽连接到步骤(i)的核心化合物上以产生加合物；
[0259]
(iv)提供含t细胞表位的抗原，其中所述抗原包含n末端叠氮基羧酸基团；
[0260]
(v)将(iv)的叠氮基羧基抗原连接到由步骤(iii)产生的加合物上；以及
[0261]
(vi)将加合物的琥珀酰亚胺环开环，其中所述开环可以在步骤(iii)之前或之后发生。
[0262]
在又一个实施方案中，本发明提供了产生本发明的缀合物的方法，包括：
[0263]
(i)合成包含具有二苯基环辛炔peg间隔区的三氨基-2,2-二甲基丙酸的中间体化合物，任选地其中三氨基-2,2-二甲基丙酸的三个氨基中的每一个都被保护基团单取代，优选其中所述保护基团是boc基团；
[0264]
(ii)当中间体化合物的所述氨基被保护基团单取代时，将氨基脱保护；
[0265]
(iii)使步骤(i)或(ii)的中间体化合物与马来酰亚胺丙酸-o-琥珀酰亚胺酯反应以向每个未保护的氨基连接马来酰亚胺环，从而形成核心化合物；
[0266]
(iv)通过在核心化合物的每个马来酰亚胺环和含b细胞表位的肽的硫醇基团之间形成琥珀酰亚胺基硫醚，将三个如本文所定义的含b细胞表位的肽缀合至步骤(iii)的核心化合物，优选其中所述硫醇基团是含b细胞表位的肽的半胱氨酸残基的侧链；
[0267]
(v)将如本文所定义的含t细胞表位的抗原与叠氮基羧酸偶联；
[0268]
(vi)将步骤(v)的叠氮基羧基抗原与步骤(iv)的化合物缀合；以及
[0269]
(vii)将中心核的琥珀酰亚胺环开环，其中所述开环可以在步骤(vi)之前或之后发生。
[0270]
步骤(i)中产生的中间体化合物可以如以下实施例中所示合成。步骤(i)中产生的中间体化合物可以具有上式i所示的结构；或者，如果氨基用boc(叔丁氧羰基)保护，它具有如下式viii所示的结构：
[0271][0272]
用于缀合的含b细胞表位的肽可以是本文定义的任何这样的肽。特别地，它可以包含seq id no:1和seq id no:30-seq id no:86的任一项中所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。含b细胞表位的肽可包含seq id no:21所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。用于将肽缀合至中心核心的含b细胞表位的肽的硫醇基团可以是形成含b细胞表位的肽的c末端的半胱氨酸残基的硫醇侧链。
[0273]
用于合成的含t细胞表位的抗原可以是如本文所定义的任何含t细胞表位的抗原，特别地它可以包含seq id no:13-seq id no:17或seq id no:19-seq id no:20任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。含t细胞表位的抗原可在步骤(v)中缀合至任何叠氮基羧酸，例如叠氮基己酸、叠氮基戊酸、叠氮基丁酸或叠氮基丙酸。叠氮基羧基抗原在碳-碳三键位点与核心化合物缀合。核心化合物的琥珀酰亚胺环的开环发生在含b细胞表位的肽与马来酰亚胺环缀合(因此产生琥珀酰亚胺环)之后，但可以发生在包含含t细胞表位的抗原的含叠氮化物的部分与核心化合物缀合之前或之后。
[0274]
从以下非限制性实施例并参考附图，可以更充分地理解本发明，其中：
附图说明
[0275]
图1显示了用于合成本发明的缀合物的示例性反应方案，其按照实施例2中描述的方案。如反应方案中所示，化合物12可以直接缀合至slp，产生本发明的闭环缀合物(缀合物14)或可以首先进行开环然后缀合至slp，以产生以缀合物16为例的开环缀合物。因此，从化合物12所示的两种反应途径是替代途径，其中一种产生开环缀合物而另一种产生闭环化合物。
[0276]
图2显示了供体血液中t细胞产生的细胞因子(tnfα和ifnγ)，如通过流式细胞术分析的。在dtp疫苗接种前和后(a)或具有和不具有小鼠抗mtte igg2a抗体(b)的情况下，将肽和缀合物在来自前列腺癌患者和健康供体的人全血中孵育。显示了每个供体的变化，疫
苗接种前(或没有抗mtte抗体，左)的结果与疫苗接种后(或有抗mtte抗体，右)的结果相关联。将细胞门控为cd45ro cd3 cd4 cd8-或cd45ro cd3 cd4-cd8 ，并显示了ifnγ 和tnfα 细胞的百分比。血液未经处理(0时间点)或用盐水溶液(nacl)、本发明的缀合物i-vi(lur1-6)或缀合物i-vi的含t细胞表位的抗原(slp1-6)处理。包含来自cmv和cmv裂解物的hla-a*0201限制性表位pp65(nlv)的[mtte]
3-nlv缀合物用作阳性对照，mtte3无关(mtte3-irrel)缀合物用作另外的对照。该缀合物包含乱序的slp序列(dglqglllglrqrietlegk，seq id no:88)，没有任何已知的人t细胞表位。来自a和b的三个响应供体的点图显示在c和d中。
