一种人滋养干细胞外泌体的制备方法与流程

1.本发明涉及外泌体领域，更具体地说，涉及一种人滋养干细胞外泌体的制备方法。


背景技术：

2.外泌体是一类来源于早期细胞内体，具有膜结构的细胞外小囊泡，它的直径介于50-150nm之间，目前多项研究表明外泌体可以被大多数细胞所分泌，同时可以在血液、尿液、脑脊液、腹水、卵泡液、羊水、关节液等大多数体液中被检测到，外泌体的表面及内部含有大量蛋白质，脂质，核酸等多种物质，而且不同细胞来源的外泌体，其内部的成分各不相同，间充质干细胞(msc)来源的外泌体，由于与来源细胞本身具有相似的特性，因此在创伤修复、组织重建，以及心血管病、脑损伤、炎症等方面表现出丰富的潜在治疗能力，具有广泛的应用前景。
3.目前在人滋养干细胞外泌体的制备过程中，有在人脐带组织中进行提取干细胞外泌体，而在人脐带组织中进行提取干细胞外泌体过程中，由于人脐带组织中含有大量杂质和油脂，在清洗过程中，由于油脂的扩散性，可能需要清洗多次才能处理干净进行利用，这样则大大降低了工作效率，同时油脂和杂质的产生挂壁在清洗箱上，后期还需要进行清理，也降低了一定的工作效率，而一段时间的不清理可能还会造成过多细菌的滋生和散发出异味，造成环境的污染。


技术实现要素：

4.1.要解决的技术问题
5.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种人滋养干细胞外泌体的制备方法，它可以实现在人脐带组织清理过程中，通过倒入清洗液在清洗箱内，后放置多个吸油装置在清洗液内，启动搅动棒，使搅动棒进行旋转带动着人脐带组织进行无规则转动清理，将人脐带组织内部的杂质油脂甩出，使得杂质油脂与人脐带组织分离漂浮在清洗液上表面，而此时部分杂质油脂透过透液孔和透水隔膜从而进行承载球囊内，形变球囊将进入的油脂杂质进行吸附，对清洗箱的杂质油脂进行清理收集，而形变球囊在吸油过程中逐渐发生膨胀与承载球囊内壁开始贴合，致使进入承载球囊内的清洗液受到挤压向外侧排出，而清洗液从透液孔内排出时也带动着内部的杂质油脂向清洗箱内流动，防止了透液孔因杂质油脂造成堵塞的现象，与此同时形变球囊膨胀后拉扯着连接绳对内置球囊造成形变，使得原本封闭的形变隔膜因形变作用下打开，其内部的活性炭颗粒清理杆对外界具有吸附净化效果，将形变球囊由于吸附了杂质油脂产生的异味进行吸附净化，防止异味的产生造成细菌滋生，在形变球囊吸油饱满膨胀至承载球囊内壁时，形变球囊无法在进行吸油吸附后，在形变球囊膨胀时产生的气流和清洗液向透液孔内挤压，使清理杆向清洗箱内方向进行偏移，将透液孔内壁含杂的杂质油脂清理出去，防止透液孔内的堵塞，与此同时部分气流从形变封片进入内，在气压逐渐增多的情况下致使膨胀气囊向透液孔内壁发生膨胀，从而致使此时的透液孔呈现封闭状态不再进行吸附效果，便于此时其他未吸收油脂杂质饱
满的吸油装置继续吸收，提高其吸附杂质油脂的效率。
6.2.技术方案
7.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
8.一种人滋养干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、采集人脐带组织，并放置清理装置将剥离动脉和静脉的脐带洗净，剪成1mm的组织块；
10.s2、将s1中剪切的组织块均匀平铺在培养皿中，每皿中加入培养基，放置培养箱中培养于常温状态下6小时后，继续向皿内加入培养基，每2-3天换液一次，当细胞生长至汇合度达到70％-80％时，使用用胰酶进行消化，再1:3传代至p3至p7代细胞，提取得到脐带间充质干细胞；
11.s3、将s2中得到的脐带间充质干细胞进行离心处理，以提取得到外泌体。
