一种改善大菱鲆肠道健康的饲料添加剂及应用

1.本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种改善大菱鲆肠道健康的饲料添加剂及应用。


背景技术：

2.水产品是人们摄取优质食物的重要来源。随着我国社会的高速发展，水产养殖业也获得了长足的发展，极大的缓和了人类对水产品需求的不断增长和天然渔业资源日益枯竭之间的矛盾。然而，集约化养殖条件下，水产养殖行业面临着由养殖密度过大引发的水产动物疾病频发及死亡率攀升等问题。同时，水产养殖过程中水域环境恶化、抗生素的不合理使用等造成的耐药菌株数目增加、水生动物抗应激能力下降、肠道疾病频发及药物残留等负面影响严重困扰和危害了水产养殖业的健康可持续发展。
3.鱼类肠道不仅是营养物质消化吸收的主要场所，也是机体重要的免疫器官，其功能正常与否直接关系宿主的健康状态。完整的肠道组织结构是其行使正常功能的必要条件。由于不断地暴露于各种外源物质中，鱼类肠道极易产生各种应激反应，抗氧化防御系统可以保护机体免受自由基引起的氧化损伤。抗氧化酶如sod，cat可以把有害的超氧自由基转化完全无害的物质，对于维持机体机体的氧化还原平衡状态至关重要。肠道消化酶如胰蛋白酶，淀粉酶及脂肪酶活性的高低反应了机体对营养物质的消化水平，直接影响机体代谢。肠道微生物是由肠道常驻菌和过路菌组成，是肠道黏膜屏障的重要组成部分，可参与宿主的营养物质消化吸收、能量代谢、免疫应答等过程。正常的肠道菌群可以抑制病原菌的繁殖使鱼体免受病原菌的侵袭。
4.当前抗生素滥用致使细菌耐药性和药物残留等问题日益突出。饲料中全面禁止添加抗生素，是维护动物源食品安全和公共卫生安全的重要举措。虽然全面禁抗能有效缓解滥用抗生素带来的危害，但是并不能从根本上解决问题，因此寻找绿色健康的饲料添加剂亟不可待。植物类提取物具有天然安全高效等特点是替代抗生素的良好选择。大豆黄酮是从大豆中提取的一种黄酮类化合物，它是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，属异黄酮类植物雌激素，广泛存在于植物中，具有多种生物活性如抗炎、抗氧化、抗凋亡等。在小鼠肠炎模型中，黄酮类提取物或化合物可以降低肠道促炎细胞因子的表达、增强肠道紧密连接，进而抑制肠道炎症反应。在肠道微生态的调控方面，一方面，大豆黄酮在肠道中经肠道微生物代谢为雌马酚和去氧甲基安哥拉紫檀素(o-dma)，进而发挥生物学作用；另一方面，黄酮类化合物能够调节肠道菌群的组成，增强特定的有益菌株的生长，同时抑制某些病原菌如梭菌和沙门氏菌的生长。在畜禽中，大豆黄酮已被列为饲料添加剂被广泛使用。但异黄酮类物质容易在肠道ⅱ相药物代谢酶作用下被代谢为ⅱ相代谢产物，造成其生物利用度极低。而非消化性糖类，如可溶性大豆多糖和水苏糖，可以抑制肠道ⅱ相药物代谢酶的表达。因此，大豆黄酮与非消化性糖类协同作用可有效提高异黄酮的生物利用度。近年来，饲料添加剂的开发备受关注。相较于单一的饲料添加剂，饲料添加剂具有明显优势，它使各种单一的添加剂的作用得以互补，产生加性效应，可降低各单一添加剂
的使用量，在提高产品的安全性的同时还可降低成本。水苏糖是自然界存在的一种四糖，其广泛分布于豆科植物中，属于棉子糖属半乳糖苷类非还原性功能性低聚糖。它不为人体肠胃消化液所分解，能被人体肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌群利用，促进这些有益菌的增殖。然而，目前畜禽及水产动物饲料中大豆黄酮与水苏糖联合使用的应用研究还未见报道。两者联合使用能否提高鱼类肠道黏膜屏障功能、抗炎抗氧化能力及调节肠道菌群结构还不得而知。因此探究大豆黄酮与水苏糖联合使用对鱼类肠道健康的作用效果对于水产动物新型饲料添加剂的开发及促进水产养殖业的绿色健康可持续发展具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种改善大菱鲆肠道健康的饲料添加剂及应用，本发明首次将植物雌激素与低聚糖复配应用于水产饲料中以增加大菱鲆肠道消化酶活力及肠道黏膜屏障功能，提高抗炎、抗氧化及抗凋亡能力，改善肠道菌群结构，全面提高鱼类肠道健康状况。
6.本发明是通过如下技术方案来实现的：
7.一种改善大菱鲆肠道健康的饲料添加剂，该饲料添加剂由大豆黄酮和水苏糖组成，2种成分在大菱鲆饲料中的质量比为大豆黄酮0.002-0.4％、水苏糖2.0-3.0％。
8.优选的，所述的饲料添加剂的2种成分在大菱鲆饲料中的质量比为：大豆黄酮0.004％、水苏糖2.5％。