[0277]
图3显示了接受dtp加强前和后癌症患者血浆中抗mtte抗体的滴度。图3a显示了总igg抗体的滴度，图3b显示了igm抗体的滴度，图3c显示了igg1抗体的滴度，图3d显示了igg4抗体的滴度。**等于p值《0.01且ns＝不显著，通过配对t检验评估。
[0278]
图4显示了使用根据实施例2和3合成的构建体中提供的抗原的体外抗原呈递实验的结果。图4a显示了使用多种浓度的具有完整琥珀酰亚胺环的缀合物的t细胞活化水平；图4b显示了使用多种浓度的其中琥珀酰亚胺环已经打开的等效缀合物的t细胞活化水平。
[0279]
图5显示了在来自图2中响应的患者的供体血液中，记忆(cd45ro )或非记忆(cd45ro-)cd8 t细胞产生的细胞因子(ifnγ)。血液未经处理(0时间点)或经盐水溶液(nacl)处理。使来自供体的血液经受本发明的缀合物i-vi(lur1-6)的混合物或单独评估每种单独的缀合物。结果显示为与载剂暴露的血液相比，ifnγ产生的倍数增加。
[0280]
图6是分别显示缀合物i-vi的含t细胞表位的抗原slp1-6的一般结构的示意图。每个slp包含相同的tap序列，但cd8和cd4表位以及蛋白酶体切割位点在slp之间不同。标出了slp的n末端和c末端。
[0281]
图7显示了gmp lug1-6构建体与人抗mtte抗体的结合。a显示缀合物与单克隆人igg1抗mtte抗体的结合。将缀合物以一系列浓度(0.000457-1nmol/ml)包被到elisa板上。使用人重组抗mtte igg1抗体作为第一抗体并使用抗人κ轻链第二抗体进行检测。b显示缀合物与来自供体的多克隆人抗mtte抗体的结合。将缀合物以一系列浓度(0.004-1nmol/ml)包被到elisa板上，并与稀释的供体血浆一起孵育。使用抗人κ轻链第二抗体进行检测。
[0282]
图8显示了用lug2缀合物接种动物对抗mtte滴度的影响(a)，以及(b)用lug2接种hla-dr4小鼠后t细胞响应的elispot分析。使用初免/加强方案向hla-dr4转基因小鼠皮下接种lug2(20μg)。一周后处死小鼠，进行心脏放血，通过抗mtte elise分析血清并使用ifnγelispot分析脾细胞。通过将脾细胞与slp uv02(seq id no:14)和uv08(seq id no:107)一起孵育48小时来进行elispot。seb用作阳性对照，并且未处理的脾细胞用作阴性对照。
[0283]
图9显示了人血环(blood loop)测定和雄兔中tendu毒性的分析(tendu疫苗包含lug1-6缀合物，如下所述，其对应于根据gmp标准制造的本文所述的缀合物i-vi)。将来自五名接种了boostrix疫苗的前列腺癌患者和五名健康个体的新鲜血液转移到环中。以各自的浓度添加lug 1-6构建体或添加nacl作为载剂。将阿仑单抗(3μg/ml)添加到各个环中作为阳性对照。在0分钟和15分钟收集血浆样品，用于通过elisa测量c3a和c5a(a-b)。为了分析il-8(c)、ifnγ(f)、il-6(g)、il-1β(h)和tnfa(i)，在0分钟和4小时收集血浆样品。使用msd阵列和msd软件分析血浆样品。llod和ulod如方法中所述定义。雄兔皮下接种四次equip-t，然后皮下接种四次低、中或高剂量的tendu(见表vi)。每两周接种一次，并在第一次和最后一次施用tendu前的第8周和第15周以及施用tendu后的4小时和24小时收集血浆样品。使用
兔elisa试剂盒分析血浆。计算了ifnγ(d)和il-8(e)的浓度。
具体实施方式
[0284]
实施例
[0285]
实施例1-含b细胞表位的肽设计
[0286]
合成了包含seq id no:1所示氨基酸序列的含b细胞表位的肽的多种设计，并对其进行分析以确定允许抗体与mtte序列结合的设计。如先前在已公开的专利申请wo 2011/115483中所见，n末端修饰阻碍了抗体与mtte的结合。
[0287]
使合成的肽与生物素缀合(在其c末端或n末端)。某些肽包括在生物素和seq id no:1的mtte之间形成间隔区的额外氨基酸序列。设计的肽列于下表1中。还合成了对照肽，其包含带有与生物素缀合的c末端间隔区序列(seq id no:103)的乱序mtte序列。
[0288]
表1：
[0289][0290]
通过elisa分析抗体与每种肽的结合。生物素化的肽在链霉亲和素包被的nunc-lmmuno maxisorp板上孵育。使用多克隆兔抗mtte抗体批次滴定板上包被的每种单独肽的滴度。使用波尔兹曼公式计算s形曲线。从曲线的玻尔兹曼数据中提取滴度值，这里是最大吸光度的50％的稀释度。将与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔igg用作第二抗体，并使用4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物进行测定。然后在405nm处读取吸光度以确定滴度。结果列于下表2中：