12.进一步的，所述s1中的清理装置包括清洗箱，所述清洗箱上端转动连接有封闭盖板，所述清洗箱外端转动连接有出料口，所述清洗箱内底端安装有搅动棒，所述清洗箱内填充有清洗液，所述清洗液内设有吸油装置，所述吸油装置外端开凿有多个均匀分布的透液孔，所述透液孔内设有承载球囊，所述承载球囊内腔中嵌设有透水隔膜，所述承载球囊内设有形变球囊，所述形变球囊外端开凿有多个均匀分布的通孔，所述通孔内壁之间固定连接有防水透气膜，所述形变球囊内设有内置球囊，所述内置球囊上内腔中嵌设有形变隔膜，所述内置球囊与形变球囊内壁之间固定连接有两个相互对称的连接绳，所述内置球囊内填充有多个活性炭颗粒清理杆，在人脐带组织清理过程中，通过倒入清洗液在清洗箱内，后放置多个吸油装置在清洗液内，启动搅动棒，使搅动棒进行旋转带动着人脐带组织进行无规则转动清理，将人脐带组织内部的杂质油脂甩出，使得杂质油脂与人脐带组织分离漂浮在清洗液上表面，而此时部分杂质油脂透过透液孔和透水隔膜从而进行承载球囊内，形变球囊将进入的油脂杂质进行吸附，对清洗箱的杂质油脂进行清理收集，而形变球囊在吸油过程中逐渐发生膨胀与承载球囊内壁开始贴合，致使进入承载球囊内的清洗液受到挤压向外侧排出，而清洗液从透液孔内排出时也带动着内部的杂质油脂向清洗箱内流动，防止了透液孔因杂质油脂造成堵塞的现象，与此同时形变球囊膨胀后拉扯着连接绳对内置球囊造成形变，使得原本封闭的形变隔膜因形变作用下打开，其内部的活性炭颗粒清理杆对外界具有吸附净化效果，将形变球囊由于吸附了杂质油脂产生的异味进行吸附净化，防止异味的产生造成细菌滋生。
13.进一步的，所述透液孔内设有，所述与透液孔内壁之间固定连接有两个相互对称的牵引绳，所述靠近清洗箱的一端固定连接有半球橡胶块，所述远离清洗箱的一端嵌设有形变封片，所述上下两端嵌设有膨胀气囊，在形变球囊吸油饱满膨胀至承载球囊内壁时，形变球囊无法在进行吸油吸附后，在形变球囊膨胀时产生的气流和清洗液向透液孔内挤压，使清理杆向清洗箱内方向进行偏移，将透液孔内壁含杂的杂质油脂清理出去，防止透液孔内的堵塞，与此同时部分气流从形变封片进入内，在气压逐渐增多的情况下致使膨胀气囊向透液孔内壁发生膨胀，从而致使此时的透液孔呈现封闭状态不再进行吸附效果，便于此时其他未吸收油脂杂质饱满的吸油装置继续吸收，提高其吸附杂质油脂的效率。
14.进一步的，所述吸油装置包括下漂浮外壳和上漂浮外壳，所述下漂浮外壳与上漂浮外壳螺纹连接，当形变球囊吸附杂质油脂饱满后，通过取出吸油装置，旋转上漂浮外壳，
将下漂浮外壳和上漂浮外壳拆分开，取出承载球囊进行更换，便于下次清理人脐带组织内部的杂质油脂。
15.进一步的，所述形变封片未受到压力作用时为闭合状态，受压力时为开合状态，形变封片仿生于医学的心脏瓣膜原理，在未受到压力作用时，始终呈现闭合状态，内部呈现密闭空间，受到压力时，可向内外侧打开释放内部的气体，而因形变球囊吸油膨胀的作用下产生的气流透过形变封片进行其内部后，在时间的流逝下，其内部的气体对形变封片挤压，气压也逐渐慢慢释放，而气压逐渐降低时，形变封片受力也越来越小，气压泄露的也越来越小，降低了膨胀气囊受压力作用回复原位的速度，从而加强了膨胀气囊对透液孔封闭的时间。
16.进一步的，所述搅动棒的旋转方式为无规则转动，通过设置搅动棒为无规则转动，可以使搅动棒顺时针、逆时针都可转动，而人脐带组织在内部清洗过程中能够更加的充分和干净，油脂杂质甩动出来被形变球囊吸附的更快，提高其清洗效率。
17.进一步的，所述半球橡胶块靠近清洗箱的一端设置为椭圆状，且表面设有疏水层，通过将靠近清洗箱一端的半球橡胶块设置为椭圆状，可以使清洗液向透液孔内流动时，清洗液触碰半球橡胶块时在椭圆的流线型下，向承载球囊方向流动的更加流畅。
18.进一步的，所述牵引绳采用弹力绳材料制成，通过设置弹力绳材料制成的牵引绳，可以使在受到压力向清洗箱侧进行移动时能够透出透液孔，将杂质完全清理出去，防止堵塞的现象更好，同时因弹力的作用下，压力逐渐减小后逐渐慢慢复位，回复到透液孔内，不易对人脐带组织清理造成阻挡。
19.进一步的，所述封闭盖板的转轴内设有卡位装置，且表面涂设有防锈漆，通过在封闭盖板内的转轴设置卡位装置，可以使封闭盖板在转至清洗箱上端完全闭合时进行限位，无法在发生旋转，使得清洗箱封闭的更加严密，搅动棒在搅动清洗液时清洗液不易渗透出来，而通过涂设防锈漆，可以使转轴能够长时间的使用不易因空气的湿气腐蚀导致上锈的现象，提高其使用寿命。
20.3.有益效果
21.相比于现有技术，本发明的优点在于：
