一种有机溶剂响应型磁珠、制法及其应用

1.本发明涉及一种有机溶剂响应型磁珠，还涉及上述有机溶剂响应型磁珠的制备方法及其在核酸提取方面的应用。


背景技术：

2.磁性纳米颗粒作为材料学中重要的组成部分，近些年来，在生物医学领域受到广泛的应用。这是由于其与组成生命体的大多数生物大分子，如细胞、病毒、蛋白质、核酸等，粒径大小相近，结构相似，并且有着偶联容量大、比表面积大、扩散速度快、易于修饰、悬浮稳定性高、生物相容性好的优点。由于纳米磁颗粒受磁场影响时有着高饱和磁化强度及可实现智能化和自动化，因此被广泛应用于核酸、蛋白质、病原菌和细胞等物质的分离提取、负载、富集及靶向操纵等。
3.然而，目前对于大多数用于核酸提取的磁珠来说，提取率都在70～80％，并且需要3次左右的洗脱过程，这对普通的核酸检测，样本中核酸拷贝数目需要达到数百个才能通过荧光定量pcr或数字pcr检测出来，因此对低丰度样本无法实施有效检测。另外由于其需要洗脱的次数多，操作步骤繁琐、耗时长，容易造成核酸的损失，因此不能满足低丰度样本快速检测的需求。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明目的之一是提供一种能够对低丰度核酸样本浓度快速检测的有机溶剂响应型磁珠；本发明另一目的是提供上述有机溶剂响应型磁珠的制备方法及其在核酸提取方面的应用。
5.技术方案：本发明所述的有机溶剂响应型磁珠，包括四氧化三铁颗粒以及包裹在四氧化三铁颗粒外的表面活性剂分子，表面活性剂分子为链状分子，一端端部为羧基，另一端端部为氟烷基，表面活性剂分子的羧基端在远离四氧化三铁颗粒的一侧。表面活性剂的负载量为磁珠质量的50％。
6.上述有机溶剂响应型磁珠的制备方法，具体为：将10～150质量份含氟表面活性剂、10～120质量分别四氧化三铁颗粒、10～150质量份成膜树脂以及2～3质量份分散剂置于300质量份的水中加热，边加热边用磁力搅拌器高速搅拌，搅拌后再超声分散(搅拌后再超声分散的作用是：消毒的作用，去除污染杂质，同时去除反应多余的表面活性剂)；将得到的溶液磁分离，得到固体沉淀，干燥后得到有机溶剂响应型磁珠。
7.其中，所述搅拌时间为40～60min，搅拌速度为3000rpm，搅拌速度太快容易破坏原有的四氧化三铁颗粒，搅拌速度太慢达不到分散均匀的效果。
8.其中，所述加热温度为80～90℃，加热能够使表面活性剂在体系中分散更均匀。
9.其中，所述干燥温度为60℃。
10.其中，所述有机溶剂响应型磁珠为球状颗粒，粒径为400～600nm。
11.其中，所述含氟表面活性剂为阳离子型、阴离子型、非离子型或两性离子型表面活
性剂中的至少一种，含氟表面活性剂的端基为氟烷基。
12.其中，所述四氧化三铁颗粒采用如下方法制备而成：将10质量份有机铁盐加入到400质量份二元醇中搅拌均匀得到透明溶液；将60质量份不饱和脂肪酸加入到透明溶液中，搅匀得到混合溶液；将混合溶液置于反应釜中于160～190℃下反应10～12h，反应后将溶液磁分离，得到固体沉淀，固体清洗、烘干后得到四氧化三铁颗粒。
13.本发明磁珠能够用于核酸提取，包裹在四氧化三铁球状颗粒外的表面活性剂富含羧基，能够在酸性溶液中基于正负电结合机理提取核酸，在核酸脱附环节，先用乙醇和/或异丙醇处理磁珠，有机溶剂乙醇和/或异丙醇能够对表面活性剂分子中的氟烷基产生诱导作用(牵引作用)，使四氧化三铁颗粒外表面活性剂分子的端部基团翻转，使原先在远离磁珠端阻碍核酸脱附的羧基翻转，即羧基端从远离四氧化三铁颗粒的一侧翻转到靠近四氧化三铁颗粒的一侧，此时表面活性剂分子的氟烷基朝外定向排列，从而在正负电作用和羧基翻转的双重作用下实现本发明磁珠在核酸脱附时的高效完全脱附。