[0291]
表2：
[0292]
生物素位置肽序列滴度(ec50)c末端seq id no:104500c末端seq id no:1400c末端seq id no:105800c末端seq id no:1030n末端seq id no:105200
[0293]
没有间隔区的生物素化肽显示出400的滴度，而包含seq id no:1的c末端间隔区的两种肽显示出相似或增强的滴度，表明c末端间隔区不会不利地影响抗体结合。发现生物素与肽的c末端的缀合对于最佳抗体结合很重要。如上所示，生物素与mtte的n末端的缀合导致抗体与mtte的结合减少了一半。带有c末端间隔区的乱序mtte序列不显示任何滴度，表明无论是否包含间隔区，均没有抗体结合肽。
no:15)，不同之处在于使用叠氮基丙酸代替叠氮基己酸。
[0311]
合成了化合物12，并且如上所述打开其环。向该混合物中添加在dmso中的叠氮丙酰基slp，并产生包含mtte和含t细胞表位的slp的开环缀合物。如上所述通过质谱分析所得化合物。构建体计算的质量为14698.4da，测得的去卷积平均质量为14699.0da。
[0312]
实施例4-t细胞表位组合和ttes的选择
[0313]
从文献中选择了11种已知的前列腺癌cd8 t细胞表位(c1-11)和6种已知的前列腺癌cd4 t细胞表位(h1-h6)：
[0314][0315][0316]
代码辅助表位序列seq id no:hla等位基因结合h1gqdlfgiwskvydpl7混杂h2tedtmtklrelsels96混杂h3gkvfrgnkvknaqla9混杂h4tgnfstqkvkmhihs10dr4h5nytlrvdctplmysl11dr1/dr9h6rqiyvaaftvqaaae8dr4/dr9
[0317]
已确定前列腺癌疫苗的缀合物将包含含有c1-11和h1-6各一个的单个长肽(slp)，并且疫苗将包含5种这样的缀合物，每种具有不同的cd8 和cd4 表位。表位组合的选择基于以下要求：候选长肽应包含正确tap易位的ctl表位，并且其c末端是在也包含辅助t细胞表位的较长肽的背景下产生的。
[0318]
合成了包含列出的ctl表位和辅助表位的所有66种可能组合的slp。根据供应商的方案，用市售的免疫蛋白酶体处理这些肽。将每种肽(1μl的dmso储备溶液)添加到包含0.5μg免疫蛋白酶体20s(人，纯化的，bml-pw9645-0050，enzo life science)、30mm tris-hcl(ph 7.2)、10mm kcl、5mm mgcl2和1mm dtt的300μl水性缓冲液中。将混合物涡旋并在37℃
下孵育不同的时间段。在每个时间点，从消化混合物中取出等分试样(50μl)，添加到4μl甲酸中，并将所得溶液涡旋均化并储存在-20℃下直至分析。为进行分析，将1μl该溶液与1μl基质溶液(10mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸(ach)在包含0.2％tfa的乙腈/水1/1中)混合并在maldi-tof靶板上点样。用maldi-tof质谱法(bruker microflex)分析所有时间点的样品，揭示蛋白酶体诱导的肽片段(》800da)。
[0319]
在消化24小时后，使用具有bruker microflex或bruker ultraflex仪器的maldi-tof质谱法监测蛋白酶体降解。将未正确切割的表位组合(即未在两个表位之间切割)重新合成为在cd8 和cd4 t细胞表位之间具有间隔区序列，并重新测试它们的切割。使用在线程序netchop 3.1(预测方法：c-term 3.0；阈值：0.5)预测适当的间隔区序列。确定了以下表位组合的最佳切割：c9-h1(具有seq id no:29的间隔区)；c5-h6(具有序列a-a-a的间隔区)；c11-h3(具有序列a-a-a的间隔区)；c4-h4(无间隔区)；和c8-h5(无间隔区)。在这些肽的切割之后，包含ctl表位的n末端片段和包含辅助表位的c末端片段是可识别的。
[0320]
为了增强所选ctl表位向内质网(er)的易位，将算法tapreg(http://imed.med.ucm.es/tools/tapreq；diez-rivero等(2010),proteins 78:63-72)用于鉴定ttes(tap易位增强序列)。基于tapreg分析，选择了氨基酸序列arww(seq id no:12)。合成了具有n末端鉴定的ttes的如上所述开发的slp，在体外孵育并通过tap易位测定进行测试。tap易位测定如neefjes等，science 261:769-771(1993)中所述进行。设计的slp的一般结构如图6所示。