22.本方案可以实现在人脐带组织清理过程中，通过倒入清洗液在清洗箱内，后放置多个吸油装置在清洗液内，启动搅动棒，使搅动棒进行旋转带动着人脐带组织进行无规则转动清理，将人脐带组织内部的杂质油脂甩出，使得杂质油脂与人脐带组织分离漂浮在清洗液上表面，而此时部分杂质油脂透过透液孔和透水隔膜从而进行承载球囊内，形变球囊将进入的油脂杂质进行吸附，对清洗箱的杂质油脂进行清理收集，而形变球囊在吸油过程中逐渐发生膨胀与承载球囊内壁开始贴合，致使进入承载球囊内的清洗液受到挤压向外侧排出，而清洗液从透液孔内排出时也带动着内部的杂质油脂向清洗箱内流动，防止了透液孔因杂质油脂造成堵塞的现象，与此同时形变球囊膨胀后拉扯着连接绳对内置球囊造成形变，使得原本封闭的形变隔膜因形变作用下打开，其内部的活性炭颗粒清理杆对外界具有吸附净化效果，将形变球囊由于吸附了杂质油脂产生的异味进行吸附净化，防止异味的产生造成细菌滋生，在形变球囊吸油饱满膨胀至承载球囊内壁时，形变球囊无法在进行吸油吸附后，在形变球囊膨胀时产生的气流和清洗液向透液孔内挤压，使清理杆向清洗箱内方向进行偏移，将透液孔内壁含杂的杂质油脂清理出去，防止透液孔内的堵塞，与此同时部分
气流从形变封片进入内，在气压逐渐增多的情况下致使膨胀气囊向透液孔内壁发生膨胀，从而致使此时的透液孔呈现封闭状态不再进行吸附效果，便于此时其他未吸收油脂杂质饱满的吸油装置继续吸收，提高其吸附杂质油脂的效率。
附图说明
23.图1为本发明整体的结构示意图；
24.图2为本发明吸油装置的分解图；
25.图3为本发明承载球囊的结构示意图；
26.图4为本发明形变球囊的结构示意图；
27.图5为本发明形变球囊的动态变化图；
28.图6为本发明透液孔的结构示意图；
29.图7为本发明膨胀气囊的动态变化图。
30.图中标号说明：
31.1清洗箱、2封闭盖板、3出料口、4搅动棒、5清洗液、6吸油装置、7下漂浮外壳、8上漂浮外壳、9透液孔、10承载球囊、11透水隔膜、12形变球囊、13通孔、14防水透气膜、15内置球囊、16形变隔膜、17连接绳、18活性炭颗粒、19清理杆、20牵引绳、21半球橡胶块、22形变封片、23膨胀气囊。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图；对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然；所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例；而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例；本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例；都属于本发明保护的范围。
33.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
34.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
35.实施例：
36.一种人滋养干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
37.s1、采集人脐带组织，并放置清理装置将剥离动脉和静脉的脐带洗净，剪成1mm的组织块；
38.s2、将s1中剪切的组织块均匀平铺在培养皿中，每皿中加入培养基，放置培养箱中培养于常温状态下6小时后，继续向皿内加入培养基，每2-3天换液一次，当细胞生长至汇合
度达到70％-80％时，使用用胰酶进行消化，再1:3传代至p3至p7代细胞，提取得到脐带间充质干细胞；
39.s3、将s2中得到的脐带间充质干细胞进行离心处理，以提取得到外泌体。
40.请参阅图1-5，s1中的清理装置包括清洗箱1，清洗箱1上端转动连接有封闭盖板2，清洗箱1外端转动连接有出料口3，清洗箱1内底端安装有搅动棒4，清洗箱1内填充有清洗液5，清洗液5内设有吸油装置6，吸油装置6外端开凿有多个均匀分布的透液孔9，透液孔9内设有承载球囊10，承载球囊10内腔中嵌设有透水隔膜11，承载球囊10内设有形变球囊12，形变球囊12外端开凿有多个均匀分布的通孔13，通孔13内壁之间固定连接有防水透气膜14，形变球囊12内设有内置球囊15，内置球囊15上内腔中嵌设有形变隔膜16，内置球囊15与形变球囊12内壁之间固定连接有两个相互对称的连接绳17，内置球囊15内填充有多个活性炭颗粒清理杆19，在人脐带组织清理过程中，通过倒入清洗液5在清洗箱1内，后放置多个吸油装置6在清洗液5内，启动搅动棒4，使搅动棒4进行旋转带动着人脐带组织进