14.有益效果：(1)本发明磁珠克服了现有核酸提取磁珠由于表面羧基和核酸形成的离子桥的阻碍造成的脱附不完全及脱附效率较低的问题，把现有核酸提取磁珠的提取率提高了12.5％，把基于磁珠的核酸数字lamp检测法的检测限提高了20倍；(2)由于羧基翻转是可逆的，因此本发明磁珠可反复使用20～30次不影响其提取效果，并且对复杂环境(如血液，唾液等样本)的适应性好；(3)本发明磁珠可以很好的结合荧光定量pcr、数字pcr技术，与数字pcr技术结合时，对于低丰度的核酸样本，检测灵敏度提高了10倍以上，从而实现了对低丰度(小于100拷贝)核酸样本浓度的快速检测；(4)本发明磁珠具有良好的超顺磁性，在体内造影、靶向给药方面也具有很好的应用前景。
附图说明
15.图1为实施例1制得的有机溶剂响应型磁珠的sem图；
16.图2为有机溶剂响应型磁珠迅速聚集在磁铁附近的示意图；
17.图3为有机溶剂响应型磁珠和原始四氧化三铁颗粒的磁学性质测试结果图；
18.图4a为有机溶剂响应型磁珠初始状态的水滴静态接触角以及用乙醇和/或异丙醇处理后的水滴静态接触角；图4b为传统商业磁珠初始状态的水滴静态接触角以及用乙醇和/或异丙醇处理后的水滴静态接触角；图4c为核酸脱附过程时有机溶剂响应型磁珠的状态以及传统商业磁珠的状态；
19.图5为用超微量分核酸检测仪测定基于标液对应的吸光度建立标准曲线、通过标准曲线得到100μl样本中核酸浓度以及有机溶剂响应型磁珠对样本吸附后、脱附后样本核酸浓度变化示意图；
20.图6为用超微量分核酸检测仪测定基于标液对应的吸光度建立标准曲线、通过标准曲线得到100μl样本中核酸浓度以及传统商业磁珠对样本吸附后、脱附后样本核酸浓度变化示意图；
21.图7为不同吸附脱附条件下有机溶剂响应型磁珠的核酸提取率；
22.图8a-c为室温下，将低丰度rna核酸模板稀释成不同浓度的样本模板(5copies，10copies，25copies，35copies，45copies，55copies，100copies，200copies，300copies，400copies)，在最佳提取条件下，采用有机溶剂响应型磁珠进行提取并进行数字lamp检测
得到的检测结果图；图8d是有机溶剂响应型磁珠和传统商业磁珠的数字lamp检测对比图。
23.图9为实施例1制得的有机溶剂响应型磁珠在吸附、脱附核酸过程的机理图；
24.图10为实施例1制得的有机溶剂响应型磁珠和传统商业磁珠的红外光谱图；
25.图11a为传统商业磁珠的tem图及其元素分布图；图11b为实施例1制得的有机溶剂响应型磁珠在tem图及其元素分布图。
26.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
27.本发明有机溶剂响应型磁珠的制备方法，具体包括如下步骤：
28.(1)室温下，先进行四氧化三铁球状颗粒的制备：将10质量份有机铁盐加入到400质量份二元醇中搅拌均匀得到透明溶液；将60质量份不饱和脂肪酸加入到透明溶液中，搅拌均匀得到混合溶液；将得到的混合溶液转移到水热反应釜中，将反应釜升温至160℃并保持10h得到黑色混合溶液；将得到的黑色溶液经过磁分离，得到黑色固体沉淀，将黑色固体用乙醇清洗3次，然后在60℃烘箱内干燥，得到粒径为300～400nm的四氧化三铁磁性球状颗粒；
29.(2)将10质量份含氟表面活性剂、10质量份四氧化三铁球状颗粒、10质量份成膜树脂以及2质量份分散剂置于300质量份的水中加热，边加热边用磁力搅拌器以3000rpm高速搅拌40min，搅拌后再超声分散20min，得到黑色溶液，将得到的黑色溶液磁分离，得到黑色固体沉淀，将黑色固体在60℃烘箱内干燥，得到有机溶剂响应型磁珠。由图1可以看出，所得磁珠大小基本均一，磁珠粒径为500～600nm。跟现有的磁珠形状在sem图上无明显变化。
30.本发明磁珠在核酸提取方面的应用，具体的应用过程为：