[0321]
实施例5-利用本发明的特定缀合物的概念验证研究
[0322]
方法
[0323]
血环测定
[0324]
在开放系统中采集来自供体的血液并立即与抗凝血剂肝素(leo pharma ab,瑞典)混合至终浓度为1iu/ml。与血液直接接触的所有材料均使用来自corline(瑞典)的肝素包被试剂盒进行表面肝素化处理。将血液和缀合物涂在来自corline的肝素化pvc管上，然后将其使用专门的金属连接器密封，形成环。将血环在37℃培养箱内的轮子上旋转。在终点，立即将采样血液与edta混合至终浓度为10mm，以停止任何正在进行的反应并防止血液凝结。使用ac
·
t diff
tm
分析仪(beckman coulter,迈阿密,佛罗里达州)或xp-300(sysmex,日本)在0和结束时间点对血小板进行计数，以确保在实验程序期间和作为对添加试剂的响应没有发生凝血。收集血浆并储存在-80℃。
[0325]
细胞内染色和流式细胞术分析
[0326]
在缀合物在血环系统中循环2小时后，通过添加布雷菲德菌素a(sigma-aldrich)进行ifnγ和tnfα的细胞内染色。如对于上述血环系统所述，实验在另外4小时后终止。
[0327]
用于流式细胞术分析的抗体购自biolegend：抗cd3(克隆ucht1)、抗cd4(克隆okt-4)、抗cd8(克隆sk1)、抗cd45ro(克隆uchl1)、抗ifnγ(克隆4s.b3)和抗tnfα(克隆mab11)。根据制造商的说明，用细胞表面特异性抗体对全血进行染色，然后使用facs裂解溶液(bd biosciences)裂解红细胞。将剩余的细胞洗涤并用bd cytofix/cytoperm缓冲液在黑暗中在4℃固定20分钟。为了使细胞透化，首先洗涤它们，然后在室温下用perm/wash缓冲液(bd biosciences)孵育10分钟。在黑暗中在4℃下对细胞的ifnγ和tnfα染色30分钟，然后在包含1％bsa和3mm edta(sigma-aldrich)的pbs中洗涤。
[0328]
染色后，使用canto ii流式细胞仪(bd biosciences)或cytoflex(beckman coulter)分析细胞。使用flowjo(tree star)对细胞群进行门控和分析。
[0329]
伦理考虑
[0330]
健康志愿者的血液采样和dtp疫苗接种得到当地伦理委员会的批准。简而言之，使用连接到肝素化管的18g规格针来抽血。将血液收集在50ml表面肝素化管中，随后转移到环管中，然后如上所述设置为旋转。dtp疫苗接种由医院的常规人员使用标准疫苗混合物进行。
[0331]
结果
[0332]
从供体(前列腺癌患者和健康志愿者)采集血液并进行环测定。
[0333]
血液设定为在塑料管中旋转。使用来自每个供体的三个血液样品：向其中一个施用lur1-6缀合物，向另一个施用相应的裸的含t细胞表位的抗原(slp1-6)和向第三个施用盐水溶液。lur1-6缀合物对应于本文所述的缀合物i-vi。它们如实施例2所述合成；它们分别包含seq id no:100的含b细胞表位的肽和seq id no:13-seq id no:17和seq id no:20的含t细胞表位的抗原。slp1-6分别对应于seq id no:13-seq id no:17和seq id no:20的肽。
[0334]
施用lur1-6或slp1-6 2小时后，添加布雷菲德菌素并且在另外4小时后，采血并进行细胞内染色以分析细胞因子的产生。观察到记忆cd8 t细胞的低水平的细胞因子产生。然后给予了供体包含ttd(dtp疫苗)的加强疫苗，以提高他们的抗ttx抗体水平。在这种加强后约1-2周内，重复环实验和细胞因子产生分析。现在在疫苗接种前具有最高的抗mtte-igg1水平的两名个体(一名患者和一名健康志愿者)的lur1-6处理的血液中发现了记忆cd8 t细胞中的细胞因子产生，如图2a、c所示。其他细胞群，包括cd4 cd45ro 记忆t细胞(图2a、c)、cd8cd45ro-和cd4cd45ro-(未显示)对lur1-6处理没有响应。
[0335]
这些结果表明缀合物i-vi可以诱导免疫应答。在血液中发现细胞因子产生的健康个体也是男性，因此他血液中的细胞因子产生可能是由于先前或正在进行的前列腺炎，其引发了自身反应性t细胞的激活和扩增。
[0336]
用小鼠抗mtte igg2a和lur1-6混合物处理来自未进行dtp疫苗接种的患者(供体pmo30)的血液，诱导了cd8 cd45ro t记忆细胞的tnfα释放(图2b、d)。
[0337]
实施例6-dtp加强剂提高了癌症患者中的抗ttx抗体滴度
[0338]
实施例5的结果表明，对癌症患者施用dtp加强疫苗会导致抗ttx抗体的滴度增加，包括识别seq id no:1的mtte的抗体(如健康志愿者的情况，fletcher等,journal of immunology 201(1):87-97 2018)。这是通过实验测试的。