9.本发明还提供所述饲料添加剂在大菱鲆饲料中的应用，所述大菱鲆饲料的成分及质量百分比为：鱼粉36.00％、豆粕15.68％、玉米蛋白粉8.00％、谷朊粉5.12％、花生粕3.20％、啤酒酵母2.5％、小麦粉14.126％、牛磺酸1％、复合氨基酸1.37％、鱼油8％、大豆卵磷脂1％、多维多矿预混料1％、氯化胆碱0.25％、乙氧基喹啉0.05％、丙酸钙0.1％。
10.本发明与现有技术相比的有益效果：
11.1.本发明只含2种成分，与多种成分复合的添加剂相比配伍简单明确，受不同成分变动的影响较小，因此效果更加稳定。
12.2.本发明大豆黄酮具有显著的抗炎、抗氧化作用，而水苏糖在改善肠道菌群结构上具有独特优势，两者协同作用能显著提高大菱鲆肠道胰蛋白酶活性；上调后肠紧密连接蛋白的基因表达水平；降低促炎细胞因子及细胞凋亡相关基因的表达水平；提高后肠t-aoc水平的活力；显著提高大菱鲆肠道特定益生菌乳酸杆菌的丰，全面提高鱼类肠道健康状况。
13.3.本发明中大豆黄酮和水苏糖均来源于植物，无毒副作用、绿色安全、无污染、无残留。
附图说明
14.图1为饲料添加剂对大菱鲆肠道消化酶活性的影响对比图。误差线表示平均值的标准误(n＝9)，不同字母表示数值差异显著(p《0.05)。
15.图2为饲料添加剂对大菱鲆后肠组织形态结构的影响对比图。对照组(a和d)，大豆黄酮组(b和e)，水苏糖组(c和f)饲料添加剂组(d和g)，a、b、c和d比例尺为500μm，d、e、f和g比例尺为50μm。
16.图3为饲料添加剂对大菱鲆后肠紧密连接蛋白基因表达水平的影响对比图。误差
线表示平均值的标准误(n＝6)，不同字母表示数值差异显著(p《0.05)。
17.图4为饲料添加剂对大菱鲆后肠炎性细胞因子基因表达水平的影响对比图。误差线表示平均值的标准误(n＝9)，不同字母表示数值差异显著(p《0.05)。
18.图5为饲料添加剂对大菱鲆后肠抗氧化酶活性的影响对比图。误差线表示平均值的标准误(n＝9)，不同字母表示数值差异显著(p《0.05)。
19.图6为饲料添加剂对大菱鲆后肠凋亡相关因子基因表达水平的影响对比图。误差线表示平均值的标准误(n＝9)，不同字母表示数值差异显著(p《0.05)。
20.图7为kruskal-wallis h检验比较分析摄食不同饲料大菱鲆后肠属水平上的差异菌对比图。
具体实施方式
21.为使本发明更加清楚、明确，以下对本发明的技术方案进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.实施例1大菱鲆饲料添加剂的制备：
23.一种改善大菱鲆肠道健康的饲料添加剂，每1kg饲料添加剂包含：大豆黄酮1.6g、水苏糖998.4g。
24.所述的饲料添加剂的制备方法：将大豆黄酮和水苏糖混合均匀，即得。
25.所述的大豆黄酮纯度≥98％。
26.所述的水苏糖提取自唇形科草石蚕，纯度≥80％。
27.所述的大豆黄酮和水苏糖均可提高商业途径直接购买。
28.实施例2饲料添加剂促进大菱鲆肠道健康的应用
29.将所述的饲料添加剂以2.504％的质量添加到基础饲料中，得到大菱鲆饲料。所述的基础饲料的饲料成分及质量百分比为：鱼粉36.00％、豆粕15.68％、玉米蛋白粉8.00％、谷朊粉5.12％、花生粕3.20％、啤酒酵母2.5％、小麦粉14.126％、牛磺酸1％、复合氨基酸1.37％、鱼油8％、大豆卵磷脂1％、多维多矿预混料1％、氯化胆碱0.25％、乙氧基喹啉0.05％、丙酸钙0.1％、三氧化二钇0.1％。同时设置基础饲料作为对照组，在基础饲料中添加0.004％大豆黄酮设为大豆黄酮组，在基础饲料中添加2.5％的水苏糖设为水苏糖组，制成等氮等脂的4组饲料，饲料配方如表1。饲料原料经超微粉碎过60目筛网，各原料按配比定量后混合均匀，经双螺杆挤条机挤压出3mm粒径的饲料，在55℃的通风烤箱中干燥约12h，后贮存于-20℃冰箱中备用。每个处理3个养殖桶，每桶30尾鱼。所得试验数据采用平均值
±
标准误表示，用spss 22.0分析软件进行单因素方差分析，采用tukey's检验方法比较组间差异显著性，p《0.05表明各组差异显著水平显著。
30.表1实验饲料配方
[0031][0032][0033]a鱼粉(干物质，％)：cp 70.47，cl 11.13；豆粕(干物质，％)：cp 53.00，cl 2.23；小麦粉(干物质，％)：cp 19.90，cl2.44；谷朊粉(干物质，％)：cp 83.86，cl 2.51；玉米蛋白粉(干物质，％)：cp 63.76，cl 2.35；花生粕(干物质，％)：cp 54.27，cl 2.43；啤酒酵母(干物质，％)：cp 43.79，cl 3.13。