31.步骤1，样本前处理及裂解：将新鲜或超低温保存的样本(≤100mg)液氮研磨至粉末状，尽量全部转移至ep管中，向ep管中加入1ml裂解液，涡旋振荡至无明显颗粒物，室温静置5min；
32.步骤2，核酸结合：向ep管中加入400μl核酸结合液(主要含氯化钠和二硫苏糖醇)，然后再加入30mg实施例1制得的有机溶剂响应型磁珠(如图9a所示),并且调节其ph为5，将磁珠悬浮液摇晃均匀，再置于3000rpm高速涡旋振荡11分钟，使从样本中裂解出的核酸和磁珠结合(如图9b所示)；
33.步骤3，磁性分离：将ep管置于磁力架上静置20s至磁珠吸附完全，如ep管内盖有磁珠残液，可保持ep管在磁力架上，整体上下颠倒2～3次使磁珠被吸附完全，吸弃上清液，避免接触磁珠；
34.步骤4，清洗：向ep管中加入600μl清洗液i(清洗液i主要成分为异丙醇)，用移液枪吹散磁珠，涡旋振荡2min，参照步骤3再次进行磁性分离；磁性分离后向ep管中加入600μl清洗液ii(清洗液ii主要成分为乙醇)，用移液枪吹散磁珠，涡旋振荡2min，参照步骤3再次进行磁性分离，磁性分离后再向ep管中加入600μl清洗液ii，用移液枪吹散磁珠，涡旋振荡2min，参照步骤3再次进行磁性分离；
35.步骤5，除醇：将弃尽上清液后的ep管保持于磁力架上，打开ep管盖室温晾干约8min至无明显乙醇味，在这个步骤，磁珠表面羧基会发生翻转(如图9c所示)，核酸与磁珠分离；
0.2)ng/μl(图6：右)，样本中核酸含量为23ng，得到磁珠对核酸的吸附率(410-23)/410＝94.4％，用洗脱液将磁珠上的核酸洗脱，洗脱2次，洗脱下来的核酸定容成100μl，用核酸检测仪测得浓度为3.2(3.4-0.2)ng/μl，洗脱液中核酸含量为320ng，脱附率为320/390＝82.0％。
42.室温条件下，参照磁珠核酸提取标准步骤及方法，在核酸和磁珠结合和脱附步骤，对加强核酸结合的溶液配方进行优化，对聚乙二醇和氯化钠浓度、磁珠添加含量和ph值等影响因素进行调整，在调整单一条件的同时，保证其他变量条件不变，分别计算在不同条件下有机溶剂响应型磁珠对核酸的提取率，最终确定有机溶剂响应型磁珠核酸提取的最佳条件是有机溶剂响应型磁珠加入样本的浓度为30毫克/毫升(图7a)，氯化钠的浓度50毫克/毫升(如图7b)，二硫苏糖醇浓度20毫克/毫升(图7d)，结合溶液的ph值5.5(图7c)，与核酸结合时间不小于11分钟(图7f)，脱附液ph为8.5(对于dna的脱附)，脱附液ph为8(对于rna的脱附)(图7e)。
43.室温下，将低丰度的rna核酸模板稀释成不同浓度的样本模板(5copies，10copies，25copies，35copies，45copies，55copies，100copies，200copies，300copies，400copies)，通过有机溶剂响应型磁珠进行核酸提取，在最佳提取条件下，经过有机溶剂响应型磁珠提取后，样本进行数字pcr检测，发现本发明有机溶剂响应型磁珠最低检测限可检测出的样本的核酸浓度为5copies/ml，荧光液滴有3个，对应的阴性阳性液滴统计图(图8a)，准确率较低，只有60％，当核酸浓度为25copies/ml时，荧光液滴有20个，对应的阴性阳性液滴统计图(图8b)，准确率达到80％，当核酸浓度35copies/ml时，荧光液滴有33个，对应的阴性阳性液滴统计图(如图8c)，准确率达到94％，通过图8d可知，模板核酸浓度在35copies/ml及以上时具有稳定的准确度，且准确度约95％。而对于传统的商业磁珠，样本核酸浓度低于55copies/ml，均测不出结果，当样本核酸浓度到达55copies/ml，才能得到结果，而且准确较低，只有50％，当样本核酸浓度到达500copies/ml时，才能到达理想准确率，为80％左右(如图8d)。