[0339]
方法
[0340]
如上文实施例5中所述从患者获得血浆。在患者接受dtp疫苗接种之前和之后7-10天采集血浆。
[0341]
使用内部elisa测定来自患者(dtp疫苗接种之前和之后)的血浆中的抗mtte抗体滴度。链霉亲和素板(thermo scientific)用在其c末端生物素化的seq id no:104的肽和seq id no:103的乱序肽(ettm)(也在其c末端生物素化)在4℃下包被过夜。将板用pbs(0.05％tween)洗涤并在室温下用pbs(10％bsa和0.05％tween)封闭1小时。将血浆在pbs(1％bsa和0.05％tween)中连续稀释，施加到板上并在室温下孵育2小时。mtte特异性igm和
igg抗体用第二hrp缀合的抗体检测：兔抗人igg(来自dako的多克隆抗体；1:4000稀释)、抗igg1(来自thermo fisher的克隆hp6070；1:500稀释)、抗igg4(来自thermo fisher的克隆hp6023；1:500稀释)和抗igm(来自dako的多克隆；1:1000稀释)。第二hrp缀合的抗体在pbs(1％bsa)中稀释并在室温下在板上孵育1小时。将反应用底物tmb(dako)显色并用1m h2so4终止。使用imark酶标仪(bio-rad)在450-570nm处读取吸光度。
[0342]
结果
[0343]
分析结果如图3所示。图3a显示了在dtp疫苗接种之前和之后从患者血浆中获得的igg抗体滴度；图3b显示了igg1抗体的滴度，图3c显示了igg4抗体的滴度，并且图3d显示了igm抗体的滴度。
[0344]
如所示，相对于之前，在向患者施用dtp加强剂之后观察到识别seq id no:1的mtte的igg1抗体滴度的统计学显著增加。在dtp加强后未观察到igg4或igm抗体的滴度增加。使用配对t检验分析数据。
[0345]
实施例7-体外抗原呈递
[0346]
方法
[0347]
细胞
[0348]
d1细胞是最初来源于c57bl/b6小鼠的生长因子依赖性未成熟树突细胞(dc)。未成熟d1细胞用gm-csf(20ng/ml)培养。b3z是鼠t细胞杂交瘤，其对鼠i类mhc h-2kb的背景下的ova来源的cd8 表位siinfekl(seq id no:89)具有特异性，并且在il-2启动子的控制下表达β-半乳糖苷酶(karttunen等,pnas 89(13):6020-6024,1992)。b3z细胞在具有10％热灭活fbs、1％青霉素/链霉亲和素、50μmβ-巯基乙醇并补充有潮霉素b(invitrogen，life technologies，罗克维尔市，美国)的iscove改良dulbecco培养基(imdm)中培养。如fletcher等(同上)所述，产生和培养产生小鼠抗mtte igg1和igg2a抗体(即识别seq id no:1的抗体)的杂交瘤细胞系。
[0349]
体外抗原呈递测定
[0350]
如先前所述进行抗原呈递测定(mangsbo等，molecular immunology 93:115-124(2018))。简而言之，通过将实施例2和3中合成的缀合物(其包含被b3z细胞识别的siinfekl t细胞表位)与抗原特异性抗体(抗mtte igg1或igg2a)在37℃下孵育30分钟而预先形成免疫复合物。将免疫复合物与d1细胞(2.5x104/孔)孵育24小时，去除上清液，随后添加b3z细胞并以1:2的dc:t细胞比例再孵育24小时(5x104/孔)。免疫复合物以比其工作浓度高3倍的浓度预先形成。将复合物添加到d1细胞中导致它们稀释至其工作浓度。然后用包含β-半乳糖苷酶底物氯酚红-βd-吡喃半乳糖苷(cprg；1.8μg/ml)的裂解溶液(100mmβ-巯基乙醇，0.125％igepal ca-630，9mm mgcl2)在37℃裂解细胞6小时，然后使用imark酶标仪(bio-rad)在595nm处测量吸光度。
[0351]
gmp lug 1-6构建体与人单克隆抗mtte igg1抗体的结合
[0352]
使用内部elisa来确认gmp产生的lug 1-6构建体与重组人单克隆抗mtte igg1抗体的结合。将elisa板用在milli-q水中稀释至一定浓度范围(0.000457-1nmol/ml，每孔单个缀合物)的100mi/孔缀合物包被。将板覆盖并在4℃下孵育过夜。随后将板洗涤四次并用包含10％bsa和0.05％tween20的200μl/孔pbs封闭，并在室温(rt)下孵育1小时。洗涤后，添加补充有1％bsa和0.05％tween20的pbs中的0.1μg/ml的人嵌合抗mtte igg1抗体(由瑞士