[0034]b维生素和矿物质预混合物(mg/kg)：维生素a醋酸酯，150；维生素d3，3.75；dl-α-维生素e，4000；维生素k3，500；硫胺素500；核黄素800；盐酸吡哆醇，600；维生素b12，2；l-抗坏血酸-2-单磷酸钠，10000；泛酸钙，2000；烟酸，3000；肌醇，10000；生物素，5；叶酸，170，水
分《10％；铁，12000；锌，6000；铜，400；锰，3000；碘，100；钴，10；硒，10；镁，15000。
[0035]
采用上述配方制成的饲料，在山东省海阳市黄海水产有限公司的流水养殖系统中开展养殖实验，养殖周期为8周。每天向各处理组投喂相应的饲料。投喂频率：一日两次(08:00和18:00)，将大菱鲆慢慢投喂至表观饱食，试验结果如下：
[0036]
表2饲料添加剂对大菱鲆生长性能及饲料利用的影响
[0037][0038]
注:所有数据表示为平均值
±
标准误。
[0039]
由表2可见，各组饲料并未对大菱鲆的生长性能和饲料效率产生显著影响(p》0.05)。
[0040]
表3饲料添加剂对大菱鲆体成分的影响
[0041][0042]
注:所有数据表示为平均值
±
标准误。
[0043]
由表3可见，各组饲料并未对大菱鲆的体成分产生显著影响(p》0.05)。
[0044]
由图1可以看出，饲料中添加所述饲料添加剂可显著增加大菱鲆肠道胰蛋白酶活性(p《0.05)。
[0045]
图2为大菱鲆后肠组织结构切片图。对照组(a和d)，大豆黄酮组(b和e)，水苏糖组(c和f)饲料添加剂组(d和g)，a、b、c和d比例尺为500μm，d、e、f和g比例尺为50μm。
[0046]
由图2可以看出，各个处理组中大菱鲆后肠肠道上皮细胞完整、细胞核均位于细胞基底部且排列整齐，固有层均未出现显著宽度现象。对照组后肠固有层中有炎性细胞浸润，添加大豆黄酮后炎性细胞浸润现象有所缓解，饲料添加剂组大菱鲆后肠固有层未观察到明显的炎性细胞浸润。
[0047]
由图3可知，饲料中添加饲料添加剂可显著上调紧密连接蛋白jam、tricelluin、zo-1、occludin、claudin like和claudin-3的基因表达水平(p《0.05)。单独添加大豆黄酮及水苏糖分别显著提高了tricelluin及zo-1的基因表达水平(p《0.05)。
[0048]
由图4可知，饲料中添加饲料添加剂可显著下调促炎细胞因子tnf-α及il-22的基因表达水平(p《0.05)。而单独添加大豆黄酮及水苏糖仅显著下调了tnf-α的基因表达水平
(p《0.05)，对il-22、il-8及tgf-β的表达水平无显著影响(p》0.05)。
[0049]
由图5可以看出，饲料中单独添加大豆黄酮、水苏糖及添加饲料添加剂均可显著增加大菱鲆后肠t-aoc活性(p《0.05)；此外，单独添加大豆黄酮还显著上调了sod活性。
[0050]
由图6可知，饲料中添加饲料添加剂可显著下调促凋亡因子caspase-9的基因表达水平(p《0.05)。
[0051]
图7kruskal-wallis h检验比较分析显示摄食不同饲料的大菱鲆后肠属水平上的差异菌群。由图7可知，与对照组相比饲料中添加饲料添加剂可显著提高大菱鲆后肠益生菌如：乳杆菌属(lactobacillus)及梭状芽胞杆菌(norank_f__norank_o__clostridia_ucg-014)丰度。
[0052]
小结
[0053]
饲料中添加饲料添加剂能显著提高大菱鲆肠道胰蛋白酶活性；上调后肠紧密连接蛋白的基因表达水平；降低促炎细胞因子及细胞凋亡相关基因的表达水平；提高后肠t-aoc水平的活力；显著提高大菱鲆肠道特定益生菌乳酸杆菌的丰度。由此可见，上述发明可有效提高大菱鲆肠道对营养物质的消化吸收能力及抗应激水平，增强肠道黏膜屏障屏障功能及改善菌群结构，对于全面提升大菱鲆肠道健康状况卓有成效，因此具有重要的应用价值。
[0054]
上述基础饲料配方为模拟常用的商业饲料配方，其实施方式也仅为本发明较佳的具体实施方式，并非对本发明保护范围的限制，在能够满足大菱鲆正常生长的情况下，实施本发明的动态添加方案，均能达到本发明效果。任何在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变的动态实施方案，都应涵盖在本发明的保护范围之内。