行无规则转动清理，将人脐带组织内部的杂质油脂甩出，使得杂质油脂与人脐带组织分离漂浮在清洗液5上表面，而此时部分杂质油脂透过透液孔9和透水隔膜11从而进行承载球囊10内，形变球囊12将进入的油脂杂质进行吸附，对清洗箱1的杂质油脂进行清理收集，而形变球囊12在吸油过程中逐渐发生膨胀与承载球囊10内壁开始贴合，致使进入承载球囊10内的清洗液5受到挤压向外侧排出，而清洗液5从透液孔9内排出时也带动着内部的杂质油脂向清洗箱1内流动，防止了透液孔9因杂质油脂造成堵塞的现象，与此同时形变球囊12膨胀后拉扯着连接绳17对内置球囊15造成形变，使得原本封闭的形变隔膜16因形变作用下打开，其内部的活性炭颗粒清理杆19对外界具有吸附净化效果，将形变球囊12由于吸附了杂质油脂产生的异味进行吸附净化，防止异味的产生造成细菌滋生。
41.请参阅图2、图6和图7，透液孔9内设有19，19与透液孔9内壁之间固定连接有两个相互对称的牵引绳20，19靠近清洗箱1的一端固定连接有半球橡胶块21，19远离清洗箱1的一端嵌设有形变封片22，19上下两端嵌设有膨胀气囊23，在形变球囊12吸油饱满膨胀至承载球囊10内壁时，形变球囊12无法在进行吸油吸附后，在形变球囊12膨胀时产生的气流和清洗液5向透液孔9内挤压，使19向清洗箱1内方向进行偏移，将透液孔9内壁含杂的杂质油脂清理出去，防止透液孔9内的堵塞，与此同时部分气流从形变封片22进入19内，在气压逐渐增多的情况下致使膨胀气囊23向透液孔9内壁发生膨胀，从而致使此时的透液孔9呈现封闭状态不再进行吸附效果，便于此时其他未吸收油脂杂质饱满的吸油装置6继续吸收，提高其吸附杂质油脂的效率。
42.请参阅图2，吸油装置6包括下漂浮外壳7和上漂浮外壳8，下漂浮外壳7与上漂浮外壳8螺纹连接，当形变球囊12吸附杂质油脂饱满后，通过取出吸油装置6，旋转上漂浮外壳8，将下漂浮外壳7和上漂浮外壳8拆分开，取出承载球囊10进行更换，便于下次清理人脐带组织内部的杂质油脂。
43.请参阅图7，形变封片22未受到压力作用时为闭合状态，受压力时为开合状态，形变封片22仿生于医学的心脏瓣膜原理，在未受到压力作用时，始终呈现闭合状态，内部呈现密闭空间，受到压力时，可向内外侧打开释放19内部的气体，而19因形变球囊12吸油膨胀的作用下产生的气流透过形变封片22进行其内部后，在时间的流逝下，其内部的气体对形变封片22挤压，气压也逐渐慢慢释放，而气压逐渐降低时，形变封片22受力也越来越小，气压
泄露的也越来越小，降低了膨胀气囊23受压力作用回复原位的速度，从而加强了膨胀气囊23对透液孔9封闭的时间。
44.请参阅图1，搅动棒4的旋转方式为无规则转动，通过设置搅动棒4为无规则转动，可以使搅动棒4顺时针、逆时针都可转动，而人脐带组织在内部清洗过程中能够更加的充分和干净，油脂杂质甩动出来被形变球囊12吸附的更快，提高其清洗效率。
45.请参阅图6，半球橡胶块21靠近清洗箱1的一端设置为椭圆状，且表面设有疏水层，通过将靠近清洗箱1一端的半球橡胶块21设置为椭圆状，可以使清洗液5向透液孔9内流动时，清洗液5触碰半球橡胶块21时在椭圆的流线型下，向承载球囊10方向流动的更加流畅，牵引绳20采用弹力绳材料制成，通过设置弹力绳材料制成的牵引绳20，可以使19在受到压力向清洗箱1侧进行移动时能够透出透液孔9，将杂质完全清理出去，防止堵塞的现象更好，同时因弹力的作用下，压力逐渐减小后逐渐慢慢复位，回复到透液孔9内，不易对人脐带组织清理造成阻挡。
46.请参阅图1，封闭盖板2的转轴内设有卡位装置，且表面涂设有防锈漆，通过在封闭盖板2内的转轴设置卡位装置，可以使封闭盖板2在转至清洗箱1上端完全闭合时进行限位，无法在发生旋转，使得清洗箱1封闭的更加严密，搅动棒4在搅动清洗液5时清洗液5不易渗透出来，而通过涂设防锈漆，可以使转轴能够长时间的使用不易因空气的湿气腐蚀导致上锈的现象，提高其使用寿命。
47.以上所述；仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此；任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内；根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。