evitria ag定制，》99％单体含量和《0.1eu/mg内毒素)。将板用包含0.05％tween20的250μl/孔pbs洗涤四次，并将在补充有1％bsa的pbs中以1:8000稀释的第二抗体(抗人κ轻链第二抗体，thermo fisher scientific#a 18853)添加到所有孔(100μl/孔)。在黑暗中于室温下孵育1小时后，洗涤板并将100μl tmb添加到孔中。用100μl/孔1m h2so4终止反应，并在450-570nm波长处测量吸光度。
[0353]
gmp lug 1-6构建体与人多克隆抗mtte抗体的结合
[0354]
将与上述相同的内部elisa用于确认gmp产生的lug1-6构建体与来自先前证实具有抗mtte抗体的人供体的血浆的人多克隆抗mtte抗体的结合。
[0355]
将elisa板用在milli-q水中稀释的一定浓度范围(0.004、0.03、0.4和1nmol/ml，每孔单个缀合物)的100μ/孔缀合物包被。将板覆盖并在室温下孵育2小时。然后将板用包含0.05％tween20的250μl/孔pbs洗涤4次。然后将板在室温下用200μl/孔superblock t20(thermo scientific)封闭3次，每次5分钟。将板用包含0.05％tween20的250μl/孔pbs洗涤4次。将供体人血浆在补充有1％bsa和0.05％tween20的pbs中1:200稀释，并以100μl/孔的量施加到板上，然后在室温下孵育2小时。将板再次用包含0.05％tween20的250μl/孔pbs洗涤4次，并将在补充有1％bsa的pbs中以1:8000稀释第二抗体(抗人κ轻链第二抗体，thermo fisher scientific#a 18853)添加到所有孔(100μl/孔)。在黑暗中在室温下孵育1小时后，洗涤板并将100μl tmb加入孔中。用100μl/孔1m h2so4终止反应，并在450-570nm波长处测量吸光度。
[0356]
结果
[0357]
dc1树突细胞与根据实施例2和3合成的缀合物形成的免疫复合物一起孵育。这些缀合物基本相同，除了根据实施例2合成的缀合物包含完整的琥珀酰亚胺环，而根据实施例3合成的缀合物的环被打开。这些实验的结果如图4所示，其中595nm处的吸光度较高表明t细胞活化水平较高。
[0358]
图4a显示了从具有完整环的缀合物中呈递抗原所获得的结果；图4b显示了从具有开环的缀合物中呈递抗原所获得的结果。可以看出，在抗原呈递测定中，两种缀合物都能够激活b3z t细胞，尽管具有打开的琥珀酰亚胺环的缀合物推动了更高水平的t细胞活化。如通过elisa分析的，具有开环的缀合物也被证实结合抗mtte抗体(重组单克隆人igg1抗体，图7a；和多克隆人供体抗体，图7b)。
[0359]
实施例8-一名患者和一名健康个体中响应者的hla谱和记忆cd8 t细胞对单个构建体的响应
[0360]
分析在实施例5中dtp加强疫苗接种后血液显示对lur1-6缀合物的混合物响应增加的两名个体，以确定他们的hla谱，并因此确定他们可能对哪种缀合物有响应。此外，评估了一名未接受dtp加强剂但在给予与构建体一起的兔抗mtte抗体时表现出响应的患者。然而，该供体也进行了hla分析，在取样期间显示出血液凝固，因此实验计划没有完全执行并且所有环都没有运行。因此，该患者已从数据分析中删除，并且未在下方显示：
[0361]
基于肽的cd8表位和供体的hla类型i类，分析的患者可以对lug2、3和6有响应，而健康个体可以对lug2、3、5和6有响应。
[0362]
lug1＝seq id no:13；lug2＝seq id no:14；lug3＝seq id no:15；lug4＝seq id no:16；lug5＝seq id no:17；lug6＝seq id no:20。
no:97)以低百分位排名与hla-a*02:01结合。
[0387]
lug5在cd4 cd45ro阴性群体中也显示出升高的ifnγ响应(未示出)。
[0388]
无论何时使用缩写lug，都意味着构建体具有gmp质量，而无论何时使用缩写lur，都意味着构建体是为研究目的而制造的。在结构上每个构建体lug1、lug2、lug3、lug4、lug5和lug6对应于构建体lur 1、lur2、lur3、lur4、lur55和lur6。
[0389]
实施例9-小鼠中缀合物的测试
[0390]
方法
[0391]
人源化hla-dr4小鼠中表位特异性t细胞响应的评估
[0392]
c57/bl6背景下的雌性hla-dr4转基因小鼠(研究开始时12周大)获自taconic(germantown，马里兰州，美国)。向hla-dr4动物在尾基部皮下施用lug2构建体(20μg或5μg)，两周后加强。一周后处死小鼠，收集脾脏以产生单细胞悬液，用于如下所述的elispot分析。进行心脏出血以分析lug2暴露后的抗mtte滴度。未暴露于lug2的尾静脉取样hla-dr4动物用作用于基线滴度评估的对照(未暴露的动物)。
[0393]
免疫应答的评估
[0394]
使用内部elisa确定针对mtte的抗体滴度。将链霉亲和素板(thermo scientific)用在c末端生物素化的seq id no:104的肽在4℃下包被过夜。将板用pbs(0.05％tween)洗涤并在室温下用pbs(10％bsa和0.05％tween)封闭1小时。将小鼠血清在pbs(1％bsa和0.05％tween)中连续稀释，施加到板上并在室温下孵育2小时。小鼠mtte特异性igg抗体用第二hrp缀合的抗体检测：山羊抗小鼠igg(来自dako的多克隆抗体；1:4000稀释)。将第二hrp缀合的抗体在pbs(1％bsa)中稀释并在室温下在板上孵育1小时。将反应用底物tmb(dako)显色并用1m h2so4终止。使用imark酶标仪(bio-rad)在450-570nm处读取吸光度。
[0395]
通过用包含嵌入的hla-dr4序列的slp刺激脾细胞来评估hla-dr4表位的免疫原性。这使用离体ifnγelispot测定法(用于小鼠ifnγ/3321-2a的elispot试剂盒，mabtech，斯德哥尔摩，瑞典)进行。具有tap序列的lug2 slp具有seq id no:14所示的氨基酸序列，不具有tap序列的lug2 slp如seq id no:107所示；两者都包含嵌入的hla-dr4序列。在收获脾脏的前一天，根据制造商的方案，将用于ifn-γelispot测定的96孔elispot板(millipore)用捕获抗体预包被。用pbs/tween洗涤5次并且用t细胞培养基(包括包含1％w/v l-谷氨酰胺(sls/lonza)、10％v/v fbs(fisher/ge healthcare)、2％hepes(sls/lonza)、0.1％v/v二性霉素(promega)的rpmi 1640(life technologies/thermo fisher scientific))封闭至少30分钟后，将0.5x106/孔新鲜分离的脾细胞与100μl终浓度为10μg/ml的各slp一起一式三份接种到板中。然后将细胞在5％co2培养箱中在37℃下培养48小时，然后用dpbst洗涤板5次。然后添加针对小鼠ifnγ的50μl/孔生物素化检测抗体(1/1000稀释)，并将板在室温下孵育2小时。然后用dpbst洗涤板5次，然后添加50μl/孔链霉亲和素碱性磷酸酶(1/1000稀释)。然后将板在室温下孵育1小时30分钟。孵育后，用dpbst再次洗涤板6次，然后添加50μl/孔显影液(bcip/nbt，biorad)。将板在室温下置于黑暗中直到可以看到斑点。一旦出现斑点，就通过用自来水冲洗板来停止反应。然后将板晾干，并使用elispot酶标仪(cellular technology limited,shaker heights,俄亥俄州,美国)对斑点进行定量。对于每个elispot测定，seb葡萄球菌肠毒素-b(2.5μg/ml)用作阳性对照，并且未刺激的脾细胞(单独的细胞)用作阴性对照。所有实验一式三份进行。当单独细胞的孔中的斑点数不超过20并且
当包含肽的孔中的响应是对照孔平均值的标准偏差的至少两倍时，将动物评分为具有阳性反应。
[0396]
结果
[0397]
在人全血环测定中对表达细胞因子的t细胞的评估确定了一小部分健康个体和前列腺癌患者具有响应以在与lur/lug 1-6构建体形成ic时具有ifnγ和/或tnfα表达。然而，该测定受到人血液中表位特异性t细胞频率低以及缺乏可能增加该方法灵敏度的四聚体/多聚体的限制。因此，为了解决表位特异性t细胞的体内启动和扩增，使用了商业hla-dr4小鼠。由于lug2包含hla-dr4限制性psma表位，因此可以将动物暴露于lug2缀合物并评估cd4 t细胞启动。hla-dr4小鼠接受了具有lug2构建体的初免/加强疫苗接种方案。从lug2暴露动物和作为对照的未暴露动物收集的血清中，我们发现暴露于lug2的小鼠增加了它们的抗mtte抗体滴度。在用包含在lug2构建体(uv02,seq id no:14)中的slp或没有tap arww序列的slp(uv08,seq id no:107)处理来自lug2接种动物的脾细胞后，注意到产生ifn-γ的t细胞数量增加(图8示出了从接种20μg lug2的小鼠获得的结果；从接种5μg lug2的小鼠获得类似的结果模式——数据未示出)。
[0398]
实施例10-缀合物安全性
[0399]
方法
[0400]
boostrix疫苗接种患者血浆中的细胞因子和补体分析
[0401]
在接种tdp疫苗boostrix(gsk，布伦特福德，英国)后约两周，从五名健康个体和五名前列腺癌患者中采集血液。
[0402]
为了评估关于细胞因子释放和补体激活的输注反应，用3种不同浓度的tendu疫苗混合构建体lug1-6处理血液，使用了0.05μg/ml、0.5μg/ml和2.5μg/ml的每种单独构建体。在血环测定中0和4小时后收集的血浆用于使用mesoscale v-plex试剂盒(msdkenilworth,新泽西,美国)根据制造商的说明进行ifn-γ、il-1β、il-2、il-6、il-8、il-10和tnf-α的浓度确定。使用msd软件计算检测下限(llod)，并且定义为高于零校准器2.5 x sd。使用msd软件根据标准-1的信号值计算检测上限(ulod)。使用msd验证定量下限和上限(lloq和uloq)，并根据标准曲线和稀释剂标准的百分比回收率计算，精度为20％，准确度为80-120％。
[0403]
根据制造商的说明，使用来自hycult biotech(乌登,荷兰)的elisa试剂盒分析血环测定中0和15分钟后收获的血浆的补体激活(c3a和c5a)。
[0404]
兔毒性
[0405]
meditox(kon
á
rovice,捷克共和国)在雄兔中测试了tendu疫苗的毒性。用破伤风类毒素疫苗(t vet.≥30iu/ml，orion pharma animal health，丹德吕德，瑞典)对兔皮下接种四次(间隔两周)以产生ttd血清反应阳性的动物。再过两周后，用tendu以低(10μg/构建体，n＝5)、中(100μg/构建体，n＝5)或高(240μg/构建体，n＝8)剂量皮下接种兔四次(间隔两周)。两个对照组是只接受破伤风疫苗接种的兔(n＝5)和只接受高剂量tendu的兔(n＝5)。进行诸如体重、体温、摄食量、检眼镜检查、血液分析、血清化学、尿液分析和病理检查等临床观察。
[0406]
在tendu施用前第15周和tendu施用后4小时和24小时将血样收集在k3 edta管中。将血样离心(3500rpm 10分钟，在4℃)。收集血浆并储存在-20℃，直到用elisa分析。
[0407]
elisa用于兔血浆中的细胞因子检测
[0408]
以下elisa试剂盒用于分析兔血浆中的细胞因子：raybio rabbit il-8(目录号ell-il-8-1),raybio il-1β(目录号ell-il1b-1)和raybio rabbit ifnγ(目录号ell-ifng-1)(norcross,ga,usa)。根据制造商的说明进行细胞因子分析。
[0409]
结果
[0410]
利用来自接种boostrix疫苗的健康个体和前列腺癌患者的血液样品，使用血环系统评估疫苗构建体的安全性。我们评估了三个剂量下的细胞因子释放和补体激活。施用的每种缀合物的最高剂量为240μg。在人中，在估计身体包含10l血液/细胞外液体的情况下，该剂量将导致每种缀合物的约0.024μg/ml的cmax。响应于免疫复合物形成的补体激活可导致c3a和c5a成分的释放，这些成分充当过敏毒素并增加炎症反应。我们分析了裂解的补体成分c5a和c3a的浓度和产量(图9a-b)。c3a浓度在健康个体和前列腺癌患者中响应于0.5μg/ml和2.5μg/ml lug1-6构建体而略微增加，该浓度高于来自皮下施用缀合物的任何预期cmax浓度。c5a浓度仅在用2.5μg/ml的每种lug1-6构建体处理时类似地增加。对于最低剂量，在任何预期的全身暴露范围内，未检测到补体激活。如预期的，阿仑单抗(一种已知会导致补体固定的抗体)导致前列腺癌患者和健康个体二者中c3a和c5a二者的浓度增加。在血液中输注生物治疗剂可以通过不同的机制诱导细胞因子释放，因此我们分析了用lug 1-6构建体刺激后一组细胞因子的产生。阿仑单抗(一种已知诱导细胞因子释放的抗体)导致细胞因子il-8(图9c)、ifnγ、il-6il-1btnfα(图9f-i)和il-10(数据未示出)的产生显著增加。lug1-6构建体仅在每种疫苗构建体的2.5μg/ml的最高浓度时导致il-8显著升高，而其余细胞因子ifnγ、il-6和tnfα不受所分析的任何浓度的tendu构建体处理的影响。此外，il-2、il-10和il-1β的产生不受所使用的任何tendu浓度的影响(数据未示出)。
[0411]
tendu的安全性也在破伤风类毒素血清反应阴性或血清反应阳性的雄兔中进行了体内评估。兔用低、中或高剂量的tendu接种四次，并且在任何组中都没有观察到毒性的临床症状。皮下注射没有诱导任何局部不良反应，并且对研究中兔的体重、摄食量或体温没有影响。为了评估由于tendu皮下施用后细胞因子释放的可能风险，并且由于在血液直接暴露于2.5μg/ml的每种lug构建体的tendu后释放了il-8，因此分析了从兔收集的血浆中的ifn-γ、il-8和il-1b。在大多数样品中检测不到ifn-γ，在施用tendu后浓度没有任何增加(图9e)，但在不同剂量组的一些动物中，接种dtp的兔血浆中的l-8浓度随时间略有增加(长达24小时)，而与高剂量tendu的施用没有明显关联(图9d)。在所有时间点和分析的tendu剂量下都检测不到il-1β(数据未示出)。